抗肺炎链球菌的疫苗和组合物的制作方法

相关申请

本申请为申请日为2010年06月29日的申请号为201080038874.6的中国专利申请的分案申请。其母案申请要求如下美国临时专利申请的权益：美国临时专利申请第no.61/221,541号，申请日为2009年6月29日，美国临时专利申请第no.61/240,616号，申请日为2009年9月8日，美国临时专利申请第no.61/240,598号，申请日为2009年9月8日，美国临时专利申请第no.61/316,267号，申请日为2010年3月22日。所述申请的全部内容都通过引用方式并入到本申请中。

i.发明背景

肺炎链球菌感染一直是美国乃至全球范围内导致疾病和死亡的主要原因之一。每年数以百万记的肺炎，脑膜炎，菌血症以及中耳炎的病例都是由病原体肺炎链球菌感染所致。肺炎链球菌是一种具有荚膜的革兰氏阳性球菌，其在大约5-10％健康成年人以及20-40％健康儿童的鼻咽部位都有定植。当正常定植的肺炎链球菌进入咽鼓管，鼻窦，肺部，血液，脑膜，关节腔，骨骼以及腹腔中时会产生感染性。肺炎链球菌所具有的毒性因子使得该病原体能够逃避免疫系统。例如肺炎链球菌的多糖荚膜能够使其免受宿主免疫细胞的吞噬作用，其蛋白酶能够抑制补体介导的调理作用，它还含有能够引起宿主细胞裂解的蛋白。根据肺炎链球菌多糖荚膜中复合多糖的类型，肺炎链球菌可以分为不同的血清型。目前为止，人们已经发现了93种血清型的肺炎链球菌。

已经使用很多药物组合物来使机体免疫应答机制抵抗肺炎链球菌感染。多价肺炎链球菌疫苗ppv-23可以预防成年以及老年群体中的肺炎以及其他由于肺炎链球菌所导致的感染性疾病。该疫苗含肺炎链球菌23种血清型的荚膜多糖(cps)。这些cps属于非t细胞依赖型抗原，只能诱导短期抗体应答，需要重复接种加强免疫，这增加了出现免疫耐受的风险。抗肺炎链球菌的抗体抗荚膜抗体对成年人以及具有正常免疫力的个体具有保护作用。但是，对于低于2岁的儿童以及免疫功能不全的个体包括老年人，其并不能很好的应答非t细胞依赖型抗原，ppv-23对他们并不能产生理想的防护作用。另一种肺炎链球菌疫苗prevnar含有7种肺炎链球菌菌株中的细菌多糖，其中这些多糖与白喉类毒素蛋白偶联发挥作用。该疫苗能够诱导b细胞和t细胞应答。但是，由于它只能预防7种肺炎链球菌血清型，血清型替换会导致prevnar失效。ppv-23也存在同样的限制。已经在一些临床试验以及传染病学研究中对血清型替换进行了研究，结果表明这需要不同配方的疫苗，这就需要更高的花费。此外，ppv-23和prevnar的生产费用都很昂贵，这也极大地限制了它们在发展中国家的应用。

因此，目前仍然需要研究比那些现有疫苗更有效的药物组合物。特别是，这样的组合物需要有新的或特异的抗原来引发机体对肺炎链球菌的免疫应答。

ii.发明简述

肺炎链球菌是健康的威胁之一，特别是对非常年轻，年老或者免疫功能不全的患者。肺炎链球菌dna和蛋白质的序列信息已经是已知的，研究人员一直以来都在尝试研究制备肺炎链球菌的疫苗，但其中一个关键的问题是如何从肺炎链球菌基因组大约2100个基因中鉴定出具有保护性的多肽。本申请对肺炎链球菌进行了全基因组筛选，以鉴定出在肺炎链球菌基因组中最具有免疫原性的蛋白。筛选得到的一些靶点在小鼠模型的实验中证实了其具有预防肺炎链球菌定植的作用。相应地，本申请特别提供了某些针对肺炎链球菌的高效疫苗。这些疫苗可用于治疗性的和预防性的用途。本申请还提供了特异性的抗原以及使用这些抗原引发针对肺炎链球菌的免疫应答的方法。

本申请提供了，例如，一种疫苗制剂，其含有药学上可接受的载体以及一种或多种多肽，其中该多肽含有氨基酸序列，该氨基酸序列包含seqidnos：1-11中的任意序列或其免疫原性片段，可选地，该疫苗制剂进一步含有一多肽，其中该多肽含有氨基酸序列，该氨基酸序列含有seqidnos：12或13中的任一序列或其免疫原性片段。

本申请还提供了一种疫苗制剂，其包括药学上可接受的载体以及多肽，该多肽含有由seqidno：11组成的氨基酸序列或其免疫原性片段。此外，本申请提供了一种疫苗制剂，其包括药学上可接受的载体以及多肽，该多肽含有的氨基酸序列包含seqidnos：12序列。

进一步地，本申请提供了一种疫苗制剂，其包括药学上可接受的载体以及一种或多种多肽，其中该多肽含有氨基酸序列，该氨基酸序列包含seqidnos：14-21中的任意序列或其免疫原性片段。

本申请还提供了一种治疗遭受肺炎链球菌感染的主体或者容易被肺炎链球菌感染的主体的方法，其包括给予有效量的任意本申请所述的疫苗制剂。

本申请进一步提供了一种具有免疫原性的组合物，其含有药学上可接受的载体以及两种或多种多肽，其中该多肽含有的氨基酸序列包含seqidnos：1-13中的任意序列或其免疫原性片断，其中至少一种所述多肽含有的氨基酸序列包含seqidnos：1-10中的一种序列或其免疫原性片断。

附图说明

图1所示为免疫接种小鼠血液样品产生的il-17浓度，该小鼠先使用指定蛋白和霍乱毒素进行接种免疫，然后再按照实施例5中所述方法使用灭活后无荚膜的肺炎链球菌完整细胞进行刺激。左图为数据散点图，右图示出了每个样品的均值和标准差。免疫组“all3”表示动物使用了sp2108，sp0148以及sp1634的组合进行免疫。

图2所示为免疫接种小鼠血液样品产生的il-17的浓度，该小鼠先使用指定蛋白和霍乱毒素进行免疫，然后再按照实施例5中所述方法使用三种蛋白(sp2108，sp0148和sp1634)的组合进行刺激。

图3所示为小鼠洗鼻液中获得的肺炎链球菌群体的数目，该小鼠先使用指定蛋白以及霍乱毒素进行接种免疫，然后再按照实施例5中所述方法通过鼻内递送的方式使用肺炎链球菌进行攻击。003为无关抗原的对照组。

图4所示为免疫接种小鼠血液样品产生的il-17的浓度，该小鼠先使用指定蛋白和霍乱毒素进行免疫，然后再按照实施例6中所述方法使用灭活后无荚膜的肺炎链球菌完整细胞进行刺激。

图5所示为免疫接种小鼠血液样品产生的il-17的浓度，该小鼠先使用指定蛋白和霍乱毒素进行免疫，然后再按照实施例5中所述方法使用指定蛋白以及组合进行刺激。

图6所示为小鼠洗鼻液中获得的肺炎链球菌群体的数目，该小鼠先使用指定蛋白以及霍乱毒素进行接种免疫，然后再按照实施例6中所述方法通过鼻内递送的方式使用肺炎链球菌进行攻击。其中hsv-2蛋白icp47，基因名us12(np_044543.1，nc_001798.1；图中以003表示)以及卵清蛋白(ova)是对照组抗原。

图7所示为小鼠洗鼻液中获得的肺炎链球菌群体的数目，该小鼠先使用指定蛋白以及霍乱毒素进行接种免疫，然后再按照实施例7中所述方法通过鼻内递送的方式使用肺炎链球菌进行攻击。

图8所示为balb/c小鼠洗鼻液中获得的肺炎链球菌群体的数目，该小鼠先使用指定蛋白以及霍乱毒素进行接种免疫，然后再按照实施例8中所述方法通过鼻内递送的方式使用肺炎链球菌进行攻击。

iv.发明详述

a.用于肺炎链球菌疫苗和免疫原性组合物的特异多肽和核酸

本申请所述肺炎链球菌疫苗包括一种或者多种表1中所列的多肽或者基因，或下文所述的变体或片段。该疫苗可以包括多肽，该多肽包含表1中所列的序列或者其变体或者其具有免疫原性的片段，或者该多肽是由表1中的序列或其变体或者其具有免疫原性的片段所组成。每种基因和多肽对应的dna和蛋白序列可通过在公开数据库entrezgene(ncbinih网站，www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝gene)中肺炎链球菌tigr4基因组中搜索基因座标签获得，其所指定的序列同样包括在本申请中。

表1.用于疫苗制剂的免疫原性多肽

以下将对表1中的某些多肽及其变体作更详细描述。

1.sp0024(seqidno：1)及其变体

sp0024是由165个氨基酸编码的推测蛋白，其27位至163位氨基酸为保守的碳酸酐酶结构域。根据此保守基序，sp0024可能是锌结合蛋白。

在一些实施方式中，含有肺炎链球菌多肽的疫苗或药物组合物包含的多肽含有sp0024中的至少20个连续的氨基酸残基。该多肽还可以是这至少20个残基片段的变体。在某些实施方式中，该多肽含有sp0024中不超过150，125，或者100个连续的氨基酸残基。

2.sp0882(seqidno：2)及其变体

sp0882是一个274个氨基酸的推测蛋白。该蛋白的绝大部分(2至270氨基酸)构成酯酶或者类脂酶区域。

在一些实施方式中，含有肺炎链球菌多肽的疫苗或药物组合物包含的多肽含有sp0082中的至少20个连续氨基酸残基。该多肽还可以是这至少20个残基片段的变体。在某些实施方式中，该多肽含有sp0082中不超过250，275，200，175，150，125或100个连续的氨基酸残基。

一个特定的截短变体sp0882n是由sp0882的n末端130个氨基酸构成，其记为seqidno：3。sp0882n具有在不同血清型中非常保守的区域。在某些实施方式中，含有sp0882或sp0882n或它们的免疫原性片段的多肽还可以含有外源前导序列。该前导序列可以是，例如，sp2108的前导序列。seqidnos：4和5是这种多肽的两个实例。

sp0882的dna和蛋白序列的变体在美国专利申请公开号no.2009/0215149和国际申请wo2002/077021，wo98/18931，以及wo2007/106407中有记载。sp0882n的变体在国际申请wo2008/146164中有记载。

不同肺炎链球菌血清型之间在蛋白水平存在序列差异，seqidnos：14-17所表示的是不同肺炎链球菌血清型sp0882序列间相互比较所体现出的保守序列。相应地，在某些实施方式中，疫苗制剂含有多肽，该多肽含有的氨基酸序列包含seqidnos：14-17中的任意序列或其免疫原性片断(例如，代替一多肽，该多肽所含的氨基酸序列包含seqidnos:2-5中的一种)，或者由上述序列组成。

seqidnos：24-26表示那些编码不同sp0882变体的核酸序列，由于遗传编码的简并性，其它dna序列(包括密码子优化的序列)也可以编码这些多肽。

3.sp0148(seqidno：7)及其变体

蛋白sp0148称为“abc转运蛋白，底物结合蛋白”。该类蛋白通常是与跨膜蛋白复合物发生瞬时作用的胞外蛋白。这样的复合物可以利用atp水解产生的能量跨细胞膜转运特定的底物。sp0148是一个276个氨基酸的蛋白，其第40至246位氨基酸构成保守结构域pbpb(细胞周质结合蛋白)，该结构域是构成膜结合转运复合物的典型结构。此外，sp0148具有细菌胞外溶质结合蛋白第3家族结构域，该结构域多数与pbpb结构域相互依存，该结构域位于第40至244位氨基酸。在一些实施方式中，疫苗或其他组合物所含的sp0148的截短突变体含有或者缺少一种或者多种所述结构域和基序。

在一些实施方式中，含有肺炎链球菌多肽的疫苗或药物组合物包含的多肽含有sp0148中的至少20个连续氨基酸残基。该多肽还可以是这至少20个氨基酸残基片段的变体。在某些实施方式中，该多肽含有不超过250，275，200，175，150，125或100个来自sp0148的连续氨基酸残基。

内源sp0148含有一段推测的信号序列，其可以引导其分泌。在某些实施方式中，使用了缺少该信号序列的sp0148变体(seqidno：6)。seqidno：6多肽由seqidno：27所示核酸序列编码，但其它核酸序列(包括密码子优化的序列)也可以编码该多肽。在本申请所进行的筛选实验中使用到了编码sp0148全长序列的seqidno：28。

sp0148的dna和蛋白质序列的变体可参考美国专利申请公开号no.2005/0020813，美国专利号7,378,514和7,504,110，以及欧洲专利申请号ep1572868以及ep1855717。

seqidnos：18和19示出了不同肺炎链球菌血清型中的sp0148共同阐明的保守序列。相应地，在某些实施方式中，疫苗制剂含有多肽，该多肽含有的氨基酸序列包含seqidnos：18-19中的任一序列或其免疫原性片断(例如，代替其氨基酸序列包含seqidnos：6或7中的一条序列的多肽)，或者由上述序列组成。

4.sp1072(seqidno：8)及其变体

sp1072也称为dnag，是一种dna引物酶，它催化rna引物的形成从而使dna聚合酶起始dna复制。sp1072是586个氨基酸的蛋白，其含有一些保守的基序。从n末端开始，氨基酸2-96构成锌指结构域，氨基酸122-250构成dna引物酶的催化核心序列，氨基酸258至330区域构成高度保守的拓扑异构酶-引物酶(torpim)核苷酸转移酶/水解酶结构域。在一些实施方式中，疫苗或其他组合物含有sp1072的截短突变体，其包含或者缺少一种或者多种所述结构域和基序。

