本发明属于生物制品领域，具体涉及鸡传染性法氏囊病灭活疫苗及其制备方法。
背景技术：
鸡传染性法氏囊病(infectiousbursaldiseaseibd)是由传染性法氏囊病病毒的(ibdv)引起的一种危害幼鸡的急性、高度接触性传染病。鸡传染性法氏囊病是严重威胁我国养鸡业的重要传染病之一，其一方面死亡率高、淘汰率高，另一方面容易导致免疫抑制，使多种有效疫苗对鸡的免疫应答水平下降，造成免疫失败，使鸡对病原易感性增加，造成巨大的经济损失。
目前，国内用于防治鸡传染性法氏囊病的疫苗主要分为活疫苗和灭活疫苗。活疫苗毒力强，但容易造成鸡自身法氏囊的严重损伤，现在一般不用或谨慎使用。灭活疫苗是将病变组织或培养病毒液经过灭活后制成的，经灭活疫苗免疫后的种母鸡，其后代雏鸡一般具有较高的母源抗体，并且免疫持续时间较长，但灭活疫苗仅适用于种鸡，且免疫效果不明显。
目前多是通过加入免疫增强剂来解决灭活疫苗免疫效果不明显的问题。免疫增强剂增强疫苗的免疫效果已获得肯定，然而目前广泛使用的油乳类、铝胶类等化学佐剂常有副作用大、残留时间长、机体吸收缓慢等弊端。随着人们对绿色畜产品的迫切需求，研制开发来源广泛、效果显著、毒副作用小的新型免疫增强剂越来越受到人们的重视。而经研究发现，多数中药成分能提高血清抗体效价、促进淋巴细胞转化，因此，使用复方中药成分作为免疫增强剂成为可能。
如中国专利申请cn105435219a公开了一种鸡传染性法氏囊病复合灭活疫苗的制备方法，包括以下工艺步骤：1)病毒增殖；2)鸡传染性法氏囊病复合灭活疫苗制备，在每1000ml灭活检验合格的鸡传染性法氏囊病病毒抗原液中加入1～2份免疫增强剂混合均匀，然后与桑米特家畜水包油包水佐剂按体积比3:2进行乳化分装制成鸡传染性法氏囊病复合灭活疫苗。该发明涉及一种免疫增强剂，含有中药黄酮、维生素组合和法氏囊素，所述中药黄酮由菊花、生地、蔓荆子、龙胆草、黄芩、土茯苓和玄参组成。该免疫增强剂，大幅度提高了机体的免疫力，提高灭活疫苗细胞免疫能力，刺激机体产生高效的中和抗体，提高了机体预防疾病的能力。
裂褶菌多糖(spg)是从裂褶菌菌子实体、菌丝体以及发酵液中提取出来的水溶性多糖，结构为β-(1-3)糖苷为主链，具有β-(1-6)糖苷位侧链的β-d-葡聚糖；美人蕉花为美人蕉科多年生草本植物美人蕉的花；吲哚美辛为非淄体抗炎药，目前还未见将三者联用用于免疫增强的报道。
技术实现要素：
本发明旨在提供一种鸡传染性法氏囊病灭活疫苗及其制备方法，该疫苗其中含有的裂褶菌多糖、美人蕉花提取液和吲哚美辛具有协同增效的作用，能显著提高疫苗的免疫水平，提高抗体水平，且其效力稳定，安全性高，生产工艺简单，易操作。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：鸡传染性法氏囊病灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
a)lmh细胞的传代与培养：取lmh传代细胞系经edta-胰酶细胞分散液消化传代，在培养瓶中以细胞生长液继续培养，形成良好单层时，用于传代或接种病毒；
b)病毒接种：取鸡传染性法氏囊病毒b87株，按终体积1:50～1:500接种于上述制好的lmh传代细胞中，并在36～37℃吸附30～60min后吸去病毒液，加入维持液，置于37～38℃、含5％co2的环境下继续培养至细胞病变率达75％以上时收获细胞液；
c)制苗毒液的繁殖：取步骤a)中已形成良好单层的细胞系培养瓶，弃去细胞生长液，接种含有1％法氏囊细胞适应毒b87株的维持液，于37～38℃继续继续培养，当细胞病变达75％以上时收获毒液，于-15℃以下保存；
d)成品的制备：将步骤c)制备得到的毒液进行无菌检验、病毒含量测定，采用0.1％福尔马林灭活，在每1000ml灭活检验合格的鸡传染性法氏囊病病毒抗原液中加入0.5～2份免疫增强剂，混合均匀；按96:4的重量比加入灭菌后的吐温-80，搅拌使之溶解后，加入白油90～100份、硬脂酸铝1～3份、span-804份，搅拌，高压灭菌，乳化，分装，即得。
