专利名称：检测h5亚型禽流感病毒抗体、新城疫病毒抗体和鸡法氏囊病毒抗体的胶体金测试试纸条的制作方法
技术领域：
本实用新型属于禽类免疫效果检测技术领域，具体涉及一种能同时对H5亚型禽流感病毒抗体、新城疫病毒抗体和鸡法氏囊病毒抗体进行检测的胶体金三联检测试纸条，可用于禽类免疫效果的检测和流行病的调查。
背景技术：
禽流感、新城疫和鸡传染性法氏囊病都是流行于禽类中的烈性传染病，严重威胁 养禽业的正常发展，养殖场的禽类一旦感染这些病毒，将会导致禽肉类市场供求关系混乱、禽产品出口受阻、政府财政负担加重和公众恐慌。因此，使用禽流感、新城疫和鸡传染性法氏囊病的疫苗进行免疫注射，并对免疫效果进行检测以确定其是否产生相应的抗体保护具有非常重大的意义。快速检测H5亚型禽流感病毒抗体、新城疫病毒抗体和鸡法氏囊病毒抗体的胶体金测试试纸条是以胶体金作为示踪物，通过将层析法与免疫胶体金技术相结合研制而成的产品。该试纸条能同时对H5亚型禽流感病毒抗体、新城疫病毒抗体和鸡法氏囊病毒抗体进行检测，具备快速、操作简单、与酶联免疫法相似的特异性及灵敏度等优点。
实用新型内容本实用新型目的在于提供一种操作方便、快速、有效地检测H5亚型禽流感病毒抗体、新城疫病毒抗体和鸡法氏囊病毒抗体的胶体金测试试纸条。为了实现上述目的，本实用新型采用如下技术方案—种检测H5亚型禽流感病毒抗体、新城疫病毒抗体和鸡法氏囊病毒抗体的胶体金测试试纸条，该试纸条包括底板、样品垫、涂覆胶体金颗粒标记抗体的玻璃纤维膜、包被膜和吸水纸，其中，包被膜的底面粘贴在底板上面，在该包被膜两端的上面分别粘贴玻璃纤维膜和吸水纸，在该玻璃纤维膜远离包被膜的一端的上面粘贴样品垫；在所述包被膜的上面设有检测线I、检测线II、检测线III和质控线，所述检测线I包被H5亚型禽流感病毒的蛋白抗原，检测线II包被新城疫病毒的蛋白抗原，检测线III包被鸡法氏囊病毒的蛋白抗原，质控线包被羊抗兔IgG抗体；所述玻璃纤维膜为涂覆胶体金颗粒标记的兔抗鸡IgG抗体的玻璃纤维膜。具体的，H5亚型禽流感病毒的蛋白抗原、新城疫病毒的蛋白抗原、鸡法氏囊病毒的蛋白抗原及羊抗兔IgG抗体分别固定于包被膜上并呈四条线平行排列，形成所述的检测线I、检测线II、检测线III和质控线。上述的H5亚型禽流感病毒、新城疫病毒和鸡法氏囊病毒的蛋白抗原均为高纯度的抗原，按照本领域的常规技术即可制得，故此处不再赘述。底板可以用PVC材料制成，包被膜可以是硝酸纤维素膜。本实用新型采用间接法检测抗体，通过对金标记抗体pH、浓度以及包被膜上包被抗原浓度的调整，使其能够产生特异条带，从而满足农户、基层及个人对于H5亚型禽流感病毒抗体、新城疫病毒抗体和鸡法氏囊病毒抗体检测的需求。本实用新型在对一份样品进行检测时，能同时检测出该样品是否含有H5亚型禽流感病毒抗体和/或新城疫病毒抗体和/或鸡法氏囊病毒抗体，其具有特异性好、灵敏度高、检测速度快等优点，且不需要使用仪器设备，操作简单，能广泛地用于农户、基层以及个人对于H5亚型禽流感病毒抗体、新城疫病毒抗体和鸡法氏囊病毒抗体的检测。