在一些实施方式中，含有肺炎链球菌多肽的疫苗或药物组合物包含的多肽含有sp1072序列中的至少20个连续的氨基酸残基。该多肽也可以是这至少20个残基片段的变体。在某些实施方式中，该多肽序列含有不超过550，500，450，400，350，300，250，200，150，或100个来自sp1072序列中的连续氨基酸残基。

5.sp2108(seqidno：9)及其变体

sp2108是一个423个氨基酸长度的多肽，也称为malx、麦芽糖/麦芽糖糊精abc转运蛋白、或者麦芽糖/麦芽糖糊精结合蛋白。该蛋白的绝大部分(3-423位氨基酸)属于male(细胞周质麦芽糖结合)结构域。此外，sp2108含有引导其分泌的信号序列。在一些实施方式中，疫苗或其他组合物所含的sp2108截断变体含有一种或者多种所述结构域和基序。

在一些实施方式中，本申请的组合物和方法使用了缺少信号序列的sp2108变体。该变体表示为多肽序列seqidno：10，其可以由例如根据seqidno：29序列的核酸序列来编码。

在一些实施方式中，含有肺炎链球菌多肽的疫苗或药物组合物包含的多肽含有sp2108序列中的至少20个连续氨基酸残基。该多肽也可以是这至少20个氨基酸残基片段的变体。在某些实施方式中，该多肽含有来自sp2108序列中的不超过400，350，300，250，200，150或100个连续的氨基酸残基。

seqidnos：20和21示出了不同血清型中的sp2108序列共同阐明的保守序列。因此，在某些实施方式中，疫苗制剂含有多肽，该多肽含有的氨基酸序列包含seqidnos：20-21中的一种或其免疫原性片段(例如，替换其氨基酸序列包含seqidnos：9或10中的一条序列的多肽)，或者由这些序列组成。

6.sp0651(seqidno：12)及其变体

sp0641也称为prta，其长度为2144个氨基酸，其是一种细胞壁结合丝氨酸蛋白酶。全长sp0641含有多个保守基序：485-597位氨基酸构成的pa_2基序，其可以形成蛋白结合表面；类fn3结构域(800-939位氨基酸)；以及2个预测的s8c5a类型催化结构域，其分别位于氨基酸226-449位以及639-777位。在一些实施方式中，疫苗或其他组合物包含sp0641的截短突变体，该突变体含有或者缺少一种或者多种所述结构域和基序。

在一些实施方式中，含有肺炎链球菌多肽的疫苗或药物组合物包含的多肽含有sp0641的至少20个连续的氨基酸。该多肽还可以是这至少20个氨基酸残基片段的变体。在某些实施方式中，该多肽含有sp0641序列中的不超过1000，900，800，700，600，500，400，300，200或100个连续的氨基酸序列。

也可以使用sp0641的某些其他截短突变体。例如sp0641n(seqidno：13)多肽，其由661个氨基酸组成，这些氨基酸对应于靠近sp0641n末端的第24-684位氨基酸。截断型变体sp0641m(seqidno：11)，大体上临近sp0641n(对应于sp0641序列的第686-1333位氨基酸)的648个残留区域。

sp0641的变体已经记载在例如美国专利号7,338,786，6,573,082和7,132,107，以及国际专利号wo00/06738中。

序列seqidnos：30和31分别示出了sp0641m和sp0641n的dna序列，由于存在遗传编码的简并性，其它序列(包括密码子优化的序列)也可以编码sp0641。

那些与表1和表2中的多肽(例如，sp0024，0882，0882n，含有或不含信号序列的0148，1072，含有或不含信号序列的sp1028，sp0641，sp0641m，或sp0641n)同源的多肽也可以用于本申请所公开的组合物以及方法。肺炎链球菌个体菌株之间含有大量的突变，有些这样的突变会在不同菌株之间产生不同的蛋白序列。本领域的技术人员能够很容易地使用来自不同肺炎链球菌菌株中的同源氨基酸序列来替换一条氨基酸序列或其部分序列。在某些方面，本申请提供的具有免疫原性的多肽与表1和表2中的多肽或其免疫原性片段在序列上具有至少90％、95％、97％、98％、99％或99.5％的一致性。血清型差异可用于设计这些表1和表2中的多肽的变体。

在一些实施方式中，本申请的疫苗组合物含有表1或表2中的蛋白的片段(例如以下蛋白的片段：sp0024，sp0882，sp0882n，含有或不含信号序列的sp0148，sp1072，含有或不含信号序列的sp1028，sp0641，sp0641m，或sp0641n)。在一些实施方式中，本申请提供的截短突变体在大小上和表1或表2中的多肽(例如，seqidnos：1-13之一)非常接近。例如，它们可以在一端或者两端最多缺少1，2，3，4，5，10，或20个氨基酸。还可以考虑序列内部的删除，例如，内部删除1-10，11-20，21-30或者31-40个氨基酸。

在某些实施方式中，疫苗制剂含有一种或多种多肽，该多肽所含的氨基酸序列包含seqidnos：14-21中的任意序列，或者由这些序列组成。在某些实施方式中，该片段是seqidnos：14-21序列中的任意序列在其n末端、c末端或者两端移除1-5、1-10或1-20个氨基酸残基后得到的截短片段。在某些实施方式中，该片段是seqidnos：14-21序列中的任意序列在其n末端、c末端或者两端移除1-10个氨基酸残基后得到的截短片段。例如，可以从蛋白的n末端和c末端各移除10个氨基酸残基，共移除了20个氨基酸残基。

除上述表1所列的核酸和多肽以外，本申请提供的具有免疫原性的组合物可以包含表1和/或表2中所列的一条或者多条多肽或基因，或本申请所述的变体或片段。每个基因和蛋白的dna和蛋白质序列可以根据上文提到过的通过搜索公开数据库entrezgene中的基因座标签的方法获得。

表2在人和小鼠筛选实验中鉴定得到的免疫原性蛋白

通常，本申请化合物中出现的多肽都是具有免疫原性的，无论是其本身还是其变体形式，变体包括该多肽与其它多肽融合的形式或者与佐剂混合或复合的形式。变体还包括与本申请所述序列的序列一致性小于100％的序列。在某些实施方式中，表1或表2中的抗原以全长多肽形式出现。此外，也可以使用具有适宜的免疫原性的片段、前体以及类似物。

这些多肽可以是在哺乳动物中具有免疫原性，例如，在小鼠，豚鼠或者人类中。具有免疫原性的多肽通常是指那些能够在试验中或者受试体中引起明显的免疫应答的多肽。例如，具有免疫原性的多肽可以提高t细胞产生的il-17的量。实施例1-4中所述的il-17检测是鉴定具有免疫原性的多肽的实例。或者，具有免疫原性的多肽还可以(i)诱导抗体的产生，例如，结合多肽的中和抗体，(ii)诱导th1免疫性，(iii)激活cd8+ctl应答，例如通过增加cd8+t细胞数量和/或增加定位到感染部位或重复感染部位的cd8+t细胞数量，(iv)诱导th17免疫性，和/或(v)激活先天免疫。在一些实施方式中，具有免疫原性的多肽能够诱导产生可检测剂量的特异性结合该抗原的抗体。

在某些实施方式中，多肽与人体自身抗原和/或肠道共生菌(例如，某些类菌体，梭菌，梭杆菌，真细菌，瘤胃球菌，消化球菌，消化链球菌，双歧杆菌，埃希氏菌以及乳酸杆菌)的一致性少于20％，30％，40％，50％，60％或70％。人体自身抗原的实例包括胰岛素，增殖细胞核抗原，细胞色素p450，以及髓鞘碱性蛋白。

本申请提供了，例如，疫苗制剂，其含有药学上可接受的载体以及一种或多种多肽，其中该多肽含有氨基酸序列，该氨基酸序列包含seqidnos：1-11中的任意序列或其免疫原性片段，可选地，该疫苗制剂进一步含有一多肽，其中该多肽含有氨基酸序列，该氨基酸序列含有seqidnos：12或13中的任一序列或其免疫原性片段。在某些实施方式中，该疫苗制剂含有至少两种不同的多肽，该多肽含有的氨基酸序列包含seqidnos：1-13中的任意序列或其免疫原性片段，其中至少一种所述多肽含有的氨基酸序列包含seqidnos：1-10中的一种序列或者其免疫原性片段。此处的术语“不同”强调了所述两种多肽中的每一种多肽都是源自序列seqidnos：1-13中不同的序列。

该疫苗制剂还可以含有一种或多种多肽，该多肽含有的氨基酸序列由seqidnos：1-11中的任意序列组成。

在一些实施方式中，疫苗制剂含有至少2种多肽，其中每种多肽属于(i)-(vi)组中不同的组：(i)seqidno：1，或其免疫原性片段，(ii)seqidnos：2-5之一，或其免疫原性片段，(iii)seqidnos：6-7之一，或其免疫原性片段，(iv)seqidno：8，或其免疫原性片段，(v)seqidnos：9-10之一，或其免疫原性片段，以及(vi)seqidnos：11-13之一，或其免疫原性片段。这样组合的实例如下所列：

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在某些实施方式中，疫苗制剂含有至少3种不同的多肽，该多肽含有的氨基酸序列包含seqidnos：1-13中的任意序列或其免疫原性片段，其中至少1种所述多肽含有的氨基酸序列包含seqidnos：1-10中的一种序列。在某些这样的实施方式中，该疫苗制剂含有至少3种多肽，每种多肽属于(i)-(vi)组中不同的组：(i)seqidno：1，或其免疫原性片段，(ii)seqidnos：2-5之一，或其免疫原性片段，(iii)seqidnos：6-7之一，或其免疫原性片段，(iv)seqidno：8，或其免疫原性片段，(v)seqidnos：9-10之一，或其免疫原性片段，以及(vi)seqidnos：11-13之一，或其免疫原性片段。这样组合的实例如下所列：

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在某些实施方式中，疫苗制剂含有至少2种不同的多肽，该多肽含有的氨基酸序列包含seqidnos：14-21中的任意序列或其免疫原性片段。在某些这样的实施方式中，该疫苗制剂含有至少2种多肽，每种多肽属于(i)-(iii)组中不同的组：(i)seqidnos：14-17之一，或其免疫原性片段，(ii)seqidnos：18-19之一，或其免疫原性片段，以及(iii)seqidnos：20-21之一，或其免疫原性片段。这样组合的实例如下所列：

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seqidno:14和seqidno:19

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在一些方面，含有一种或者多种seqidnos：14-21中序列的疫苗制剂进一步含有多肽，该多肽含有的氨基酸序列包含seqidnos：1-13中的任意序列。

在某些实施方式中，该疫苗制剂含有至少3种不同的多肽，其中该多肽含有氨基酸序列，该氨基酸序列包含seqidnos：14-21中的任意序列或其免疫原性片段。在某些这样的实施方式中，该疫苗制剂含有(i)-(iii)组中的3种多肽：(i)seqidnos：14-17之一，或其免疫原性片段，(ii)seqidnos：18-19之一，或其免疫原性片段，以及(iii)seqidnos：20-21之一，或其免疫原性片段。这样组合的实例如下所列：

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多肽可以含有一种或者多种免疫原性部分以及一种或者多种非免疫原性部分。其中免疫原性部分可以使用多种方法鉴定，包括蛋白质芯片，elispot/elisa技术，和/或针对所研究多肽的不同删除突变体(例如，片段)进行的特异分析。免疫原性部分还可以通过计算机算法鉴定。有些这样的算法例如epimatrix(由epivax制作)使用计算矩阵的方法。其他的用于鉴定抗原表位的计算工具包括pepvac(promiscuousepitope-basedvaccine，其由danafarbercancerinstitute提供，网址为immunax.dfci.harvard.edu/pepvac)，以及mhcpred(其使用局部最小平方数方法，其由jennerinstitute提供，网址为www.jenner.ac.uk/mhcpred)。本申请所述的免疫原性片段中含有至少一种由试验方法或算法鉴定出的免疫原性部分。由上述工具鉴定出的多肽实例如下：

因此，在一些方面，本申请提供了本申请所述抗原的免疫原性片段。在一些实例中，该片段的大小与全长多肽或者表1或表2中所列多肽接近。例如，它们可以在一端或者两端最多缺失1，2，3，4，5，10或20个氨基酸。在某些实施方式中，多肽的长度为100-500个氨基酸，或者150-450，或者200-400，或者250-250个氨基酸。在一些实施方式中，多肽的长度为100-200，150-250，200-300，250-350，300-400，350-450或者400-500个氨基酸。上述的片段或者其亚片段(例如，8-50、8-30或者8-20个氨基酸残基的片段)优选具有下文所述的一种生物学活性，例如使释放的il-17的量至少提高1.5倍或2倍或更高倍数(例如，或者是作为绝对的度量值，或者是相对于无免疫活性的蛋白如卵清蛋白而言)。片段可以作为多肽在本申请所述疫苗中使用，也可以融合到其他蛋白、蛋白片段或者多肽。

在一些实施方式中，该片段是seqidnos：1-13中的任意序列在其n末端、c末端或两端移除1-5、1-10或者1-20个氨基酸残基后得到的截短片段。在一些实施方式中n末端和c末端被移除了相同数目的残基，而在其他一些实施方式中，n末端和c末端被移除的氨基酸残基数目并不相同。

