一种复方黄柏液透皮吸收制剂及其制备方法和应用与流程

本发明涉及医药技术领域，具体地说，涉及一种复方黄柏液透皮吸收制剂及其制备方法和应用。

背景技术：

复方黄柏液是中华人民共和国卫生部批准的国家级三类新药，国家八五规划开发项目，功能是清热解毒，消肿止痛、祛腐生肌，适用于溃疡溃破等皮肤疾病[姚俊，赵霞.复方黄柏液最新临床应用进展[j].中国新药杂志，2014,23(3):308-312]。复方黄柏液共由黄柏、连翘、金银花、蒲公英和蜈蚣五味中药组成，其中药物黄柏为君药。其为洗剂，用法是将纱布条浸泡于药液外敷于感染伤口内，或破溃的脓肿内，若溃疡较深，可用直径0.5～1.0cm的无菌胶管，插入溃疡深部，以注射器抽取本品进行冲洗[江滟，易旭.黄柏胶囊与抗生素的体外联合抗菌作用研究[j].现代中西医结合杂志，2014,23(3):309-310]。这种外用制剂可使药物避开肝脏首过效应及胃肠道破坏，中药有效成分可直接、快速地作用于创面，减少给药次数，还可在药物出现副反应时随时终止给药[吴巍，苗明三.常用中药外用制剂的特点及应用[j].中医学报，2011,26(152):108-110]。国内对其外用药效学和临床应用的研究已很深入，但对其经皮渗透的药物动力学行为并未见到报道。外用制剂透皮吸收是其主要的药效基础，因此对复方黄柏液的处方进行改进，通过添加不同的促透皮吸收剂来观察其透皮吸收的效果，从而论证处方改进的优劣性，有助于复方黄柏液的处方优化及质量控制。

药物的经皮吸收受药物的理化性质、经皮给药系统和皮肤的生理病理三方面因素的影响。药物的理化性质因素包括药物分子大小和形状、熔点、溶解度和分配系数、分子形式等；经皮给药系统因素包括剂型、给药系统的组成、中药复方成分等；皮肤的生理病理因素包括年龄和性别差异、部位差异、病理因素以及皮肤水合程度、皮肤温度等其他因素。

透皮吸收促进剂(penetrationenhancers，pe)是一种具有能暂时性的调节经皮通透性的物质。目前被采用的pe种类较多，主要分为以下几类：(1)水；(2)亚砜类；(3)吡咯烷酮类；(4)脂肪酸类和醇类；(5)氮酮类及其衍生物；(6)表面活性剂(包括阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和非离子表面活性剂)；(7)尿素及其衍生物；(8)挥发油及萜类；(9)混合物pe。

中国期刊《中国医院药学杂志》2013年第21期刊出的论文“促渗剂对消喘巴布剂中白芥子体外透皮吸收特性的影响”，探讨了不同的透皮促渗剂对消喘巴布剂中白芥子体外透皮吸收特性的影响，结果：芥子碱硫氰酸盐体外透皮吸收符合零级动力学方程，不同的促渗剂对芥子碱透皮吸收影响的顺序为：月桂氮革酮>丙二醇>薄荷脑，同种促渗剂的不同浓度对消喘巴布剂透皮吸收影响的顺序为：月桂氮革酮1％>3％>5％；丙二醇5％>7％>3％；薄荷脑1％>3％>2％，结论：不同的透皮促渗剂都能促进消喘巴布剂中芥子碱的透皮吸收，但是不同的浓度促渗效果却不同，其中以1％月桂氮革酮促渗效果最好。