进一步地，所述免疫增强剂为每1000ml中含有裂褶菌多糖10～20g、新鲜美人蕉花提取液2～8g、吲哚美辛0.5～2g、莎梵婷0.5～2g、蔗糖20～40g和明胶4～6g的磷酸缓冲液。
进一步地，所述免疫增强剂为每1000ml中含有裂褶菌多糖12～18g、新鲜美人蕉花提取液3～6g、吲哚美辛1～2g、莎梵婷0.5～1.5g、蔗糖25～40g和明胶4～6g的磷酸缓冲液。
进一步地，所述免疫增强剂为每1000ml中含有裂褶菌多糖15g、新鲜美人蕉花提取液5g、吲哚美辛1.5g、莎梵婷1g、蔗糖32g和明胶5g的磷酸缓冲液。
进一步地，所述新鲜美人蕉花提取液由以下步骤制得：
取美人蕉花或花蕾，取其花瓣，磨碎，加入蒸馏水，置三角瓶中，密封，90～100℃恒温水浴20～35min，迅速冷却，常温离心5～10min，取上清液，即得。
进一步地，所述细胞生长液为含有5～10％胎牛血清的90％dmen培养液。
进一步地，所述维持液为含5～10％新生牛胎牛血清、2％谷氨酰胺的98％dmen培养液。
本发明另一目的在于提供一种如上所述的方法制备得到的疫苗。
本发明提供的免疫增强剂，其含有裂褶菌多糖、新鲜美人蕉花提取液、吲哚美辛、莎梵婷、蔗糖和明胶。其中，裂褶菌多糖、新鲜美人蕉花提取液和吲哚美辛作为主要的免疫增强活性成分，三者组合使用具有协同增效的作用。
然而裂褶菌多糖、新鲜美人蕉花提取液含有的生物碱成分在疫苗低温保存过程中极易析出，从而影响了疫苗的效力。为了克服生物碱在低温易析出导致疫苗效力不稳定的缺陷，发明人经过不懈的研究，终于发现一种特别适用于本发明体系的表面活性剂-莎梵婷。莎梵婷是一种新型的环脂肽类生物表面活性剂，分子式为c53h93n7o13，其能提高生物碱在低温的稳定性，提高疫苗的效力稳定性，而且与其他表面活性剂相比，莎梵婷不容易引起组织反应性，且其易于降解。
需要指出的是，一些中药成分虽然对免疫具有增强作用，然而它们与活疫苗直接混合后极其有可能对病毒活性造成影响，因此目前的免疫增强剂大多不适用于制备活疫苗。而本发明涉及的免疫增强剂同样能适用于活疫苗的制备。
综上所述，本发明提供的免疫增强剂效力稳定，能显著提高疫苗的免疫水平，提高抗体水平同时可以应用于灭活疫苗和活疫苗的制备。
本发明具有以下优点：
1)本发明制备的鸡传染性法氏囊灭活疫苗，可用于种鸡免疫，免疫水平高，效力稳定，保护率高。
2)本发明提供的免疫增强剂包含中药有效成分和其他成分，可以大幅度提高疫苗的免疫效果，同时对抗体的稳定性不会产生影响，易于降解，可以适用于灭活疫苗和活疫苗的制备。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。
实施例1、新鲜美人蕉花提取液的制备
取美人蕉花或花蕾，取其花瓣，磨碎，加入蒸馏水，置三角瓶中，密封，95℃恒温水浴30min，迅速冷却，常温离心10min，取上清液，即得。
本发明实施例2～4和对比例1～3免疫增强剂配方及用量
实施例5本发明鸡传染性法氏囊病灭活疫苗的制备
包括以下步骤：
a)lmh细胞的传代与培养：取lmh传代细胞系经edta-胰酶细胞分散液消化传代，在培养瓶中以细胞生长液继续培养，形成良好单层时，用于传代或接种病毒；
b)病毒接种：取鸡传染性法氏囊病毒b87株，按终体积50：500接种于上述制好的lmh传代细胞中，并在37℃吸附45min后吸去病毒液，加入维持液，置于37℃、含5％co2的环境下继续培养至细胞病变率达75％以上时收获细胞液；
c)制苗毒液的繁殖：取步骤a)中已形成良好单层的细胞系培养瓶，弃去细胞生长液，接种含有1％法氏囊细胞适应毒b87株的维持液，于37℃继续继续培养，当细胞病变达75％以上时收获毒液，于-15℃以下保存；
d)病毒含量测定：将步骤c)制备得到的毒液进行无菌检验后，用dmen做10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10-7和10-85个稀释度接种48孔铺满单层lmh细胞培养板，每个稀释度重复5孔，同时设立阴性对照细胞；每孔0.2ml，5％co2、37℃培养120h，观察细胞病变(cpe)，计算tcid50，每0.1ml病毒含量108.0tcid50，可用于制苗；