在某些方面，本申请提供的免疫原性多肽与表1或表2中的多肽相比具有至少90％，95％，97％，98％，99％或99.5％的序列一致性。本申请还提供了一种疫苗制剂，其包括药学上可接受的载体以及一种或者多种多肽，该多肽含有的氨基酸序列所含的序列与seqidnos：1-11中的任意序列或其免疫原性片段具有至少90％，95％，98％，或者99％的一致性，并且可选地，该疫苗制剂进一步含有一多肽，该多肽含有的氨基酸序列所含的序列与seqidnos：12或13的序列或其免疫原性片段相比具有至少90％，95％，98％或99％的一致性。在某些实施方式中，该疫苗制剂含有至少两种不同的多肽，该多肽含有的氨基酸序列所含的序列与seqidnos：1-13中的任意序列或其免疫原性片段具有至少90％，95％，98％，或99％的一致性，其中至少一种所述多肽含有的氨基酸序列所含的序列与seqidnos：1-10中的某一种序列或其免疫原性片段具有至少90％，95％，98％或者99％的一致性。

在一些实施方式中，表1或表2中的一种或者多种多肽例如2种、3种、4种或更多种多肽或其免疫原性片段或其变体以混合物的形式提供。在一些实施方式中，表1或表2中的2种、3种、4种或更多种多肽或其免疫原性片段或其变体以共价结合的方式相互结合，例如，以融合蛋白的形式。

在一些实施方式中，疫苗制剂中所含多肽除含有seqidnos：1-13中的任意序列以外，基本上不含有其他肺炎链球菌多肽。在一些实施方式中，疫苗制剂中的多肽所含序列除表1中所列多肽以外基本上不含有其他肺炎链球菌多肽。在一些实施方式中，疫苗制剂中的多肽除表1或表2中所列多肽以外，基本上不含有其他肺炎链球菌多肽。

在某些实施方式中，疫苗制剂或者免疫原性组合物中所含多肽除含有seqidno：1-13中的任意氨基酸序列以外，基本上不含有其他肺炎链球菌多肽。在某些这样的实施方式中，疫苗制剂或免疫原性组合物中所含多肽的氨基酸序列含有由seqidno：1-13中的任意序列组成的序列，除此之外基本上不含有其他肺炎链球菌多肽。在一些实施方式中，疫苗制剂或免疫原性组合物所含多肽含有的氨基酸序列包含表1和表2中所列多肽的任意序列(或由这些序列组成)，除此之外基本上不含有其他肺炎链球菌多肽。在这种语境中，术语“基本上”是指其他肺炎链球菌多肽的含量要小于50％，小于40％，小于30％，小于20％，小于10％，小于5％，小于3％，小于2％，或甚至小于1％。

在某些实施方式中，疫苗组合物在与th17细胞接触后所诱导出的th17细胞应答相比于由对照组无关抗原(如hsv-2蛋白icp47，其基因名称为us12)所诱导出的应答要高至少1.5倍。在一些实施方式中，疫苗制剂在未被感染的主体中阻止了肺炎链球菌的感染。在某些实施方式中，疫苗制剂抑制了肺炎链球菌在个体中的定植。在一些实施方式中，疫苗制剂抑制了肺炎链球菌引起的症状。

在某些实施方式中，本申请提供了编码一种或者多种上述多肽的核酸，如dna，rna或其类似物。编码上述多肽的dna序列可以以不影响蛋白产物序列的方式进行修饰，这种序列包括在本发明之内。。例如，dna序列可以进行密码子优化以提高在宿主中的表达水平，这样的宿主如大肠杆菌，昆虫细胞系(例如，使用杆状病毒表达系统)，或者哺乳动物(例如，人或中华仓鼠)细胞系。

在某些实施方式中，本申请还提供了核酸(如dna，rna，或其类似物)，该核酸的序列与表1或表2中的基因或其变体或所述基因的部分序列相比具有至少70％，80％，90％，95％，97％，98％，99％或者100％的序列一致性。在某些实施方式中，核酸长度为600-2000，800-1800，1000-1600，1200-1400个核苷酸。在一些实施方式中，核酸的长度为600-1600，800-1800或者1000-2000个核苷酸。该核酸可用于，例如，重组表达产生表1和表2中的多肽或其免疫原性片段。

在一些实施方式中，疫苗或免疫原性组合物可以含有融合蛋白和/或融合dna构建体。本申请的多肽可以在未经修饰的情况下使用。在某些实施方式中，当使用较小的相关多肽时例如片段或其类似物，并且它们的分子量小于大约5000道尔顿例如1500至5000道尔顿，对其进行修饰可以有助于激发所需的免疫应答。例如，可以将这些较小的多肽偶联至合适的免疫原性载体例如破伤风类毒素、肺炎球菌溶血素、钥孔戚血蓝蛋白或类似载体上。在某些实施方式中，疫苗制剂含有至少一种脂化的多肽。偶联可以是直接的或者间接的(例如，通过连接物)。在其他实施方式中，构建体可以含有表1或2中的基因或蛋白，或其免疫原性片段或其变体，以及标签。标签可以位于n末端或者c末端。例如，可以在核酸或者多肽上添加标签，从而使其便于纯化，检测，提高溶解度，或者使蛋白或核酸获得其他需要的特性。例如，纯化标签可以是多肽，寡肽，或者可用于亲和纯化的多肽。这样的实例包括his，gst，tap，flag，myc，ha，mbp，vsv-g，硫氧还蛋白，v5，亲和素，链亲和素，bccp，钙调蛋白，nus，s标签，脂蛋白d，以及β半乳糖苷酶。特定的示例性his标签包括hhhhhh(seqidno：32)和msyyhhhhhh(seqidno：33)。在其他实施方式中，多肽不含有标签，如蛋白纯化标签，其纯化所使用的方法为不依赖于亲和标签纯化的方法。在一些实施方式中，融合的部分很短。在一些实例中，这是指融合蛋白在表1或者表2所述多肽的其中一个末端或者两端含有不超过1，2，3，4，5，10或者20个额外的氨基酸。

b.具有免疫原性的组合物

本申请还提供了药物组合物，其含有免疫原性的多肽或编码这些免疫原性多肽的多聚核苷酸，以及药用载体。来自肺炎链球菌的抗原通过筛选感染了肺炎链球菌的小鼠免疫细胞或者健康的捐助人获得。因为肺炎链球菌是一种非常常见的疾病以及定植病原体，这些捐助人据推测在其生活中的某段时间曾感染过肺炎链球菌。简要来说，肺炎链球菌抗原文库使用细菌体系表达，并与抗原递呈细胞(apcs)混合。这些apcs转而将来自肺炎链球菌的多肽呈递给从小鼠或者捐助人中分离出的淋巴细胞。分析淋巴细胞对肺炎链球菌的应答反应。捐助人以及使用肺炎链球菌免疫的小鼠能够产生特异于肺炎链球菌抗原的淋巴细胞。因而，本申请提供了一种展望性的肺炎链球菌抗原的组合物，该组合物可以在已免疫的或感染的小鼠或人体内引发强烈的免疫反应以抵抗肺炎链球菌感染。

表1和表2中列出了根据本申请所述筛选方法鉴定出的肺炎链球菌抗原的蛋白序列以及对应的核酸序列。这些抗原通过在小鼠和人的t细胞中进行筛选鉴定得到。在使用小鼠t细胞进行筛选的时候，所鉴定出的抗原经历了至少两轮筛选：基因组范围的筛选以鉴定能引发免疫反应的4个抗原为一组的抗原池，然后进行重叠合法筛选以逐个测试和鉴定那些在基因组级别筛选出的抗原池中能够引发免疫应答的单个抗原。相反，在使用人t细胞进行筛选的时候，首先建立了两组不同的抗原池，这样使得多肽在第一个池子和第二个池子中与不同的多肽混合。如此，通过鉴定哪些多肽在第一组和第二组中同时都属于阳性池子，就可以测定哪些多肽是抗原。表1列出了通过以上方法中的一种所鉴定出的抗原(以及其变体)，这些抗原进一步在实施例5-8中所描述的小鼠模型中进行测试。因此，根据本申请的组合物可以含有一种或者两种或者更多种表1或表2中所列的基因或其相应的基因产物。

免疫原性组合物还可以含有所述肺炎链球菌多肽的一部分，例如删除型突变体，截短型突变体，寡核苷酸，以及多肽片段。在一些实施方式中，所述多肽的该部分具有免疫原性。蛋白某个部分的免疫原性可以很容易的使用那些用于测定全长蛋白免疫原性的检测方法测定。在一些实施方式中，多肽的该部分基本上具有全长蛋白一样的免疫原性。在一些实施方式中，该免疫原性不超过全长蛋白(例如，表1和表2中的多肽)的10％，20％，30％，40％，或小于全长蛋白的50％。该多肽片段可以是，例如，线性的，环形的，或者含侧链的。

在一些实施方式中，本申请所述的疫苗制剂和免疫原性组合物中含有的免疫原性多肽(例如表1和表2中的多肽)具有膜转运序列(mts)，以便于引导多肽进入哺乳动物细胞中，并随后刺激细胞介导的免疫应答。膜转运序列的实例包括，kaposi成纤维细胞生长因子信号序列中的疏水区，α-核突触蛋白、β-核突触蛋白或者γ-核突触蛋白的mts序列，触足同源结构域(antennapediahomeodomain)的第三个螺旋区，sn50，整联蛋白β3的h-区，hivtat，pantp，pr-39，抗菌肽abaecin，抗菌肽apidaecin，bac5，bac7，伯氏疟原虫(p.berghei)cs蛋白，以及美国专利6,248,558，6,432,680和6,248,558中所述的mts序列。

在某些实施方式中，抗原(例如，表1或表2中的多肽)与其他分子共价结合。这样可以，例如，提高该抗原的半衰期，可溶性，生物利用度或者免疫原性。能够与抗原共价结合的分子包括碳水化合物，生物素，聚乙二醇(peg)，聚唾液酸，n-丙酰多聚唾液酸，核酸，多糖以及plga。peg拥有很多不同的类型，其分子量范围从300g/mol以下至10，000,000g/mol以上不等。peg的链结构可以是线性的，含侧链的，或者具有梳形或星形几何结构。在一些实施方式中，天然形式的蛋白与刺激免疫系统的的基团共价结合。一个这样的基团实例是脂质基团。在一些实例中，脂质基团可以被toll样受体(tlr)如tlr2所识别，并激活先天免疫系统。

c.特异针对表1和表2中蛋白的抗体

本申请另一方面所公开的是针对抗原组合物(例如，表1或表2中所列的一种蛋白，或其免疫原性片段)的抗体的制备。例如，本申请提供了2种，3种，4种或者5种抗体的组合，其中每种抗体识别表1或表2中的不同蛋白。各种类型的抗体均包括在本申请之内。这样的抗体包括，例如，多克隆抗体，单克隆抗体，重组型抗体，人源化抗体或者部分人源化抗体，单链，fab，及其片段等。这些抗体可以是任何同种型，例如，igg，各种igg同种型，如igg1，igg2，igg2a，igg2b，igg3，igg4等；并且它们可以来自任何产生抗体的动物物种，包括山羊，兔，小鼠，鸡，或类似动物。在一些实施方式中，fab分子在遗传转化的宿主细胞如大肠杆菌中表达和组装。可使用lambda载体系统表达fab分子的群体，其潜在的多样性等同于或者超过受试体所产生的抗体前体。可参见huse等人(1989),science246,1275-81。

d.含有肺炎链球菌抗原或识别相同抗原的抗体的疫苗成分或免疫原性组合物

在某些实施方式中，疫苗或免疫性组合物含有抗原和一种或者多种以下成分：佐剂，稳定剂，缓冲液，表面活性剂，释放控制成分，盐，防腐剂，以及特异针对所述抗原的抗体。

1.佐剂

本申请所述疫苗制剂和免疫原性组合物可以含有佐剂。佐剂根据他们的作用机制可以宽泛的分为两类：疫苗递送系统和免疫刺激佐剂(可参见，例如，singh等人,curr.hivres.1:309-20，2003)。疫苗递送系统通常是颗粒制剂，例如，乳化剂，微粒，免疫刺激复合物(iscoms)，它们可以是例如颗粒和/或基质以及脂质体。相反，免疫刺激佐剂有时候源自病原体，并且能表现出病原体相关的分子模式(pamp)，例如，脂多糖(lps)，单磷酰脂(mpl)，或者含cpg的dna，它们可以激活细胞的先天免疫系统。

另外，佐剂可以分类为有机佐剂和无机佐剂。无机佐剂包括铝盐，例如磷酸铝，非晶形铝的羟基磷酸硫酸盐，以及氢氧化铝，这些通常在人类疫苗中使用。有机佐剂含有有机分子包括有机大分子。有机佐剂的一个实例是霍乱毒素。

佐剂还可以根据它们所诱导的应答来分类。在一些实施方式中，佐剂诱导th1或th2细胞的激活。而在其他实施方式中，佐剂诱导激活b细胞。在还有一些其他的实施方式中，佐剂诱导激活抗原呈递细胞。这些分类并不是互斥的；在一些例子中，佐剂激活了不止一种细胞类型。