中国期刊《湖北中医药大学学报》2011年05期刊出的论文“几种促渗剂对布洛芬巴布剂体外透皮性的影响”，研究了几种促渗剂对布洛芬巴布剂透皮作用的影响。结果：不同促渗剂对5％布洛芬巴布剂的累积渗透量q及渗透速率k的影响大小为：氮酮、丙二醇、薄荷脑、冰片，但只有氮酮和丙二醇表现出显著性(p<0.05)，冰片和薄荷脑对布洛芬巴布剂透皮作用基本无影响，2％氮酮和5％丙二醇对其影响最大。结论：提示2％氮酮和5％丙二醇可作为促渗剂在布洛芬巴布剂中使用。

中国期刊《福建中医药》2011年03期刊出的论文“薄荷脑、冰片及合用对青藤碱体外透皮吸收的影响”，用valia-chien双室扩散池研究青藤碱的透皮速率以及薄荷脑、冰片、薄荷脑与冰片合用等透皮促进剂对青藤碱微乳吸收的影响。结果：青藤碱溶液分别加3％薄荷脑、3％冰片、薄荷脑与冰片合用后透皮速率分别为(63.42±3.28)、(51.46±2.12)、(97.41±10.32)μg/(cm²/h)，促渗作用由强到弱依次为3％薄荷脑加3％冰片、3％冰片、3％薄荷脑，与对照组相比，渗透速率分别提高了3.23倍、2.10倍、1.71倍。结论：薄荷脑、冰片及其合用对青藤碱体外透皮吸收都有促进作用，其中两者合用最强。

然而，目前还未见对复方黄柏液的体外透皮行为的研究。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种透皮吸收效果更好的复方黄柏液透皮吸收制剂及其制备方法和应用。

本发明第一方面提供了一种复方黄柏液透皮吸收制剂，其包含复方黄柏液、冰片和薄荷脑。

作为一个优选例，所述的复方黄柏液透皮吸收制剂为洗剂、喷雾剂、膏剂或凝胶剂。

较优地，所述的复方黄柏液透皮吸收制剂为洗剂，所述的冰片质量浓度为0.2％-1.2％，所述的薄荷脑质量浓度为0.2％-1.2％。

更优地，所述的复方黄柏液透皮吸收制剂的制备方法包括以下步骤：取冰片和薄荷脑混合后充分研磨，融化后加入吐温80再研磨，边搅拌边加入复方黄柏液。更优地，所述的吐温80的体积与加入复方黄柏液后制剂总体积的比例为：(2-6):100。

本发明的另一方面提供了如上所述的复方黄柏液透皮吸收制剂的制备方法，包括以下步骤：取冰片和薄荷脑混合后充分研磨，融化后加入吐温80再研磨，边搅拌边加入复方黄柏液。

作为一个优选例，所述的吐温80的体积与加入复方黄柏液后制剂总体积的比例为：(2-6):100。

本发明的再一方面提供了如上任一所述的复方黄柏液透皮吸收制剂在制备防感染药物中的应用。

本文中，所述的复方黄柏液由黄柏、连翘、金银花、蒲公英和蜈蚣五味中药组成，其中药物黄柏为君药，盐酸小檗碱为其主要药效成分。其组方可以为：连翘80g、黄柏40g、金银花40g、蒲公英40g、蜈蚣2.4g，常规方法煎煮制备成1000ml。基于本发明，本领域技术人员可以知晓，冰片和薄荷脑合用可以有效促进盐酸小檗碱的透皮吸收，因此，本发明所述的复方黄柏液并不限于上述五味中药组成的特定洗剂，其还包含对复方黄柏液进行原料药的替换、减少或增加后获得的组方，只要其仍然含有盐酸小檗碱成分。所述的薄荷脑分子式c10h20o，英文名为menthol，为无色针状或棱柱状白色结晶。所述的冰片分子式c10h18o，英文名borneol，为白色、半透明结晶。