e)成品的制备：采用0.1％福尔马林灭活，在每1000ml灭活检验合格的鸡传染性法氏囊病病毒抗原液中加入1.5份实施例2或3或4或对比例1或对比例2或对比例3所述的免疫增强剂，混合均匀；按96:4的重量比加入灭菌后的吐温-80，搅拌使之溶解后，加入白油94份、硬脂酸铝2份、span-804份，边搅拌边升温，直至硬脂酸铝充分溶解至透明为止，高压灭菌，利用ika乳化机进行乳化5min，按250ml/瓶分装，即得到6组疫苗，分别标记为实施例2组、实施例3组、实施例4组、对比例1组、对比例2组和对比例3组。
试验一、成品检验
取实施例5制备得到的实施例2～4组疫苗，按照《中国兽药典》附录进行检测，检测结果如表1所示。
表1成品检测结果
试验二、免疫原性试验
取4日龄清远麻黄鸡75只，分成5组，分别为实施例2～4组、对比例1组和对照组，每组15只，分别按0.5ml/只进行肌肉注射疫苗进行免疫，对照组不作处理。于免疫后第21日，用鸡传染性法氏囊细胞液(约含106.5/0.1ml)对上述5组麻黄鸡进行攻毒，每只肌肉注射1.0ml。观察7天，每天详细记录免疫鸡和对照鸡的发病情况，统计免疫后第21日的攻毒保护率并采用微量滴定法测定免疫后血清中和抗体的效价，统计结果如表2所示。
表2免疫原性试验结果
结论：攻毒结果显示:对照组鸡攻毒21天内全部发病，死亡15只；实施例2～4组鸡攻毒21天后无死亡，中和抗体效价最高达到1：7054.0，攻毒后全部保护，攻毒7日后对免疫鸡只进行剖检，未出现由鸡传染性法氏囊引起的一些病理变化。对比例1组攻毒后21天内，死亡4只，对死亡鸡及发病鸡(攻毒后21天进行剖检)剖检，发现病鸡均出现典型的法氏囊肿大、出血症状。这表明，本发明提供的免疫增强剂对鸡传染性法氏囊疫苗的免疫增强效果明显优于普通免疫增强剂。
试验三、不同免疫增强剂组成对疫苗免疫原性的影响
取4日龄清远麻黄鸡90只，分成6组，除免疫活性成分不同外，设置不同组合免疫增强剂，标记为a组(裂褶菌多糖+新鲜美人蕉花提取液)、b组(裂褶菌多糖)、c组(新鲜美人蕉花提取液)、d组(吲哚美辛)、e组(裂褶菌多糖+吲哚美辛)和f组(新鲜美人蕉花提取液+吲哚美辛)，每组15只，分别按0.5ml/只进行肌肉注射疫苗进行免疫，对照组不作处理。于免疫后第21日，用鸡传染性法氏囊细胞液(约含106.5/0.1ml)对上述5组麻黄鸡进行攻毒，每只肌肉注射1.0ml。观察7天，每天详细记录免疫鸡和对照鸡的发病情况，统计免疫后第21日的攻毒保护率，并采用微量滴定法测定免疫后第21日后血清中和抗体的效价，统计结果如表3所示。
表3不同中药组成对疫苗免疫原性的影响
结论：裂褶菌多糖单独作为免疫增强剂活性成分添加到疫苗中，攻毒后21天，死亡率达到53.3％；新鲜美人蕉花提取液单独作为免疫增强剂活性成分添加到疫苗中，攻毒后21天，死亡率达到66.7％；吲哚美辛单独作为免疫增强剂活性成分添加到疫苗中，攻毒后21天，死亡率达到73.3％.然而当三者组合后，死亡率为0％，免疫第21天后，血清中和抗体效价达到1：1035.0，并且与其余各组具有显著性差异，这说明，三者组合使用具有协同增效的作用。
试验四、效力稳定性试验
取实施例5制备得到的实施例2组、对比例1～3组疫苗样品，分别放置在-33℃和37℃下放置6个月，每隔一月观察，按《中国生物制品规程》中的效力检定部分进行效力的测定，测定结果如表4～5所示。
表4在-33℃存放的疫苗的效价
表5在37℃存放的疫苗的效价
由表4和表5可知，本发明实施例2得到的鸡传染性法氏囊并灭活疫苗效力稳定，其在-33℃和37℃下放置6个月后，效价有所降低，但幅度不大；对比例1～3所述疫苗在相同条件下保存相同时间后，其效价有明显下降，并且差异极显著，这说明，本发明实施例2所述疫苗较对比例1～3所述疫苗稳定。