在某些实施方式中，佐剂诱导激活th17细胞。它可以促进th17细胞分泌il-17。在一些实施方式中，诱导th17细胞激活的佐剂使实验组样品相比对照组在接下来的试验中产生至少2倍在一些例子中产生10倍的激活比例。在实验中，实验者比较了两群细胞所分泌的il-17水平：(1)使用佐剂和已知能够诱导th17细胞激活的多肽处理的细胞，以及(2)使用佐剂和无关多肽(对照组)处理的细胞。能够诱导th17细胞激活的佐剂相比细胞群体(2)可导致细胞群体(1)产生超过2倍，或超过10倍量的il-17。il-17可以通过，例如，elisa或western杂交来测量。某些毒素例如霍乱毒素和不稳定的毒素(由产毒素大肠杆菌或etec产生)能够激活th17应答。因此，在一些实施方式中，佐剂是一种毒素。霍乱毒素在小鼠模型中已被成功的与表1中的某些多肽一起用于诱导保护性免疫(见实施例5-8)。intercell公司生产出了一种不稳定形式的毒素。也可以使用不稳定的毒素的突变体，它能够作为佐剂起激活作用但是却具有明显低的毒性。脱毒的不稳定毒素的突变体衍生物的实例包括，缺失adp核糖转移酶活性的突变体。特定的脱毒的不稳定毒素突变衍生物包括，ltk7(douce等人,"mutantsofescherichiacoliheat-labiletoxinlackingadp-ribosyltransferaseactivityactasnontoxic,mucosaladjuvants"pnasvol.92,pp.1644-1648,february1995)和ltk63(williams等人,"innateimprintingbythemodifiedheat-labiletoxinofescherichiacoli(ltk63)providesgenericprotectionagainstlunginfectiousdisease"thejournalofimmunology,2004,173:7435-7443)，lt-g192(douce等人"geneticallydetoxifiedmutantsofheat-labiletoxinfromescherichiacoliareabletoactasoraladjuvants"infectimmun.1999sep；67(9):4400-6)，和ltr72("mucosaladjuvanticityandimmunogenicityofltr72,anovelmutantofescherichiacoliheat-labileenterotoxinwithpartialknockoutofadp-ribosyltransferaseactivity."jexpmed.1998apr6；187(7):1123-32)。

在一些实施方式中，佐剂含有vlp(类病毒颗粒)。一种这样的佐剂平台是甲病毒复制子，其通过使用甲病毒来诱导th17细胞激活，其是由alphavax公司生产。在某些使用甲病毒复制子系统的实施方式中，甲病毒可以通过遗传操作来使其表达感兴趣的抗原、感兴趣的细胞因子(例如，il-17或刺激il-17产生的细胞因子)或者同时表达二者，并且这些可以在辅助细胞系中进行表达。更详细的信息可参考美国专利5,643,576和6,783,939。在一些实施方式中，疫苗制剂与编码细胞因子的核酸一起给予患者。

某些类别的佐剂通过激活toll样受体(tlrs)以激活th17应答。tlrs是公知的可能位于白细胞细胞膜上的蛋白，其能够识别外来抗原(包括微生物抗原)。使用已知的tlr配体与感兴趣的抗原共同给药(例如，以融合蛋白的形式)能够促进那些特异针对感兴趣抗原的免疫应答的发生。激活tlrs佐剂的一个实例包括单磷酰脂a(mpl)。习惯上，mpl可以从革兰氏阴性细菌如s.minnesota中以脱毒的脂多糖(lps)内毒素的形式获得。特别地，对lps进行酸性和碱性水解可以产生具有免疫活性的脂质a部分(其是mpl)，并且缺少lps中存在的多糖基团以及除一个以外的所有磷酸基团。许多合成型的tlr激动剂(特别是tlr4的激动剂)可以参见evansjt等人"enhancementofantigen-specificimmunityviathetlr4ligandsmpladjuvantandribi.529."expertrevvaccines2003apr；2(2):219-29。与mpl佐剂类似，这些合成型化合物通过tlr激活先天免疫系统。另一种类型的tlr激动剂为合成型磷脂二聚体，例如e6020(ishizakast等人"e6020:asynthetictoll-likereceptor4agonistasavaccineadjuvant."expertrev.vaccines.2007oct；6(5):773-84.)。各种tlr激动剂(包括tlr4激动剂)已经由例如infectiousdiseaseresearchinstitute(irdi),corixa,esai,avantipolarlipids,inc.,和sigmaaldrich生产和销售。另一种激活tlr的示例性佐剂是含有mpl、海藻糖dicoynomycolate(tdm)以及双十八烷基二甲基溴化銨(dda)的混合物。另一种激活tlr的佐剂是r848(resiquimod)。

在一些实施方式中，佐剂是皂甙或者含有皂甙。一般来说，皂甙是一种三萜皂苷，例如从皂树(quillajasaponariatree)树皮中分离出的皂甙。从生物体中提取出的皂甙可进一步分离(例如，使用色谱技术)以分离抽提物中最具有佐剂活性以及具有可接受毒性的部分。已知皂树提取物中可用作佐剂的典型部分是分离部分a和分离部分c。

可用于本申请疫苗制剂的一种特定形式的皂甙是免疫刺激复合物(iscoms)。iscoms是本领域所承认的一类佐剂，其通常含有皂树的皂甙部分和脂类(例如，胆甾醇和磷脂如磷脂酰胆碱)。在某些实施方式中，iscom与感兴趣的多肽或感兴趣的核酸组装在一起。但是，不同的皂甙分离部分可以不同的比例使用。此外，不同的皂甙分离部分可以在相同的佐剂颗粒中共存，或者每类佐剂颗粒中基本上只含有一种分离部分(如此，指定比例的分离a部分和分离c部分可以通过混合颗粒与不同分离部分来获得)。在这种情况下，术语“基本上”是指不超过20％，15％，10％，5％，4％，3％，2％或甚至1％。这样的佐剂所含分离部分a和分离部分c的混合比例可以为70-95a：30-5c，如从70a：30c至75a：5c，75a：5c至80a：20c，80a：20c至85a：15c，85a：15c至90a：10c，90a：10c至95a：5c，或95a：5c至99a：1c。

在某些实施方式中，可以使用佐剂组合。佐剂组合的3个实例是mpl和明矾，e6020和明矾，以及mpl和iscom。

佐剂可以与抗原共价结合。在一些实施方式中，该佐剂可以含有蛋白，该蛋白通过激活抗原递呈细胞(apcs)诱导炎症反应。在一些实施方式中，一种或者多种这样的蛋白可通过重组与所选抗原融合，从而使得得到的融合分子能促进树突细胞的成熟，激活树突细胞产生细胞因子和趋化因子，从而最终增强抗原至t细胞的呈递并启动t细胞应答(参见wu等人,cancerres2005；65(11),pp4947-4954)。在某些实施方式中，本申请所述的多肽在三价肺炎链球菌表面粘附素a存在条件下呈递，肺炎链球菌表面粘附素a是一种带有三个氨基酸替换(w433f，d385n，和c428g)的肺炎链球菌溶血素衍生物，其可以使得该分子不具有毒性但又不会干扰lu等人所述的tlr4-介导的炎症反应-细胞壁多糖偶联系统("protectionagainstpneumococcalcolonizationandfatalpneumoniabyatrivalentconjugateofafusionproteinwiththecellwallpolysaccharide."infectimmun.2009may；77(5):2076-83)。该偶联系统是“psaa与肺炎链球菌溶血素非毒性衍生物pdt形成的融合蛋白进一步与cps偶联”形成的融合蛋白。在一些实施方式中，本申请的一种或者多种多肽取代了三价偶合物中的psaa。该三价偶联物系统通常包括明矾，并且通常通过肠道外给药。其他可与抗原共价结合的佐剂的实例包括，多糖，肺炎链球菌溶血素，合成肽，脂肽，以及核酸。

通常，每剂量疫苗中存在的佐剂或佐剂混合物是相同的。但可选的是，佐剂可以跟第一次给药的疫苗一起给予，在接下来的给药(即强化注射)中就不再给予佐剂。另一种方式是，在第一次给予疫苗的时候使用强效佐剂，而在接下来的给药中使用较弱的佐剂或者低剂量的强效佐剂。佐剂可以在将抗原给予受试者之前给予，也可以与抗原同时给药，或者在给予抗原之后给予(有时候是在1，2，6，或12个小时之内，有时候则是在1，2或5天之内)。某些佐剂适用于人患者，有些适用于非人类的动物，或者二者皆适用。

2.疫苗或免疫原性组合物的其它成分

除上述抗原和佐剂以外，疫苗制剂或免疫原性组合物中可以含有一种或多种其它成分。

在某些实施方式中，疫苗制剂或免疫原性组合物可以含有一种或多种稳定剂如糖(如蔗糖，葡萄糖，或果糖)，磷酸盐(如磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，或磷酸二氢钠)，谷氨酸盐(如l-谷氨酸钠)，凝胶(例如，处理过的凝胶，水解凝胶，或猪凝胶)，氨基酸(如精氨酸，天冬酰胺，组氨酸，l-组氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，丝氨酸，苏氨酸，赖氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，及其烷基酯)，肌苷，或硼酸钠。

在某些实施方式中，疫苗制剂或免疫原性组合物包括一种或者多种缓冲液如碳酸氢钠和抗坏血酸的混合物。在一些实施方式中，疫苗制剂可以通过盐水给药如磷酸盐缓冲盐水(pbs)，或蒸馏水。

在某些实施方式中，疫苗制剂或免疫原性组合物含有一种或多种表面活性剂如聚山梨醇酯80(tween80)，tritonx-100，聚乙二醇叔辛基苯基乙醚4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇(tritonx-100)；聚氧乙烯失水山梨糖醇酐单月桂酸酯聚乙二醇失水山梨糖醇酐单月桂酸酯(tween20)；以及4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯酚与甲醛和环氧乙烷的聚合物(tyloxapol)。表面活性剂可以是离子型或非离子型的。

在某些实施方式中，疫苗制剂或免疫原性组合物包含一种或多种盐，如氯化钠，氯化铵，氯化钙，或氯化钾。

在某些实施方式中，疫苗制剂或免疫原性组合物中含有防腐剂。在其他实施方式中并未使用防腐剂。防腐剂在多剂量的疫苗小瓶中最常使用，而在单剂量的疫苗小瓶中较少用到。在某些实施方式中，防腐剂是2-苯氧基乙醇，对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯，苯甲醇，和/或山梨酸。

在某些实施方式中，疫苗制剂或免疫原性组合物是可控释放的制剂。

e.dna疫苗

在某些方面，疫苗中含有本申请所公开的核酸中的一种，或者含有对应于本申请所述多肽的核酸。当给予患者核酸疫苗时，患者体内会产生相应的基因产物(例如所需的抗原)。在一些实施方式中，含有优化的重组多聚核苷酸的核酸疫苗载体可以被递送给哺乳动物(包括人类)以诱导治疗性的或预防性的免疫应答。核酸可以是，例如，dna，rna，或合成型的核酸。该核酸可以是单链的或者双链的。

核酸疫苗载体(例如，腺病毒，脂质体，乳头瘤病毒，逆转录病毒等)可以被直接给予哺乳动物，以在体内进行细胞转导。核酸疫苗可以被配制成以任何适合的方式给药的药物组合物，包括通过非肠道给药。

在使用载体进行治疗或者预防感染或其他症状时，所用载体的有效剂量可以通过医师评估载体的毒性、疾病的进展以及可能的抗载体抗体的产生情况来确定。通常，对于一般70公斤患者所使用的载体中净的核酸的等效剂量为大约1ug至1mg，用于递送核酸的载体的剂量可以根据产生等效量的治疗性核酸来进行计算。给药过程可以通过单次给药或分批给药来完成。核酸疫苗载体的毒性和疗效可通过在细胞培养物或实验动物中使用标准药学规程测定。

核酸疫苗可含有dna，rna，修饰的核酸，或它们的组合。在一些实施方式中，疫苗含有一种或多种克隆载体或表达载体；例如，疫苗可含有多种表达载体，每种都能够在哺乳动物细胞中自表达核酸编码区以产生至少一种免疫原性的多肽。表达载体通常含有真核细胞启动子序列，如真核细胞强启动子的核苷酸序列，其被可操作地连接到一个或多个编码区。本申请中的组合物和方法可以使用任意特定的真核细胞启动子，本领域中已知许多种类的真核启动子；如cmv或rsv启动子。该启动子可以跟宿主细胞是异源的。所使用的启动子可以是组成型启动子。

本申请组合物和方法适用的载体可以是，环化的或线性的，单链的或双链的，可以是质粒，粘粒，附加体。在一个适用的实施方式中，每个核酸编码区位于不同的载体上；但是，应知一种或多种编码区可以位于单个载体中，并且这些编码区可以受单个或者多个启动子调控。

许多质粒可用于生产核酸疫苗。采用构建体的核酸疫苗的实施方式中使用质粒vr1012(vicalinc.,sandiegocalif.)，pcmvi.ubf3/2(s.johnston,universityoftexas)或pcdna3.1(invitrogencorporation,carlsbad,calif.)作为载体。此外，载体构建体可以含有免疫刺激序列(iss)，如未甲基化的dcpg基序，该基序能够刺激动物的免疫系统。核酸疫苗还可以编码含有免疫原性多肽的融合产物。质粒dna还可以使用减毒细菌作为递送系统进行递送。一种适用于dna疫苗的方法中，dna疫苗使用口服方式给药。使用独立复制的质粒转化细菌，减毒细菌在宿主细胞中死亡后，该质粒随后释放到宿主细胞胞质中。