本发明优点在于：

本研究以黄柏的有效成分盐酸小檗碱的累积渗透量、透皮速率常数为指标，首次对复方黄柏液的体外透皮行为开展了比较研究。在研究过程中发明人克服了指标选择、分析色谱条件和透皮吸收接受液的摸索等种种困难，最终测试了多种促透皮吸收剂对复方黄柏液的促渗透作用，结果表明加入复合冰片和薄荷脑后冰片和薄荷脑产生了协同作用(与对照组相比，1％冰片、1％薄荷脑、复合0.5％冰片和0.5％薄荷脑使复方黄柏液中小檗碱的渗透速率分别提高了0.36倍、0.29倍、0.74倍)，其透皮吸收率明显提高。此外，冰片本身具有抗炎镇痛、抗细菌和抗真菌的药理作用，因此在复方黄柏液中加入冰片、薄荷脑后，不仅能增加该制剂的有效成分的透皮吸收，而且将提高其临床清热解毒，消肿祛腐的功效。本发明为复方黄柏液的处方优化、质量控制提供了依据。

附图说明

图1-4.专属性色谱图谱。图1.盐酸小檗碱阳性对照液色谱图；图2.供试品溶液色谱图；图3.复方黄柏液供试品溶液色谱图；图4.阴性对照液色谱图。

图5.盐酸小檗碱的线性关系图。

图6.四种接受液盐酸小檗碱累积透过量。

图7.三种改进处方制剂盐酸小檗碱累积透过量。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

1.仪器与材料

1.1仪器

高效液相色谱仪(岛津lc-10at，spd-10avp紫外可见光谱检测器)；药物透皮扩散实验仪(长海医院)；扩散池(上海玉妍科学仪器有限公司)；十万分之一电子分析天平(mettlertoledoxp105dr)；1ml移液枪(江苏盛奥华环保科技有限公司)；亲水ptfe针式过滤器(孔径0.45μm)(上海安谱科学仪器有限公司)；ph2型酸度计(上海天达仪器有限公司)。

1.2试剂和材料

复方黄柏液(山东汉方制药，批号131212)；盐酸小檗碱标准品(86.7％，中国食品药品检定研究院，110713-201212)；磷酸二氢钾(江苏永华精细化学品有限公司，批号130608)；庚烷磺酸钠(上海安谱实验科技股份有限公司，批号140418)；三乙胺(南京威尔化工有限公司，批号130115)；甲醇(色谱纯，美国天地有限公司)；乙腈(色谱纯，美国天地有限公司)；超纯水；氯化钠(江苏永华精细化学品有限公司，批号141015)；无水乙醇(常熟市杨园化工有限公司，批号20140425)；聚乙二醇-400(南京威尔化工有限公司，批号20140425)。

雄性sd大鼠，体重(200±20)g，由第二军医大学动物饲养中心提供。

2.方法与结果

2.1盐酸小檗碱测定方法的建立

2.1.1色谱条件

色谱柱：diamonsilc18(5μm，4.6mm*250mm)，流动相：乙腈-磷酸盐缓冲液[0.05mol/l磷酸二氢钾溶液和0.05mol/l庚烷磺酸钠溶液(1:1)含0.2％的三乙胺，并用磷酸调节ph至3.0](40:60)，检测波长265nm，流速1.0ml/min，柱温：30℃，进样量：20μl。

2.1.2对照品溶液的制备

精密称取盐酸小檗碱对照品适量，加入甲醇溶解，即得。

2.1.3供试品溶液的制备

按复方黄柏液制备工艺制得供样品溶液。

2.1.4复方黄柏液供试品的制备

精密量取复方黄柏液3ml置10ml量瓶中，加甲醇5ml，置60℃水浴锅中保温15min，取出，超声处理(功率500w，频率40khz)30min，加甲醇稀释至刻度线，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.5阴性对照溶液的制备

按复方黄柏液的处方比例和生产工艺按照“2.2”项下的操作制备不含黄柏的阴性对照溶液，然后将阴性溶液置于扩散池。

2.1.6专属性实验

分别取对照品溶液、供试品溶液、复方黄柏液供试品溶液、阴性对照品溶液，按照“2.1.1”色谱条件检测，得到相应图谱(见图1-4)，在阴性对照图谱中，在盐酸小檗碱相应的出峰时间里无峰出现，说明该方法专属性较好。