图I为本实用新型的侧面结构示意图，图中，I为PVC底板；2为样品垫；3为金标记抗体玻璃纤维膜；4为硝酸纤维素包被膜；5为吸水纸，下同；图2为图I的俯视图示意图，图中，6为检测线I ;7为检测线II ；8为检测线III ；9为质控线； 图3为本实用新型检测结果为H5亚型禽流感病毒抗体、新城疫病毒抗体和鸡法氏囊病毒抗体均阳性的示意图(即包被膜4表面的检测线I 6、检测线II 7、检测线III 8和质控线9均显色)；图4为本实用新型检测结果为H5亚型禽流感病毒抗体阳性的示意图(即包被膜4表面的检测线I 6和质控线9显色，而检测线II 7和检测线III 8不显色)；图5为本实用新型检测结果为新城疫病毒抗体阳性的示意图(即包被膜4表面的检测线II 7和质控线9显色而检测线I 6和检测线III 8不显色)；图6为本实用新型检测结果为鸡法氏囊病毒抗体阳性的示意图(即包被膜4表面的检测线III 8和质控线9显色，而检测线I 6和检测线II 7不显色)；图7为本实用新型检测结果为H5亚型禽流感病毒抗体和新城疫病毒抗体阳性的示意图(即包被膜4表面的检测线I 6、检测线II 7和质控线9显色，而检测线III 8不显色)；图8为本实用新型检测结果为H5亚型禽流感病毒抗体和鸡法氏囊病毒抗体阳性的示意图(即包被膜4表面的检测线I 6、检测线III 8和质控线9显色，而检测线II 7不显色)；图9为本实用新型检测结果为新城疫病毒抗体和鸡法氏囊病毒抗体阳性的示意图(即包被膜4表面的检测线II 7、检测线III 8和质控线9显色，而检测线I 6不显色)；图10为本实用新型检测结果为阴性的示意图(即包被膜4表面的质控线9显色，而检测线I 6、检测线II 7和检测线III 8均不显色)；图11为试纸条无效的示意图(即包被膜4表面的检测线I 6、检测线II 7、检测线III 8和质控线9均不显色)。
具体实施方式
以下结合附图对本实用新型做进一步详细说明，但本实用新型的保护范围不限于此。如图I和图2所示，一种检测H5亚型禽流感病毒抗体、新城疫病毒抗体和鸡法氏囊病毒抗体的胶体金测试试纸条，试纸条包括PVC底板I、样品垫2、涂覆(每毫升金标记抗体溶液涂覆10平方厘米的玻璃纤维素膜)胶体金颗粒标记(金标)兔抗鸡IgG抗体的玻璃纤维膜3、包被膜4和吸水纸5，其中，包被膜4的底面粘贴在PVC底板I上面，在该包被膜4两端的上面分别粘贴玻璃纤维膜3和吸水纸5，在该玻璃纤维膜3远离包被膜4的一端的上面粘贴样品垫2;在所述包被膜4的上面设有检测线I 6、检测线II 7、检测线III 8和质控线9，所述检测线I 6包被H5亚型禽流感病毒的蛋白抗原，检测线II 7包被新城疫病毒的蛋白抗原，检测线III 9包被鸡法氏囊病毒的蛋白抗原，质控线9包被羊抗兔IgG抗体。包被膜4为硝酸纤维素膜。H5亚型禽流感病毒的蛋白抗原、新城疫病毒的蛋白抗原、鸡法氏囊病毒的蛋白抗原及羊抗兔IgG抗体分别固定于包被膜4上并呈四条线平行排列，形成所述的检测线I 6、检测线II 7、检测线III 8和质控线9。