将核酸递送到动物中的另一种方法使用了病毒或细菌载体。合适的病毒载体的实施例包括，腺病毒，脊髓灰质炎病毒，痘病毒如牛痘，金丝雀痘和禽痘，疱疹病毒包括河鲶疱疹病毒，腺病毒相关载体，以及逆转录病毒。细菌载体的实施例包括，减毒形式的沙门氏菌、志贺氏菌、鲶鱼爱德华氏菌、鲁克氏耶尔森菌以及单核细胞增多性李斯特菌。在一些实施方式中，核酸是载体例如质粒，其能够自身表达那些编码免疫原性多肽的核酸序列。

f.疫苗的应用

本申请所述肺炎链球菌疫苗可用于预防和/或治疗肺炎链球菌疾病。相应地，本申请提供了一种治疗那些感染了肺炎链球菌的对象或容易感染肺炎链球菌的对象的方法，该方法包括给予有效剂量的任意本申请所述的疫苗制剂。在一些方面，该方法抑制了肺炎链球菌在个体中的定植。在一些方面，该方法抑制了肺炎链球菌的症状。接受疫苗的对象可以是雄性或雌性，也可以是未成年个体或成年个体。在一些实施方式中，接受疫苗的对象是人类。在其他实施方式中，该对象是非人类的动物。

1.预防用途

在预防用途的实施方式中，可以将疫苗给予受试对象以激发其免疫应答，该免疫应答可以帮助抵抗肺炎链球菌侵入，例如，通过抵抗肺炎链球菌的定植、抵抗疾病发生的第一步和必须的步骤来实现预防作用。因而，在一些方面，该方法抑制了肺炎链球菌对未定植对象或未感染对象的感染。在另一方面，该方法可以减少已定植个体中的定植时间。

在一些实施方式中，本申请的疫苗组合物可以赋予保护性免疫力，接种疫苗后，接受免疫的个体的症状产生被延缓，或缓解症状的严重性。在某些实施方式中，症状的严重性被缓解了至少25％，40％，50％，60％，70％，80％，甚至90％。在特定的实施方式中，疫苗免疫的个体在接触肺炎链球菌后可能表现出无症状，不被肺炎链球菌定植，或两种情况都发生。保护性免疫往往是通过以下一种或多种机制实现的：黏膜免疫，体液免疫或者细胞免疫。黏膜免疫主要是呼吸道、肠道和泌尿生殖道黏膜表面的分泌型iga(siga)抗体作用的结果。siga抗体由一系列抗原处理细胞、b淋巴细胞和t淋巴细胞介导的事件所产生，这些事件可以使体内黏膜覆盖组织的b淋巴细胞产生siga。体液免疫通常是血清中的igg抗体和igm抗体所致。细胞免疫可以通过细胞毒性t淋巴细胞来实现，或者通过巨噬细胞和t淋巴细胞参与的迟发型超敏反应来实现，以及通过t细胞参与的其他抗体非依赖型机制实现。特别地，细胞免疫可由th1或th17细胞介导。

基本上，任何个体都具有一定被肺炎链球菌感染的风险。但是，某些亚群具有更高的感染风险。在一些实施方式中，可以将本申请所述的疫苗制剂(例如，含有表1或表2中的一种或多种多肽的组合物，或者含有编码这些多肽的核酸的组合物，或者含有可以与这些多肽反应的抗体的组合物)给予那些免疫功能不全的患者。

医疗过程中产生免疫功能不全的症状，这可能是因为将个体暴露在肺炎链球菌感染的高风险之下。可以在进行那些已知会导致免疫功能受损的治疗之前或者过程中，对那些具有免疫功能不全的个体可能会遭受的感染实施预防性的治疗。在实施那些已知会导致免疫功能受损的治疗之前或过程中，可以使用具有抗原性质的组合物(例如，表1或表2中的两种或多种抗原，或编码这些抗原的核酸)或者那些可以与表1或表2中的两种或多种抗原反应的抗体来进行预防性的治疗，这可以预防随后的肺炎链球菌感染或者降低个体因为免疫功能不全症状而遭受感染的风险。如果个体遭受了肺炎链球菌感染，例如，在进行那些会引起免疫功能不全症状的治疗后引起感染，还可以通过对个体施用抗原组合物来治疗引起的感染。

以下的群体具有较高的风险遭受肺炎链球菌疾病或其并发症，因此属于以下一组或者多组中的对象使用本申请中的疫苗制剂进行免疫接种将会使其受益：儿童，特别是1个月至5岁大小，或两个月至2岁大小的儿童；具有无脾症、脾脏功能不全或镰刀状细胞贫血症的至少2岁大的儿童；具有肾病综合症、慢性脑脊髓液渗漏、hiv感染或其他与免疫抑制相关症状的至少2岁大的儿童。

在另一实施方式中，如下具有感染肺炎链球菌疾病或其并发症高风险的成年人使用至少一次肺炎链球菌抗原组合物进行免疫接种：所有65岁以上的人群；具有无脾症、脾脏功能不全或镰刀形细胞贫血症的成年人；具有以下症状的成年人：慢性心血管疾病，肝硬化，酗酒，慢性肾病，肾病综合症，糖尿病，慢性脑脊髓液渗漏，hiv感染，aids以及其他免疫抑制相关症状(霍金斯症，淋巴瘤，多发性骨髓瘤，器官移植产生的免疫抑制)，耳蜗植入个体；具有长期健康问题的个体如心脏病和肺病，以及正在使用或接受那些会降低身体对感染的抵抗力的药物或治疗的个体，如使用长效类固醇类药物，某些癌症药物，放射性治疗；阿拉斯加以及某些美国原住人群。

2.治疗用途

在一些治疗性应用中，疫苗可以施用于那些遭受肺炎链球菌感染的患者中，其用量足以治疗患者。治疗患者，在这种情况下，是指缓解感染个体中肺炎链球菌的症状、细菌的量，或者二者。在一些实施方式中，治疗患者是指减少症状的持续时间或减少症状的强度。在一些实施方式中，疫苗降低了接种免疫患者中肺炎链球菌的传播性。在某些实施方式中，上述降低程度至少为25％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，乃至90％。

在治疗性实施方式中，疫苗对感染后的个体使用。该疫苗可在感染后短时间内给药，例如，在出现症状之前，或可以在症状显现时或显现之后给药。

治疗性肺炎链球菌疫苗能减少肺炎链球菌感染所产生症状的各种指标的强度和/或缩短症状的持续时间。肺炎链球菌的感染可以很多形式发生。在一些事例中，感染的患者会发生肺炎，急性窦炎，中耳炎(耳部感染)，脑膜炎，菌血症，败血症，骨髓炎，脓毒性关节炎，心内膜炎，腹膜炎，心包炎，蜂窝组织炎，或脑脓肿。

3.疫苗效力的分析

除以上所述的临床结果以外，使用本申请的疫苗接种后产生的效力还可以使用多种方法测定。首先，可以通过刺激接种疫苗个体中的t细胞来检测il-17的水平(特别是il-17a)。得到的il-17水平可与相同对象接种疫苗前的il-17水平进行比较。il-17水平(例如，il-17a)的提高，例如，提高了1.5倍，2倍，5倍，10倍，20倍，50倍或100倍或者更多，这表明对疫苗的应答得到了提高。另外一种(或者结合使用)的方法是，可以通过检测存在于t细胞中的嗜中性粒细胞或者患者体内杀灭肺炎链球菌抗体的量来测定效力。肺炎链球菌杀灭的提高，如提高1.5倍，2倍，5倍，10倍，20倍，50倍或100倍或更高，这表明对疫苗应答得到了提高。此外，还可以测定th17细胞的激活程度，其中th17细胞的激活，如激活1.5倍，2倍，5倍，10倍，20倍，50倍或100倍或更高，这与对疫苗应答的增高相关。还可以测定那些特异针对疫苗的抗体的水平，特异抗体水平的增高，例如，1.5倍，2倍，5倍，10倍，20倍，50倍或100倍或更高，这与疫苗效力的增高相关。在某些实施方式中，可以使用两种或者多种这些分析方法。例如，可以测定il-17的水平，以及疫苗特异抗体的水平。或者，可以根据流行病学标志物，如比较接种疫苗个体和未接种疫苗个体之间肺炎链球菌感染的发生率，严重性，或持续时间来分析。

疫苗效力还可以在各种模式系统中分析，如小鼠模型。例如，可以使用balb/c或c57bl/6品系的小鼠。在对对象施用测试疫苗以后(单剂量使用或多剂量使用)，实验者对其施用具有攻击剂量的肺炎链球菌。在有些情况中，攻击剂量足以在未接种疫苗动物中引起肺炎链球菌的定植(特别是鼻腔定植)，而在有些情况中，攻击剂量足以在未接种疫苗动物中导致较高的致死率。人们可以由此测定在接种疫苗动物中定植的减少或死亡率的减少。实施例5和6示出了表1中的多肽在小鼠模型中抑制肺炎链球菌鼻腔定植的效力。

g.免疫原性组合物的应用

1.防护肺炎链球菌感染

本申请所公开的免疫原性组合物被设计用来引发针对肺炎链球菌的免疫应答。本申请所述组合物(例如，含有一种或多种表1或表2中所列的多肽的组合物，或者含有编码这些多肽的核酸的组合物)可以在给药哺乳动物中刺激抗体应答或细胞介导的免疫应答，或二者同时发生。在一些实施方式中，该组合物刺激th1偏好的cd4+t细胞应答，th17偏好的cd4+t细胞相应，或cd8+t细胞相应；在使用单成分组合物的情况时，该组合物可以刺激抗体应答，th1偏好的cd4+t细胞应答，th17偏好的cd4+t细胞应答，和/或cd8+t细胞应答。

在某些实施方式中，该组合物(例如，含表1或表2中一种或多种多肽的组合物，或者含有编码这些多肽的核酸的组合物，或者含有那些可以与这些多肽反应的抗体的组合物)包括细胞因子或者编码细胞因子如il-17的核酸编码区，从而可以对哺乳动物免疫系统产生额外的刺激。在某些实施方式中，该组合物含有细胞因子如il-17。

在此不希望受理论束缚，一些实施方式中，th17细胞的应答有益于增强本申请所述组合物的免疫应答，该组合物例如含有一种或多种表1或表2中的多肽。在某些实施方式中，激活的th17细胞应答有益于清除肺炎链球菌感染。例如，缺乏il-17a受体的小鼠对于肺炎链球菌攻击表现出削弱的基于全细胞疫苗的保护(lu等人,"interleukin-17amediatesacquiredimmunitytopneumococcalcolonization."plospathog.2008sep19；4(9))。此外，同作者证明了在使用全细胞疫苗处理后的小鼠中il-17a应答水平得到了提高。

因而，本申请提供了一种提高il-17产生的方法，该方法通过对对象施用本申请所述组合物(例如，含有表1或表2中的一种或多种多肽的组合物)来实现。此外，本申请提供了一种通过对对象施用所述组合物来激活th17细胞的方法。在某些实施方式中，增高的il-17a水平能增高嗜中性粒细胞或类嗜中性粒细胞对肺炎链球菌的杀灭，例如，通过诱导招募和激活嗜中性粒细胞和类嗜中性粒细胞。在某些实施方式中，这种肺炎链球菌杀灭是不依赖于抗体和补体的。但是，特异性抗体的产生和补体激活对于清除肺炎链球菌感染可以是有益的额外机制。

本申请还提供了含有免疫原性多肽或含有编码免疫原性多肽的多聚核苷酸以及药用载体的免疫原性组合物。

在一些实例中，免疫原性组合物含有一种或多种编码了seqidnos：1-13中的一种或多种多肽的核酸，如选自seqidnos：24-31中的一种或多种核酸。在一些实施方式中，这些核酸在免疫的个体中表达，产生其所编码的肺炎链球菌抗原，然后产生的肺炎链球菌抗原能够在免疫的个体中产生免疫刺激效果。

这样的含有核酸的免疫刺激组合物可以含有，例如，复制起始元件，以及驱使那些编码一种或多种seqidnos：1-13中多肽的一种或多种核酸表达的启动子。这样的组合物还可以含有插入了启动子(有时是病毒强启动子)的细菌质粒载体，编码一种或多种seqidnos：1-13中多肽的一种或多种核酸序列，以及多聚腺苷酸/转录终止序列。在一些实例中，所述核酸是dna。

h.诊断用途

本申请特别提供了快速、经济、灵敏并且特异的方法检测患者中的肺炎链球菌。在这个方面，这将有益于所有医院和医师对肺炎链球菌感染或具有感染风险的患者进行检查和治疗。检测试剂盒能非常容易的在任何本地医院实验室中构建，并且抗体及其抗原结合部分可容易的制作给所有医院用于治疗感染了肺炎链球菌或具有感染风险的患者。在这里，“患者”是指感染了肺炎链球菌的个体(例如，人类)或者具有感染肺炎链球菌倾向的个体(例如，人类)。患者可以是已经感染了肺炎链球菌的个体(例如，人类)，或者那些从肺炎链球菌感染后康复的具有感染肺炎链球菌倾向的个体(例如，人类)，和/或感染状态未知的个体(例如，人类)。

在一些实施方式中，可以使用两种或者更多种抗体进行诊断分析以检测个体中存在的肺炎链球菌，其中每种抗体与表1或表2中的一种抗原结合。本申请还提供了对疑似感染肺炎链球菌患者的生物样品进行表型分析的方法：(a)从患者处获得生物样品；(b)在可以使抗体或抗原结合部分与肺炎链球菌抗原表位结合的条件下，使样品与两种或多种肺炎链球菌特异的抗体或抗原结合部分接触；其中，发生结合表明样品中存在肺炎链球菌。在一些实施方式中，将跟生物样品的结合情况和使用相同抗体与阴性对照组织结合情况进行比较，其中如果跟阴性对照组织相比，生物样品表现出肺炎链球菌存在的结果，该患者就被认为可能感染了肺炎链球菌。在一些实例中，一种抗体的结合表明存在肺炎链球菌；在其他实例中，两种或多种抗体的结合表明存在肺炎链球菌。上述的测试可以适当的调整以检测其他的细菌感染，例如，通过使用与表1中所述的一种蛋白的同源物(来源于其它细菌种)具有免疫反应的抗体。在一些实施方式中，针对表1或表2中肺炎链球菌蛋白的抗体也能够结合其他链球菌属物种的同源蛋白，特别是当同源物具有很高百分比的序列一致性的时候。