2.1.7标准曲线的建立

精密称定盐酸小檗碱1.38mg置于50ml容量瓶中，加入40ml甲醇，加热溶解，自然冷却，再加甲醇定容至50ml，得到浓度为23.8μg/ml的母液1，再从母液1中取出2.5ml置于20ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，得到浓度为2.975μg/ml的母液2，用移液枪精密量取母液21.25ml置于20ml容量瓶，再分别量取1.25ml、2.5ml、5ml置于10ml容量瓶，用甲醇定容得到浓度为0.18595μg/ml、0.3719μg/ml、0.7438μg/ml、1.4875μg/ml的对照品溶液，再从母液1中精密量取2.5ml、5ml分别置于10ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到浓度为5.95μg/ml、11.9μg/ml的对照品溶液。分别按“2.1.1”中的色谱条件进行进样，以盐酸小檗碱浓度x(mg/ml)对吸收峰面积y回归，得回归方程y＝121135x-10758，r²＝0.9998，结果表明盐酸小檗碱进样量在0.00372-0.0238μg范围内呈良好的线性关系。见图5。

2.1.8精密度实验

取浓度为1.4875μg/ml的对照品溶液20μl，重复进样5次，测定结果的rsd＝0.47％，表明仪器的精密度良好。结果见表1。

表1精密度实验结果(n＝5)

2.1.9稳定性试验

按“2.3.1”项下操作，取生理盐水为接受液时24h的供试液，按“2.1.1”中的色谱条件于0、2、4、6、8、12、24h进行进样，测定结果的rsd＝1.35％，表明供试品在24h内稳定性良好。结果见表2。

表2稳定性实验结果(n＝7)

2.1.10加样回收实验

按“2.3.1”项下操作，取生理盐水24h的接受液，精密量取一定体积的样品液9份，分别精密加入相当于供试品中盐酸小檗碱含量80％、100％、120％的标准品。依法测定，计算加样回收率。平均回收率为x＝107.82％，rsd＝1.95％。结果见表3。

表3加样回收实验结果(n＝9)

2.2样品的制备

①单加冰片改进处方：取1g冰片加入4ml吐温80进行研磨，边搅拌边加入复方黄柏液至100ml，即得。

②单加薄荷脑改进处方：取1g薄荷脑加入4ml吐温80进行研磨，边搅拌边加入复方黄柏液至100ml，即得。

③复合添加改进处方：取0.5g冰片和0.5g薄荷脑混合后充分研磨，融化后加入4ml吐温80再研磨，边搅拌边加入复方黄柏液至100ml，即得。

2.3透皮吸收试验的研究

2.3.1透皮吸收实验

实验前24小时，将sd大鼠的腹部绒毛用脱毛膏脱除干净，然后将大鼠颈椎脱臼处死，小心迅速剥皮，将取下的腹部皮肤平铺于干净的玻璃板上，角质层朝下。用刀片小心剔除皮下的脂肪组织及粘连物，用生理盐水反复冲洗干净，置于生理盐水中，低温冰箱中保存备用，每次实验前目视检查皮肤的完整性，不能有任何破损。

在透皮扩散试验仪上，采用水平扩散池[程力惠，卢丽霞.复方黄柏液的质量标准研究[j].亚热带植物科学，2012,28(9):524-526]，该扩散池由两只筒状玻璃管对合而成，夹于其中的鼠皮将其分为两室，分别为扩散池和接受池，在扩散池和接受池中分别放入磁力搅拌子以维持接收池的动态环境，在接受池的右边连一取样管，供进样、取样及排除气泡用，接受池的体积为5ml，扩散面积为2.8cm²，从冰箱中取出离体鼠皮，以生理盐水洗净，用滤纸吸干表面水分，将处理好的鼠皮固定于扩散池和接受池之间，角质层朝向扩散池，然后向扩散池中加入复方黄柏液5ml，各接受池中分别加入接受液5ml，水域恒温至32℃，恒速搅拌(200r/min)。分别于实验开始后2h、4h、8h、12h、24h从样品接受池中取出1ml接受液，同时各补加同体积的32℃预热的试液，排除气泡。将取出的样品液经0.45μm的微孔滤膜过滤后，进行含量测定。所测样品峰面积根据当日标准曲线计算浓度，然后按下式计算单位面积累积透过量：