通过检测线I 6、检测线II 7、检测线III 8和质控线9的显色来进行定性。本实用新型所述试纸条采用四条带显色的胶体金层析法制备，显带颜色为红色线条，具体制备工艺如下·[0026](I)胶体金溶液的制备将双蒸水置磁力搅拌器上搅拌加热至沸腾，按终浓度为万分之二的量迅速加入浓度为1%的氯金酸溶液，煮沸5分钟；再按所加入氯金酸溶液I. 8倍的体积量加入浓度为1%的柠檬酸三钠溶液，煮沸10分钟后，冷却至室温，用双蒸水定容至氯金酸终浓度为万分之二，常温避光保存备用。(2)金标抗体玻璃纤维膜3的制备用5M碳酸钾调节胶体金溶液pH值至7. 5，按40μδ抗体/毫升胶体金溶液的比例浓度加入兔抗鸡IgG抗体，混匀，静置5分钟；再按5%体积量加入浓度为10%的BSA溶液，混匀，静置5分钟；IOOOOrpm离心30分钟，弃上清，沉淀用标记洗涤液洗涤一次，离心后弃上清，沉淀用十分之一初始胶体金体积的金标抗体保存液溶解，然后按每毫升溶液铺10平方厘米的量涂覆在玻璃纤维膜3上，真空干燥3小时后，置装有干燥剂的密封袋中保存备用。上述10%BSA溶液、标记洗涤液和金标抗体保存液的具体组分配比如下10%BSA溶液每IOOOmL双蒸水中含牛血清白蛋白100g。标记洗涤液每IOOOmL双蒸水中含牛血清白蛋白4g，2g聚乙二醇8000，聚乙烯吡咯烷酮2g，蔗糖2g，Tris 1.211g，并调节pH至8. I。金标抗体保存液每IOOOmL双蒸水中含牛血清白蛋白25g，5g聚乙二醇8000，Tris 10. 2g，氢氧化钠2. 5g，7. 5mL吐温-20，并调节pH至8. 5。(3)硝酸纤维素包被膜4的制备在硝酸纤维素膜上分别喷涂H5亚型禽流感病毒的蛋白抗原、新城疫病毒的蛋白抗原、鸡法氏囊病毒的蛋白抗原及羊抗兔IgG抗体，并呈四条线平行排列，分别形成所述的检测线I 6、检测线II 7、检测线III 8和质控线9，37°C烘干处理2小时，置装有干燥剂的密封袋中保存备用。检测线I 6 :调试喷膜仪，喷液量为 μ /cm，用包被缓冲液稀释H5亚型禽流感病毒的蛋白抗原，浓度为3. Omg/mL，用喷膜仪喷涂划线。检测线II 7 :调试喷膜仪，喷液量为 μ /cm，用包被缓冲液稀释新城疫病毒的蛋白抗原，浓度为2. Omg/mL，用喷膜仪喷涂划线。检测线III 8 :调试喷膜仪，喷液量为 μ /cm，用包被缓冲液稀释鸡法氏囊病毒的蛋白抗原，浓度为2. 5mg/mL，用喷膜仪喷涂划线。[0036]质控线9 :调试喷膜仪，喷液量为 μ /cm，用包被缓冲液稀释羊抗兔IgG抗体，浓度为2. Omg/mL，用喷膜仪喷涂划线。上述包被缓冲液的具体组分配比为每IOOOmL双蒸水中含牛血清白蛋白O. Olg,十二水合磷酸氢二钠30. 072g，磷酸二氢钾2. 176g。包被膜上所划四条线应细致均匀，相邻两线间隔O. 3cm。(4)大板组条大板组条各组分规格(长X宽)=PVC底板I :30cmX7. 6cm ;样品垫2 :30cm X 3. Ocm ;金标记抗体玻璃纤维膜3 :30cm X O. 7cm ;硝酸纤维素包被膜4 :30cm X 2. Ocm ；吸水纸 5 30cmX3. 