另外，还可以使用表1或表2中的抗原来检测个体中存在的抗肺炎链球菌抗体。本申请也提供了对疑似感染了肺炎链球菌患者的生物样品进行表型分析的方法：(a)从患者处获得生物学样品；(b)在可以使抗原(或其部分)与存在于样品中的任何宿主抗体结合的条件下，使样品与两种或多种选自表1或表2的肺炎链球菌特异抗原或其部分相接触；其中，发生结合表明样品中存在抗肺炎链球菌抗体。在一些实施方式中，将跟生物样品的结合情况和使用相同抗原与阴性对照组织结合情况进行比较，其中如果跟阴性对照组织相比生物样品表现出抗肺炎链球菌抗体存在的结果，该患者就被认为可能(1)感染了肺炎链球菌，或者(2)过去曾感染过肺炎链球菌。在一些实例中，检测出一种抗体存在表明当前或过去感染过肺炎链球菌；在其他实例中，检测出两种或多种抗体的存在表明当前或过去感染过肺炎链球菌。上述的测试可以适当的调整以检测其他的细菌感染，例如，通过使用与表1中蛋白的同源物(来源于其它细菌种，例如链球菌属)。

在一些实施方式中，哺乳动物细胞的免疫细胞应答可以在体外定量检测。用于这种定量的方法包括对体外培养的哺乳动物t细胞使用本申请公开的组合物，然后定量检测哺乳动物t细胞因应答该组分所产生的细胞因子的变化。在这些方法中，细胞因子可以是，例如，il-17。

肺炎链球菌抗体与抗原(例如，表1或表2中的多肽)的结合可使用任何适用的方法来进行检测。这些方法包括elisa(酶联免疫吸收剂分析)，western杂交，竞争结合分析，以及点杂交。检测步骤可以是，例如，化学发光，荧光或比色分析。一种适于测量抗体-蛋白结合的方法是使用luminexxmap系统，该系统中多肽与含有染料的微球结合。某些系统，包括xmap系统，可用于同时测量一些不同的标志物，并且可以一次测得这些抗体的水平。在一些实施方式中，使用了其他系统同时检测大量标志物。例如，检测可使用以下任意系统进行：抗原微阵列，微珠微阵列，nanobarcodes颗粒技术，cdna表达文库产生的阵列蛋白，蛋白原位阵列，活体转化株蛋白阵列，通用蛋白阵列，芯片实验室微流体装置，以及多肽针。另一种类型的临床检测方法是化学发光检测抗体结合。在一些这样的分析中，包括vitrosecianti-hcv检测，抗体与液体悬浮液中那些由微粒组成的固相支持物相结合，使用表面荧光光度计来定量酶反应所产生的荧光产物。

在一些实施方式中，如果生物样品表现出肺炎链球菌的存在(例如，通过检测表1或表2中的一种或多种多肽，或者检测结合一种所述多肽的抗体)，可以对患者施用有效剂量的本申请所述的组合物和治疗方法。生物学样品可以包括，例如，血液，精液，尿液，阴道分泌物，粘液，唾液，排泄物，尿液，脑脊髓液，或者组织样品。在一些实施方式中，生物样品是待移植的器官。在某些实施方式中，进行检测步骤之前，生物样品首先在培养条件下培养以促进肺炎链球菌的生长。

本申请中的诊断测试(例如，那些检测表1或表2中多肽的测试或检测结合一种所述多肽的抗体的测试)可用于检测各种样品中的肺炎链球菌存在，包括从患者获得的样品以及其他来源获得的样品。例如，诊断测试可用于检测食品，饮料，或食品和饮料原料中的肺炎链球菌；物品中的肺炎链球菌，这些物品例如是医疗仪器，医疗设备如耳蜗植入物和起搏器，鞋子，衣物，家具包括医院家具，以及窗帘包括医院窗帘；或者从环境中如植物样品中获得的样品中的肺炎链球菌。在一些实施方式中，本申请中的测试可施用于动物中取得的样品，如农业牲口(牛，猪，鸡，山羊，马等牲口)，宠物(狗，猫，鸟等)，或者野生动物。在某些实施方式中，本申请的测试可施用于细胞培养物获得的样品，如用于产生治疗用蛋白的人类细胞培养物，用于产生有用的生物分子的细菌培养物，或用于研究目的的细胞培养物。

本申请也提供了测定患者中肺炎链球菌感染部位的方法，其包括：(a)给予患者含有标记的肺炎链球菌抗体或其抗原结合部分的药物组合物，以及(b)检测标记，其中结合信号指明了患者中特定部位存在肺炎链球菌感染。这样的诊断方法还可包括将患者中的结合情况与对照组比较。在某些实施方式中，该方法进一步包括，如果患者存在肺炎链球菌感染，则给予患者治疗有效量的肺炎链球菌结合抗体或其抗原结合部分来治疗感染。在某些实施方式中，该方法进一步包括，如果患者存在肺炎链球菌感染，则给予患者治疗有效量的表1中的肺炎链球菌蛋白或其免疫原性部分以治疗感染。该方法可进一步包括测定患者中肺炎链球菌的位置和/或感染面积。该方法可用于评估患者中肺炎链球菌的扩散情况并决定是否适于使用局部疗法。

在一些实施方式中，本法明所述抗肺炎链球菌抗体可以用来预测感染的进展情况。在一些实施方式中，本申请的抗肺炎链球菌抗体可在患者中取得的样品中检测到。如果抗体呈正常水平，这表明患者已产生了抵抗肺炎链球菌的免疫应答。如果抗体呈阴性，或存在水平较低，这表明患者并未产生足够的抵抗肺炎链球菌的应答，需要推荐进行更加积极的治疗。在一些实施方式中，抗体存在水平较低是指该水平要少于具有正常免疫系统的患者中的抗体水平的50％，20％，10％，5％，2％，或1％。抗体可通过使用本申请所述的任意抗原(例如，表1和/或表2中所列出的抗原)的亲和力检测，例如使用elisa方法。

在一些实施方式中，特异的肺炎链球菌抗原(例如，表1和/或表2中所列出的抗原)的检测可用于预测患者中肺炎链球菌感染的进展和症状。本领域的技术人员应知该方法并不局限于肺炎链球菌的检测。其他实施方式包括检测相关细菌，这些细菌包括那些含有表1或表2中所述蛋白同源蛋白的细菌。这些相关的细菌包括，例如，链球菌属中的其他菌种。

i.剂量与给药途径

1.剂型，剂量，和用药时间

每剂疫苗或免疫原性组合物中抗原的量选用为有效量，该剂量不管是以单剂量形式给药还是以多剂量形式给药都能引发如上文所述的预防性的或治疗性的应答。优选的，该剂量在通常的疫苗中不会引起明显的副作用。这种剂量可以根据所用的具体抗原而变化。通常来说，剂量会含有1-1000ug蛋白，在某些实例中含有2-100ug，例如4-40ug。在一些方面，该疫苗制剂含有1-1000ug多肽和1-250ug佐剂。在一些实施方式中，被递送的抗原的合适剂量取决于施用对象的年龄、体重以及健康状况(例如，免疫功能不全的状态)。如存在佐剂，通常佐剂存在的量的范围是每剂1ug-250ug，例如，50-150ug，75-125ug或100ug。

在一些实施方式中，通过只给予一次疫苗来实现上述的结果。在其他实施方式中，在接受初次免疫后，对象还接受了一次或多次强化接种，总共接受了2次、3次、4次或5次疫苗接种。有利的是，该数字是3或更少。强化疫苗接种可以在例如初次接种之后大约1个月、2个月、4个月、6个月或12个月后进行，从而使得接种方案包括了在0、0.5-2和4-8个月时间的给药。分批次疫苗给药可能是有利的，其可以通过相同的途径或者不同的途径给药。

本申请所述疫苗和免疫原性组合物可以各种剂型存在。在某些实施方式中，所述组合物以固体或粉末(例如，冻干粉末)形式提供；也可以以溶液形式提供。在某些实施方式中，提供的剂型是一次剂量的冻干粉末组合物和至少一份单独灭菌容器存放的稀释剂。

在一些实施方式中，组合物按照剂量逐渐增加的方式给药，这样接下来给药的组合物相比上次给药含有更高的浓度。在一些实施方式中，组合物按照每次给药组合物比上次给药的浓度更低的方式给药。

在治疗性应用中，将组合物给予那些遭受疾病感染的患者，所用的量足以治疗该患者。本申请所述组合物的治疗性应用包括降低传播性，减缓疾病发展，降低细菌的生存力或复制力，或者抑制其毒性蛋白的表达，例如，降低至没有使用组合物治疗的个体中程度的90％，80％，70％，60％，50％，40％，30％，20％，或10％的水平。

在预防性实施方式中，将组合物给予人类或者其他哺乳动物以诱发免疫应答，该免疫应答可以抑制感染性疾病或其他症状的发生。在一些实施方式中，组合物可以部分地抑制细菌发生感染。

在一些实施方式中，该组合物与抗生素联合施用。这种联合用药特别适用于将药物组合物用于治疗那些已经接触过(或者疑似最近曾接触过)肺炎链球菌的患者。许多抗生素都可以用于治疗肺炎链球菌感染，包括青霉素，羟氨苄青霉素/克拉维酸，头孢呋辛，头孢噻肟，头孢曲松以及万古霉素。可以根据感染的类型、严重性以及任何已知感染的抗生素耐药性来选用合适的抗生素(jacobsmr"drug-resistantstreptococcuspneumoniae:rationalantibioticchoices"amjmed.1999may3；106(5a):19s-25s)。

2.给药途径

本申请的疫苗制剂和药物组合物可以通过一定的给药方式施用于个体，通常通过全身给药(例如，静脉给药，腹膜内给药，肌内给药，真皮内给药，皮下给药，真皮下给药，透皮给药，颅内给药，鼻内给药，黏膜给药，直肠给药，阴道给药，口服，含服或者吸入式给药)或通过局部应用的方式给药。在一些实施方式中，给药途径是肌肉注射。在其他实施方式中，给药途径是皮下注射。在另一些实施方式中，给药途径是黏膜给药。在某些实施方式中，给药途径是透皮给药或真皮内给药。

某些给药途径特别适用于含有特定佐剂的疫苗制剂和免疫原性组合物。特别地，透皮给药适用于那些含有毒素(例如霍乱毒素或不稳定毒素)的肺炎链球菌疫苗；在其他的实施方式中，给药途径为鼻内给药。使用甲病毒复制子配制的疫苗可以使用例如肌肉注射或皮下注射的途径给药。含有单磷酰脂a(mpl)，海藻糖dicoynomycolate(tdm)以及双十八烷基二甲基溴化铵(dda)适合(除其他方式外)肌肉注射和皮下注射途径给药。含有雷西莫特(resiquimod)的疫苗可以使用例如局部给药或皮下注射的方式给药。

3.配方

疫苗制剂或免疫原性组合物可适用于对人类患者给药，疫苗或免疫组合物的制备可遵循usfda指导方针来进行。在一些实施方式中，疫苗制剂或免疫原性组合物适用于对非人类的动物给药。在一些实施方式中，疫苗或免疫原性组合物基本上不含有内毒素或外毒素。内毒素可包括热原，如脂多糖(lps)分子。疫苗或免疫原性组合物还可以基本不含有失活蛋白片段，该失活蛋白可能会引起发热或其它副作用。在一些实施方式中，该组合物含有少于1％、少于0.1％、少于0.01％、少于0.001％或少于0.0001％的内毒素、外毒素和/或失活蛋白片段。在一些实施方式中，疫苗或免疫原性组合物比工业用水、自来水或蒸馏水含有更低水平的热原。其他的疫苗或免疫原性组合物成分可使用本领域所公知的方法进行纯化，例如离子交换色谱，超滤，或者蒸馏。在其他实施方式中，热原可在对患者施用之前进行失活或破坏。制备疫苗的原料例如水、缓冲液、盐以及其他化学物质也可以进行筛查并去除热原。疫苗中的所有材料都可以是无菌的，每批疫苗都可以进行无菌测试。因而，在某些实施方式中，疫苗中的内毒素水平低于usfda的要求，例如，用于鞘内注射的组合物的产品中内毒素含量为0.2(eu)/kg；非鞘内注射组合物的产品中内毒素含量为5eu/kg，无菌水中内毒素含量为0.25-0.5/ml。

在某些实施方式中，制备物中含有少于50％，20％，10％或5％(干重)的污染蛋白。在某些实施方式中，所需分子中基本上不含有其他生物大分子，例如其他的蛋白(特别是那些会在纯化制备物或在再造混合物发挥功能的时候可能会基本上屏蔽、消除、混淆或改变成分蛋白特性的其他蛋白)。在某些实施方式中，至少存在80％，90％，95％，99％或99.8％(干重)的相同类型生物大分子(水，缓冲液，以及其他小分子除外，特别是分子量小于5000的分子可以存在)。在一些含有纯化的蛋白亚基的疫苗或免疫原性组合物的实施方式中，相对于纯化的亚基，其中含有来自表达亚基蛋白的宿主细胞中的蛋白含量小于5％，2％，1％，0.5％，0.2％，0.1％。在一些实施方式中，所需多肽基本不含有核酸和/或碳水化合物。例如，在一些实施方式中，疫苗或免疫原性组合物含有少于5％，少于2％，少于1％，少于0.5％，少于0.2％，或少于0.1％的宿主细胞dna和/或rna。在某些实施方式中，制备物中至少存在80％，90％，95％，99％，或99.8％(干重)相同类型的生物大分子(但是可以存在水，缓冲液，以及其他小分子，特别是分子量小于5000的分子)。