式中，cn为第n个取样点测得的药物质量浓度(μg·ml^-1)，ci为第i个取样点测得的药物质量浓度(μg·ml^-1)，vi为取样体积，a为扩散池有效渗透面积(cm²)，v为扩散池容积(ml)，以时间t为横坐标，单位面积累积渗透量q为纵坐标，绘制经皮渗透曲线。以q对t进行回归得线性方程，直线部分斜率即为稳态透皮速率常数j(μg·cm^-2·h^-2)。

2.3.2透皮吸收不同接受液的选择

将生理盐水、20％乙醇生理盐水、40％乙醇生理盐水、20％聚乙二醇-400(peg-400)溶液作为接受液分别按上述有关操作方法进行透皮吸收实验。结果见表4和图6。通过实验观察，本研究选择生理盐水作为接受液。

表4四种接受液盐酸小檗碱累积透过量

2.3.3改进处方后制剂的透皮吸收实验

将2.2中进行处方改进后的制剂分别按上述有关操作方法进行透皮吸收实验。结果见表5和图7。

表5三种改进处方制剂盐酸小檗碱累积透过量

实施例2

我们在研究过程中同时使用了其他几种促透皮吸收剂，现以其中之一示例如下。

按照与实施例1相同的有关操作方法制备以下样品，测试对于复方黄柏液的透皮吸收效果的影响：

①单加樟脑改进处方：取1g樟脑加入4ml吐温80进行研磨，边搅拌边加入复方黄柏液至100ml，即得。

②冰片和樟脑复合添加改进处方：取0.5g冰片和0.5g樟脑混合后充分研磨，融化后加入4ml吐温80再研磨，边搅拌边加入复方黄柏液至100ml，即得。

以上两种改进后的制剂透皮吸收实验结果见表6。

表6两种改进处方制剂盐酸小檗碱累积透过量

实施例3

我们在研究过程中同时考察了不同浓度冰片和薄荷脑对于复方黄柏液的透皮吸收效果的影响，该实验的有关操作方法同实施例1。结果见表7。

表7冰片/薄荷脑不同浓度下的改进处方制剂盐酸小檗碱累积透过量

在本发明的研究中，发明人不断地克服了很多困难。中药外用复方制剂在进行经皮实验时，测定指标往往不易选择。既由于中药复方制剂的复杂性，也常因为透过量少而不易测出。因黄柏为本方制剂主药，其中所含小檗碱药理作用明确且与本方功能相符[侯巍，于海，焦淑清，于莲.两种扩散池在透皮实验中的应用[j].黑龙江医药科学，2002,25(5):66]，所以，本发明采用hplc法测定其经皮渗透量，作为衡量经皮渗透效果的指标，具有良好的代表性。2010版中国药典中对于黄柏药材中盐酸小檗碱的测定条件是向流动相中加入十二烷基磺酸钠，进标准品后发现峰型杂乱，推测可能是十二烷基磺酸钠损毁色谱柱，故用庚烷磺酸钠代替十二烷基磺酸钠。按照药典，磷酸盐缓冲液:乙腈(50:50)，在测定盐酸小檗碱标准品时，在5分钟出峰较好，然而在测定复方黄柏液时，分离度不好，要使分离度达标就需要减低乙腈比例，延长出峰时间[程力惠，卢丽霞.复方黄柏液的质量标准研究[j].亚热带植物科学，2012,28(9):524-526]，于是调整流动相的比例，改为(55:45)测得的分离度仍然不理想，之后又调整比例为(65:45)此时出峰时间较晚，15分钟左右才出峰且峰拖尾比较严重，乙腈比例过低，会造成峰形拖尾及出峰时间过长[潘军.rp-hplc法同时测定复方黄柏液中盐酸小檗碱、绿原酸和连翘苷的含量[j].齐鲁药事，2009,28(9):524-526]，经过大量实验，当磷酸盐缓冲液-乙腈比例为60:40时，其分离度较好，出峰时间8分钟左右，为了改善峰型，减弱其拖尾程度，加入0.2％的三乙胺，此时的峰型较好，且在出峰部分无阴性干扰，适合测得透皮吸收后盐酸小檗碱的含量。