2cm。各组分按如下方法进行组条将硝酸纤维素包被膜4的底面粘贴在PVC底板I上，在该包被膜4两端的上面分别粘贴金标记抗体玻璃纤维膜3和吸水纸5，在该金标记抗体玻璃纤维膜3远离包被膜4的一端的上面粘贴样品垫2 ;即在PVC底板I上顺次相互搭接地粘贴样品垫2、金标记抗体玻璃纤维膜3、包被膜4和吸水纸5，组成大板。组装车间的湿度要控制在30%以下。(5)切条用切条机将大板切成单个人份，每人份宽度为4毫米，随机抽检，灵敏度能检出室内质控，条带显色程度达到一个“ + ”号，无非特异性条带。(6)封袋与组盒将I份已切好的试纸条、一包干燥剂和一根塑料滴管装在铝箔袋内，用封口机密封，密封完毕后放入试剂盒中，常温干燥保存。本实用新型采用高纯度的H5亚型禽流感病毒、新城疫病毒和鸡法氏囊病毒的蛋白抗原作为包被抗原进行特异的H5亚型禽流感病毒抗体、新城疫病毒抗体和鸡法氏囊病毒抗体检测。其原理是试纸条中含均匀分布的胶体金标记兔抗鸡IgG抗体，H5亚型禽流感病毒、新城疫病毒和鸡法氏囊病毒的蛋白抗原以及羊抗兔IgG抗体分别固定在硝酸纤维素膜4上并呈四条平行线排列，羊抗兔IgG抗体在最上方为质控线9 (阴性对照)，鸡法氏囊病毒蛋白抗原在第二条为检测线III 8，新城疫病毒蛋白抗原在第三条为检测线II 7，H5亚型禽流感病毒蛋白抗原在最下方为检测线I 6。胶体金标记的兔抗鸡IgG抗体能与样品中的H5亚型禽流感病毒抗体、新城疫病毒抗体和鸡法氏囊病毒抗体相结合形成免疫复合物，随样品从包被膜4上流过，包被膜4上所包被的蛋白抗原与之结合形成相应的免疫复合物，当样品中含有一定量的目的抗体时，相对应的检测区即可形成肉眼可见的红色带，依据有无红色带的形成进行结果的判断。具体的，当待检样品中仅含有H5亚型禽流感病毒抗体时，H5亚型禽流感病毒抗体与金标记的兔抗鸡IgG抗体结合形成免疫复合物，随样品从包被膜4上流过，包被膜4上的H5亚型禽流感病毒蛋白抗原与之结合，检测线I 6上形成红色带，检测结果为H5亚型禽流感病毒抗体阳性(如图4所示)。当待检样品中仅含有新城疫病毒抗体时，新城疫病毒抗体与金标记的兔抗鸡IgG抗体结合形成免疫复合物，随样品从包被膜4上流过，包被膜4上的新城疫病毒蛋白抗原与之结合，检测线II 7上形成红色带，检测结果为新城疫病毒抗体阳性(如图5所示)。当待检样品中仅含有鸡法氏囊病毒抗体时，鸡法氏囊病毒抗体与金标记的兔抗鸡IgG抗体结合形成免疫复合物，随样品从包被膜4上流过，包被膜4上的鸡法氏囊病毒蛋白抗原与之结合，检测线III 8上形成红色带，检测结果为鸡法氏囊病毒抗体阳性(如图6所示)。当待检样品中含其中任意两种病毒抗体时，其在包被膜4上相对应的检测区形成红色带，其他检测区不能形成红色带，检测结果为其对应的病毒抗体阳性(如图7、图8、图9所示)。当待检样品中同时含有H5亚型禽流感病毒抗体、新城疫病毒抗体和鸡法氏囊病毒抗体时，H5亚型禽流感病毒抗体、新城疫病毒抗体和鸡法氏囊病毒抗体分别与金标记的兔抗鸡IgG抗体相结合形成免疫复合物，随样品从包被膜4上流过，包被膜4上的H5亚型禽流感病毒蛋白抗原、新城疫病毒蛋白抗原和鸡法氏囊病毒蛋白抗原分别与之结合，检测线I