疫苗或免疫原性组合物优选的为具有低毒性或没有毒性，具有合理的风险-收益比。在某些实施方式中，疫苗或免疫组合物含有成分的浓度低于免疫接种动物的ld50测量值。ld50测量值可通过小鼠或其他实验模式系统来获得，并由此推测人和其他动物中的值。用于评估化合物在人和其他动物中的ld50值的方法为本领域所公知。疫苗制剂或免疫原性组合物以及其中的任何成分在大鼠中的ld50值可以是大于100g/kg，大于50g/kg，大于20g/kg，大于10g/kg，大于5g/kg，大于2g/kg，大于1g/kg，大于500mg/kg，大于200mg/kg，大于100mg/kg，大于50mg/kg，大于20mg/kg或大于10mg/kg。含有毒素如肉毒杆菌毒素(其可用作佐剂)的疫苗制剂或免疫原性组合物所含的肉毒杆菌毒素应明显小于其ld50。

疫苗制剂或药物组合物的适宜配方根据给药的途径而异。适用于非肠道给药例如关节内(关节中)、静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、鼻腔内以及皮下注射途径给药的配方包括，水相的和非水相的等渗无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂，缓冲液，抗菌剂以及可以使配方与受体血液等渗的溶质，以及水相的和非水相的无菌悬浮液，其可以含有悬浮剂、增溶剂、，增稠剂、稳定剂和防腐剂。该制剂可以存放在单位剂量或多剂量的密封容器中，例如安瓶或药瓶。

注射溶液和悬浮液可以由上述类型的无菌粉末、颗粒和药片制备获得。在继承性转移治疗性t细胞的情况下，细胞可以通过静脉注射的方式或非肠道的途径给药。

适用于口服给药的配方可以由如下成分组成：(a)液体溶液，如有效剂量的多肽或悬浮在稀释剂如水、盐水或peg400中的封装核酸；(b)胶囊、小袋药粉或药片的形式，每种都含有预定剂量的以液体、固体、颗粒或凝胶体形式存在的活性成分；(c)在适宜液体中的悬浮液；以及(d)适宜的乳液。药片形式可以含有一种或者多种以下成分：乳糖，蔗糖，甘露醇，山梨醇，磷酸钙，玉米淀粉，土豆淀粉，黄芪胶，微晶纤维素，阿拉伯胶，凝胶，二氧化硅胶体，交联羧甲基纤维素钠，滑石粉，硬脂酸镁，硬脂酸，以及其他辅料，着色剂，填充剂，结合剂，稀释剂，缓冲剂，润湿剂，防腐剂，调味剂，染料，崩解剂，以及药学上可接受的载体。锭剂可以含有分散在调味剂中的活性成分，其中调味剂通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶，以及分散在惰性基质中的活性成分，其中惰性基质例如是凝胶和甘油或蔗糖与阿拉伯胶乳液、凝胶，以及那些除活性成分以外还含有本领域所公知的载体的类似物。药物组合物可以封装在例如脂质体中或者封装在那些能够缓慢释放活性成分的制剂中。

抗原可以单独或者与其他适宜的成分组合在一起后制成喷雾剂型(例如，它们可以被雾化)通过吸入方式给药。喷雾制剂可置于加压的可接受的推进剂中，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气及其类似物。喷雾剂型可通过口腔或鼻腔递送。

适用于阴道或直肠给药的剂型包括，例如，那些由多肽或封装的核酸以及栓剂基质所组成的栓剂。适宜的栓剂基质包括天然的或合成的甘油三脂或石蜡烃。此外，还可以使用凝胶直肠胶囊，其由多肽或封装核酸和基质构成，基质包括例如液体甘油三脂，聚乙二醇以及石蜡烃。

j.疫苗制剂和免疫原性组合物的制备和储存

本申请所述肺炎链球菌疫苗和免疫原性组合物可使用各种技术生产。例如，多肽可使用重组dna技术在适宜的宿主细胞中生产。适宜的宿主细胞可以是细菌，酵母，哺乳动物或者其他类型的细胞。宿主细胞可以进行修饰以表达外源拷贝的相关多肽基因之一。通常，该基因可操作的连接至合适的调控序列如强启动子和多聚腺苷酸序列。在一些实施方式中，启动子是诱导型的或可抑制的。根据纯化多肽的方法，还可以使用那些能够促使目标多肽分泌或排泄的其它调控序列或者促使目标多肽留在细胞质中或细胞膜上的其它调控序列。基因可以位于染色体外的质粒中，或被整合至宿主基因组中。本领域的技术人员应知并不必要使核酸的序列与天然存在的序列100％一致。相反，对这些序列的一些改变是可接受的并且有时是需要的。例如，核酸可以被修改以利用遗传密码简并性这一优点从而使得这样编码的多肽仍然相同。在一些实施方式中，该基因进行了密码子优化以提高在特定宿主中的表达水平。核酸可以通过，例如pcr或化学合成的方法制备。

制备重组细胞系后就可以从中分离多肽。分离可以通过，例如，亲和力纯化技术或物理分离技术(例如，尺寸色谱柱)的方法完成。

在另一方面，本申请提供了一种生产方法，该方法包括将一种或多种多肽或免疫原性片段或其变体和载体和/或佐剂进行混合。

在一些实施方式中，免疫制剂和免疫原性组合物中所含抗原可使用细胞培养制备。一种方法包括：提供一种或多种表达载体以及编码一种或多种选自表1或表2中多肽的氨基酸序列的克隆核酸，然后对该多肽进行表达和分离。

本申请所述的免疫原性多肽，以及表达这些多肽的核酸组合物，可以进行包装，分装，以及制成试剂盒用于对哺乳动物施用核酸组合物。例如，可以提供含有一个或多个单位剂型的包装或分装。通常，化合物使用说明随包装提供，并在标签上提供了适宜的指示说明该化合物适用于哪些特定症状的治疗，例如本申请中所公开的那些症状。

在一些实施方式中，本申请提供了如下段落1-43中所述的疫苗制剂、治疗遭受肺炎链球菌感染的主体或者容易被肺炎链球菌感染的主体的方法以及具有免疫原性的组合物：

段落1.在一些实施方式中，本申请提供了一种疫苗制剂，其含有药学上可接受的载体以及一种或多种多肽，其中该多肽含有氨基酸序列，该氨基酸序列包含seqidnos：1-11中的任意序列或其免疫原性片段，可选地，该疫苗制剂进一步含有一多肽，其中该多肽含有氨基酸序列，该氨基酸序列含有seqidnos：12或13中的任一序列或其免疫原性片段。

段落2.根据段落1中的疫苗制剂，其中该疫苗制剂含有至少两种不同的多肽，这些多肽含有氨基酸序列，该氨基酸序列包含seqidnos：1-13中的任意序列或其免疫原性片段，其中至少一种所述多肽含有的氨基酸序列包含seqidnos：1-10中的任一序列或其免疫原性片段。

段落3.根据段落2中的疫苗制剂，其含有至少两种多肽，每种多肽属于(i)-(vi)组中不同的组：

(i)seqidno：1，或其免疫原性片段，

(ii)seqidnos：2-5之一，或其免疫原性片段，

(iii)seqidnos：6-7之一，或其免疫原性片段，

(iv)seqidno：8，或其免疫原性片段，

(v)seqidnos：9-10之一，或其免疫原性片段，以及

(vi)seqidnos：11-13之一，或其免疫原性片段。

段落4.根据段落1中的疫苗制剂，其中该疫苗制剂含有至少3种不同的多肽，这些多肽含有氨基酸序列，该氨基酸序列包含seqidnos：1-13中的任意序列或其免疫原性片段，其中，至少一种所述多肽含有的氨基酸序列包含seqidnos：1-10中的一条序列。

段落5.根据段落4中的疫苗制剂，其含有至少3种多肽，每种多肽属于(i)-(vi)组中不同的组：

(i)seqidno：1，或其免疫原性片段，

(ii)seqidnos：2-5之一，或其免疫原性片段，

(iii)seqidnos：6-7之一，或其免疫原性片段，

(iv)seqidno：8，或其免疫原性片段，

(v)seqidnos：9-10之一，或其免疫原性片段，以及

(vi)seqidnos：11-13之一，或其免疫原性片段。

段落6.根据段落1-5中的疫苗制剂，其中所述的片段是seqidnos：1-13中的任意序列在其n末端、c末端或两端移除1-20个氨基酸残基后得到的截短片段。

段落7.根据段落1中的疫苗制剂，其中该疫苗制剂含有一种或多种多肽，该多肽包含的氨基酸序列由seqidnos：1-11中的任意序列组成。

段落8.根据段落1中的疫苗制剂，其含有多肽，该多肽含有的氨基酸序列包含seqidno：6序列。

段落9.根据段落1中的疫苗制剂，其含有多肽，该多肽含有的氨基酸序列包含seqidno：7序列。

段落10.根据段落1中的疫苗制剂，其含有多肽，该多肽含有的氨基酸序列包含seqidno：9序列。

段落11.根据段落1中的疫苗制剂，其含有多肽，该多肽含有的氨基酸序列包含seqidno：10序列。

段落12.根据段落1中的疫苗制剂，其中该疫苗制剂含有由seqidno：6组成的多肽，以及由seqidno：9组成的多肽。

段落13.根据段落1中的疫苗制剂，其中该疫苗制剂含有由seqidno：7组成的多肽，以及由seqidno：10组成的多肽。

段落14.根据段落1-13中任一项的疫苗制剂，该制剂含有多肽，该多肽所含的氨基酸序列包含seqidnos：1-13中的任意序列，除此之外该制剂基本上不含有其他肺炎链球菌多肽。

段落15.根据段落1中的疫苗制剂，其含有药学上可接受的载体以及一种或多种多肽，其中该多肽含有氨基酸序列，该氨基酸序列含有seqidnos：2，7，9，22和23中的任意序列或其免疫原性片段。

段落16.疫苗制剂，其含有药学上可接受的载体以及多肽，该多肽含有的氨基酸序列由seqidno：11或其免疫原性片段组成。

段落17.疫苗制剂，其含有药学上可接受的载体以及多肽，该多肽含有的氨基酸序列包含seqidno：12。

段落18.疫苗制剂，其含有药学上可接受的载体以及一种或多种多肽，其中这些多肽含有氨基酸序列，该氨基酸序列包含seqidnos：14-21中的任意序列或其免疫原性片段。

段落19.根据段落18中的疫苗制剂，其中该疫苗制剂含有至少两种不同的多肽，其中这些多肽含有氨基酸序列，该氨基酸序列含有seqidnos：14-21中的任意序列或其免疫原性片段。

段落20.根据段落19中的疫苗制剂，其含有至少两种多肽，每种多肽属于(i)-(iii)中不同的组：

(i)seqidnos：14-17之一，或其免疫原性片段，

(ii)seqidnos：18-19之一，或其免疫原性片段；以及

(iii)seqidnos：20-21之一，或其免疫原性片段。

段落21.根据段落18中的疫苗制剂，其中该疫苗制剂进一步含有一多肽，该多肽含有的氨基酸序列包含seqidnos：1-13中的任意序列。

段落22.根据段落18中的疫苗制剂，其中所述的片段是seqidnos：14-21中的任意序列在其n末端、c末端或两端移除1-20个氨基酸残基后得到的截短片段。

段落23.根据段落18中的疫苗制剂，其含有多肽，该多肽含有的氨基酸序列包含seqidnos：14-17中的任意序列。

段落24.根据段落18中的疫苗制剂，其含有多肽，该多肽含有的氨基酸序列包含seqidnos：18-19中的任一序列。

段落25.根据段落18中的疫苗制剂，其含有多肽，该多肽含有的氨基酸序列包含seqidnos：20-21中的任一序列。

段落26.根据段落1-25中任一项的疫苗制剂，其中所述多肽与具有免疫原性的载体相偶联。

段落27.根据段落1-25中任一项的疫苗制剂，其含有至少一种脂化多肽。

段落28.根据段落1-27中任一项的疫苗制剂，其进一步含有佐剂。

段落29.根据段落28中的疫苗制剂，其中所述佐剂为toll样受体(tlrs)的激动剂。

段落30.根据段落28中的疫苗制剂，其中所述佐剂为明矾。

段落31.根据段落28中的疫苗制剂，其中该疫苗制剂含有1-1000ug多肽以及1-250ug佐剂。

段落32.根据段落1-31中任一项的疫苗制剂，其接触th17细胞后能够诱导th17细胞产生至少1.5倍的应答。

段落33.根据段落1-31中任一项的疫苗制剂，其中该疫苗制剂抑制肺炎链球菌对未感染主体的感染。

段落34.根据段落1-31中任一项的疫苗制剂，其中该疫苗制剂抑制肺炎链球菌在个体中的定植。

段落35.根据段落1-31中任一项的疫苗制剂，其中该疫苗制剂抑制肺炎链球菌引起的症状。

段落36.治疗遭受肺炎链球菌感染的主体或者容易被肺炎链球菌感染的主体的方法，其包括给予有效量的如段落1-45中任一项所述的疫苗制剂。

段落37.根据段落36中的方法，其中该方法抑制了肺炎链球菌对未感染主体的感染。

段落38.根据段落36中的方法，其中该方法抑制了肺炎链球菌在个体中的定植。

段落39.根据段落36中的方法，其中该方法抑制了肺炎链球菌引起的症状。

段落40.根据段落36中的方法，其中该方法使用一次剂量来治疗主体。

段落41.根据段落36中的方法，其中该方法使用3次剂量来治疗主体。

段落42.根据段落36中的方法，其中该主体是人。

段落43.具有免疫原性的组合物，其含有药学上可接受的载体以及两种或更多种多肽，其中所述多肽含有的氨基酸序列包含任意以下序列：seqidnos:1-23和sp1574，sp1655，sp2106，sp1473，sp0605，sp1177，sp0335，sp0906，sp1828，sp2157，sp1229，sp1128，sp1836，sp1865，sp0904，sp0765，sp1634，sp0418，sp1923，sp1313，sp0775，sp0314，sp0912，sp0159，sp0910，sp2148，sp1412，sp0372，sp1304，sp2002，sp0612，sp1988，sp0484，sp0847，sp1527，sp0542，sp0441，sp0350，sp0014，sp1965，sp0117，sp0981，sp2229，sp2136，sp1179，sp1174，sp2216，sp1393，sp0641.1，sp1384，和sp2032，或它们的免疫原性片段。