选择适合的透皮吸收接受液是开展药物的体外经皮渗透试验的重要基础。接受液应具有接受通过离体皮肤的药物的能力，一般应考虑药物在其中的溶解度。常用的接受液如生理盐水、磷酸盐缓冲液可满足水溶性药物的体外透皮试验要求，但对于在水中溶解度较小的药物，上述接受液难以达到漏槽条件而需加入一定添加剂以增加药物溶解度，常用的是不同浓度乙醇。盐酸小檗碱在水中溶解度小，常使用低浓度乙醇作为接受液。但经过多次大量实验研究，发现加入乙醇、peg-400的生理盐水透过量反而没有生理盐水高，与其他制剂实验的结果不一致[刘俊红，王红孙，曲鹏飞，等.金黄膏中小檗碱体外透皮吸收研究[j].中成药，2014，36(l)：65-69]。其原因可能是中药复方中其他药物的成分对其透皮吸收有干扰作用，也可能是由于我们实验的药物是液体制剂的水溶液，长时间覆盖于皮肤上，增加了皮肤角质层的含水量，从而有利于角质层细胞的膨胀而增加药物的透过。而乙醇虽能增加盐酸小檗碱的溶解度但同时会改变皮肤结构，其由下向上扩散到皮肤表层，反而增加了大鼠皮肤角质层结构的致密性，从而对药物体外透皮实验的测定产生一定影响。根据结果，我们最终选择生理盐水溶液为接受液。

复方黄柏液是外用液体制剂，由连翘、黄柏、金银花、蒲公英、蜈蚣五味中药组成，临床应用于疮疡溃后、伤口感染较为广泛。但该制剂处方缺乏外用制剂普遍存在的透皮吸收辅料，为此我们选用冰片、薄荷脑、樟脑、桉树脑等进行处方设计，通过透皮吸收实验可以看得出，单加冰片、薄荷脑、樟脑均可增加小檗碱的透皮吸收率；而加入复合冰片和薄荷脑后其透皮吸收率明显提高，并超过二者单加者，与对照组相比，1％冰片、1％薄荷脑、复合0.5％冰片和0.5％薄荷脑使复方黄柏液中小檗碱的渗透速率分别提高了0.36倍、0.29倍、0.74倍，可见冰片和薄荷脑同时作为复方黄柏液的促渗剂，产生了协同作用，效果显著增强；与对照组相比，1％冰片、1％樟脑、复合0.5％冰片和0.5％樟脑使复方黄柏液中小檗碱的渗透速率分别提高了0.36倍、0.16倍、0.28倍；比较结果可以得出冰片和薄荷脑同时使用效果最优；进一步研究发现冰片和樟脑在0.2％-1.2％的浓度范围内作用均较好。此外，冰片本身具有抗炎镇痛、抗细菌和抗真菌的药理作用，因此我们认为本发明对复方黄柏液的处方改进，不仅能增加该制剂的有效成分的透皮吸收，而且将提高其临床的清热解毒，消肿祛腐功效。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。