6、检测线II 7和检测线III 8上均形成红色带，检测结果为H5亚型禽流感病毒抗体、新城疫病毒抗体和鸡法氏囊病毒抗体均为阳性(如图3所示)。当待测样品中未含有H5亚型禽流感病毒抗体、新城疫病毒抗体和鸡法氏囊病毒抗体时，金标记的兔抗鸡IgG抗体无法与包被膜4上的H5亚型禽流感病毒蛋白抗原、新城疫病毒蛋白抗原和鸡法氏囊病毒蛋白抗原结合，致使金标记的兔抗鸡IgG抗体无法在膜上滞留，检测区不能形成红色带(即检测线I 6、
检测线II 7和检测线III 8上均不显色)，检测结果为阴性(如图10所示)。质控区如有红色带形成标志该试纸条的检测结果有效；否则，该试纸条的检测结果无效(如图11所示)。本实用新型具有特异性好、灵敏度高、检测速度快等优点，且不需要使用仪器设备，操作简单，能广泛地用于农户、基层以及个人对于H5亚型禽流感病毒抗体、新城疫病毒抗体和鸡法氏囊病毒抗体的检测。
权利要求1.一种检测H5亚型禽流感病毒抗体、新城疫病毒抗体和鸡法氏囊病毒抗体的胶体金测试试纸条，其特征在于，试纸条包括底板、样品垫、涂覆胶体金颗粒标记抗体的玻璃纤维膜、包被膜和吸水纸，其中，包被膜的底面粘贴在底板上面，在该包被膜两端的上面分别粘贴玻璃纤维膜和吸水纸，在该玻璃纤维膜远离包被膜的一端的上面粘贴样品垫；在所述包被膜的上面设有检测线I、检测线II、检测线III和质控线，所述检测线I包被H5亚型禽流感病毒的蛋白抗原，检测线II包被新城疫病毒的蛋白抗原，检测线III包被鸡法氏囊病毒的蛋白抗原，质控线包被羊抗兔IgG抗体；所述玻璃纤维膜为涂覆胶体金颗粒标记的兔抗鸡IgG抗体的玻璃纤维膜。
2.如权利要求I所述检测H5亚型禽流感病毒抗体、新城疫病毒抗体和鸡法氏囊病毒抗体的胶体金测试试纸条，其特征在于，H5亚型禽流感病毒的蛋白抗原、新城疫病毒的蛋白抗原、鸡法氏囊病毒的蛋白抗原及羊抗兔IgG抗体分别固定于包被膜上并呈四条线平行排列，形成所述的检测线I、检测线II、检测线III和质控线。
专利摘要本实用新型涉及一种检测H5亚型禽流感病毒抗体、新城疫病毒抗体和鸡法氏囊病毒抗体的胶体金测试试纸条，包括底板、样品垫、涂覆胶体金颗粒标记抗体的玻璃纤维膜、包被膜和吸水纸，其中包被膜的底面粘贴在底板上面，在该包被膜两端的上面分别粘贴玻璃纤维膜和吸水纸，在该玻璃纤维膜远离包被膜一端的上面粘贴样品垫；在包被膜的上面设有检测线I、II及III和质控线，所述检测线I、II及III分别包被H5亚型禽流感病毒、新城疫病毒及鸡法氏囊病毒的蛋白抗原，质控线包被羊抗兔IgG抗体。该试纸条特异性好、灵敏度高、检测速度快。
文档编号G01N33/543GK202693594SQ20122033425
公开日2013年1月23日 申请日期2012年7月11日 优先权日2012年7月11日
发明者路纪琪, 何宏轩, 张义锋, 赵林萍, 任宝红, 朱晗羽, 赵璐 申请人:郑州大学