实施例

实施例1.抗原鉴定和合并小鼠筛选

将肺炎链球菌tigr4基因组中所预测到的每个开放读码框都克隆至含有一标签的表达载体中，其中该标签可以被主要组织相容性复合体(mhc)递呈。每个构建体随后在大肠杆菌中表达，其全长表达情况使用替代分析(surrogateassay)来验证，该分析可以鉴定出mhc中的标签。该筛选过程在国际申请wo2010/002993进行了更加详细的描述。为了便于筛选大文库，将得到的文库进行合并，从而使每个孔中含有4个诱导的文库克隆。为了从那些已对肺炎链球菌产生免疫的小鼠中筛选出t细胞，将合并文库添加到那些来自腹膜的巨噬细胞中。巨噬细胞可以通过mhc来结合那些被标记的肺炎链球菌抗原。在37℃处理2小时后，巨噬细胞使用pbs清洗。然后巨噬细胞使用1％多聚甲醛固定15分钟，并进一步使用pbs充分冲洗。将10⁵t细胞添加到每个孔中，每个孔中有200ulrp-10。这些t细胞分离自那些使用灭活肺炎链球菌和霍乱毒素佐剂免疫2次的小鼠。酶联板在37℃温育72小时。每孔中il-17的量通过使用il-17elisa分析测定。阳性结果的阈值定为高于所有样品均值的2倍标准差。

实施例2.对呈阳性的小鼠抗原池进行去卷积(deconvolution)分析

接下来进行的第二轮筛选用于检测那些在实施例1合并筛选过程中观察到的每个呈阳性应答的孔中的4个克隆中哪个或哪些个抗原诱导了阳性应答。每个阳性合并池中的所有克隆各自都被添加到一对孔中的腹膜巨噬细胞上进行脉冲刺激。使用那些分离自跟初次筛选具有相同遗传背景的免疫小鼠来筛选脉冲刺激过的巨噬细胞，筛选同样使用实施例1中所述il-17分析方法。抗原如果在一对孔中所诱导的平均应答指标大于阴性对照样品平均值的两倍标准差，则认为其呈阳性应答。对存在于这些阳性克隆中的文库质粒进行测序以确证抗原的具体序列。使用这种方法鉴定出了以下抗原：sp_1574，sp_1655，sp_2106，sp_0148，sp_1473，sp_0605，sp_1177，sp_0335，sp_0906，sp_1828，sp_2157，sp_1229，sp_1128，sp_1836，sp_1865，sp_0904，sp_0882，sp_0765，sp_1634，sp_0418，sp_1923，sp_1313，sp_0775，sp_0314，sp_0912，sp_0159，sp_0910，sp_2148，sp_1412，sp_0372，sp_1304，sp_2002，sp_0612，sp_1988，sp_0484，sp_0847，sp_1527，sp_0542，sp_0441，sp_0350，sp_0014，sp_1965，sp_0117，和sp_2108。

实施例3.抗原鉴定与合并的人类筛选

cd4+t细胞以及cd14+单核细胞分离自捐助人外周血。在含gm-csf和il-4的培养基中培养后，单核细胞被诱导分化为树突细胞，其方法基本参照teddertf和jansepj的文献(1997"isolationandgenereationofhumandendriticcells."currentprotocolsinimmunologysupp23:7.32.1-7.32.16)。培养5天后，树突细胞铺种至384孔板。cd4+t细胞在培养基中扩增已确保足够的数量。

将肺炎链球菌tigr4基因组中所预测到的每个开放读码框都克隆至含有一标签的表达载体中，该标签可以被主要组织相容性复合体(mhc)递呈。每个构建体随后在大肠杆菌中表达，其全长表达情况使用替代分析验证，该分析可以鉴定出mhc中的标签。为便于筛选大文库，得到的文库进行合并从而使得每孔中含有4个诱导的文库克隆。为了筛选人t细胞，将合并文库添加至接种了树突细胞的384孔板中。在37℃温育2小时后，树突细胞使用1％多聚甲醛固定15分钟，并进一步使用磷酸盐缓冲液和赖氨酸缓冲液充分地冲洗。将分散在70ulrp-10培养基中的40000t细胞添加至384孔板的每个孔中。酶联板在37℃温育3天。每孔上清中il-17的量通过使用il-17elisa分析测定。在不同的筛选重复中，阳性结果的阈值设为高于所有样品均值的2倍标准差，高于阴性对照均值2倍标准差，或数据组平均数绝对偏差的1.78倍。阳性池子随后在实施例中进行去卷积分析。

实施例4.对呈阳性的人抗原池进行去卷积分析

对所有的抗原，去卷积分析通过比较两组合并筛选结果进行。在这个方法中，制备了两组不同的抗原池，这样一个多肽在第一个池子和第二个池子之间跟3种不同的多肽在一起。由此，可以通过鉴定在第一组和第二组都处在阳性结果的池子中的多肽来决定哪些多肽为抗原。在这种去卷积方法中，一个池子被认为呈阳性的标准为当其均值高于数据组平均数绝对偏差1.78倍时。

在至少两次重复的第二次筛选中都是阳性的抗原认为是阳性结果。使用上述方法鉴定出的抗原有：sp2108，sp0641，sp0024，sp0641.1，sp1072，sp1384和sp2032。

实施例5

sp2108，sp0148和sp1634多肽

将sp2108多肽(seqidno：9)，sp0148多肽(seqidno：7)和sp1634多肽(见表2)配制成疫苗组合物，该组合物使用了4ug多肽以及1ug霍乱毒素。对于组合制剂，则每种多肽各使用4ug。组合物通过鼻内给药给予c57bl/6小鼠三次，每次间隔1周。实验对象在休息3周后，取血检测免疫原性。肝素处理的全血使用眼眶取血法获得。全部pbmc使用灭活全细胞(wcc)或使用圆底管混合的3种多肽组合进行免疫3天刺激。然后收集上清液并使用elisa分析il-17水平。霍乱毒素本身(ct)或hsv(003)来源的无关抗原作为阴性对照。结果如图1和图2所示。受试对象在另外休息2周之后，使用鼻内给药的方式使用肺炎链球菌攻击。一周后处死实验对象，统计洗鼻液中的克隆形成单位的数量。结果如图3所示。

实施例6

sp0882和sp0314多肽

该实施例使用与实施例5相同的实验步骤，只是疫苗组合物只进行了2次给药。在这些实验中，sp0882多肽(seqidno：2)和sp0314多肽(见表2)与实施例5中的3种多肽共同使用。免疫原性分析的结果如图4和5所示。定植分析的结果如图6所示。

实施例7

sp1072，sp0641n，和sp0024多肽

本实施例使用类似实施例5的实验步骤，只是疫苗组合物只进行了2次给药，每次间隔一周。最后一次免疫进行4周后，小鼠以鼻腔给药的方式使用6b型肺炎链球菌活菌攻击。一周以后细菌负载使用选择性培养基中培养洗鼻液并计数cfu获得。从每只小鼠获得的cfu与其接种免疫的多肽做散点图。结果如图7所示。具有统计学上显著差异的结果在图中进行了标记(*，p值<0.05)。

实施例8

在balb/c小鼠中测试多肽sp0148，sp0314，sp0882和sp2108

为测定不同小鼠基因型能否产生相似的免疫应答，将数种多肽给予balb/c小鼠。所用实验方案类似实施例5，该小鼠先进行免疫接种，然后使用肺炎链球菌攻击，并记录cfu数目。该实验的实验结果如图8所示。

序列表

<110>健诺西生物科学公司

儿童医学中心有限公司

<120>抗肺炎链球菌的疫苗和组合物

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leulysasnalaphelyslysalametasplysglyalaargalaile

500505510

metvalvalasnthrvalasntyrtyrasnargaspasntrpthrglu

515520525

leuproalametglytyrglualaaspgluglythrlysserglnval

530535540

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545550555560

proasplyslysthrgluvallysargasnasnlysgluaspphelys

565570575

asplysleugluglntyrtyrproileaspmetgluserpheasnser

580585590

asnlysproasnvalglyaspglulysgluileaspphelyspheala

595600605

proaspthrasplysgluleutyrlysgluaspileilevalproala

610615620

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glylysserthrtyrgly

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成多肽

<220>

<221>mod_res

<222>(1)..(1)

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<220>

<221>mod_res

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151015

valprotyrthrglylysgluargargvalargileleuleuprolys

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210215220

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成多肽

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<220>

<221>mod_res

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151015

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asptyrglulysaspthraspargsertyrprovalvaltyrphehis

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100105110

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pheile

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<213>人工序列

<220>

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<220>

<221>mod_res

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<220>

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<220>

<221>mod_res

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<220>

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metserserlysphexaalysserxaaalavalleuglythrxaathr

151015

leualaserleuleuleuvalalacysxaaasnglnsertyrphetyr

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leulysmetlysgluhislysleulysvalprotyrthrglylysglu

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thrlysalaaspcysglnhisthralametileglyserserleugly

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glyasnilethrglnpheileglyleuglutyrglnxaaxaailegly

180185190

cysleuglyvalpheserseralaasntrpleuhisglnglualaphe

195200205

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proaspcysleuargphephealaglulystrp

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成多肽

<220>

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<222>(9)..(9)

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<220>

<221>mod_res

<222>(15)..(15)

<223>ala或val

<220>

<221>mod_res

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<220>

<221>mod_res

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<223>asn或tyr

<220>

<221>mod_res

<222>(88)..(88)

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<220>

<221>mod_res

<222>(104)..(104)

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<220>

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<220>

<221>mod_res

<222>(133)..(133)

<223>gly或glu

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metserserlysphexaalysserxaaalavalleuglythrxaathr

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leualaserleuleuleuvalalacysxaaasnglnsertyrphetyr

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leulysmetlysgluhislysleulysvalprotyrthrglylysglu

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859095

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100105110

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115120125

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gluphevalmetgluvalvallyspropheile

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成多肽

<220>

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phepheglyaspthrtyrleuproalaglualaaspilelys

245250

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成多肽

<220>

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<220>

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<221>mod_res

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<223>任意氨基酸

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<220>

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151015

alaalaglyxaaleualaalacysserglyglyalalyslysglugly

202530

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100105110

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glualatyrasnalagluhisthraspasnprothrileleuasntyr

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thrlysalaaspxaaglnglnilemetvalargleuseraspglygln

180185190

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195200205

asnglnglyleuaspxaaleulysvalilegluleuxaaseraspgln

210215220

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serphevalasplysargilelysgluleutyrlysaspglythrleu

245250255

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alaaspilelys

275

<210>20

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成多肽

<220>

<221>mod_res

<222>(18)..(18)

<223>val或ala

<220>

<221>mod_res

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<223>val或ile

<220>

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<223>val或ile

<220>

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<222>(83)..(83)

<223>任意氨基酸

<220>

<221>mod_res

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<223>ala或thr

<220>

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<222>(177)..(177)

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<222>(186)..(186)

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<220>

<221>mod_res

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<220>

<221>mod_res

<222>(208)..(208)

<223>val或ala

<220>

<221>mod_res

<222>(214)..(214)

<223>任意氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(237)..(237)

<223>gln或his

<220>

<221>mod_res

<222>(298)..(298)

<223>ser或ala

<220>

<221>mod_res

<222>(307)..(307)

<223>ala或ser

<220>

<221>mod_res

<222>(313)..(313)

<223>val或ala

<220>

<221>mod_res

<222>(348)..(348)

<223>asn或ser

<400>20

metcysglyserlysthralaasplysproalaaspserglyserser

151015

gluxaalysgluleuthrvaltyrvalaspgluglytyrlyssertyr

202530

ileglugluvalalalysalatyrglulysglualaglyvallysxaa

354045

thrleulysthrglyaspalaleuglyglyleuasplysleuserleu

505560

aspasnglnserglyasnvalproaspxaametmetalaprotyrasp

65707580

argvalxaaserleuglyseraspglyglnleusergluvallysleu

859095

seraspglyxaalysthraspaspthrthrlysserleuvalthrala

100105110

alaasnglylysvaltyrglyalaproalavalilegluserleuval

115120125

mettyrtyrasnlysaspleuvallysaspalaprolysthrpheala

130135140

aspleugluasnleualalysaspserlystyralaphealaglyglu

145150155160

aspglylysthrthralapheleualaasptrpthrasnphetyrtyr

165170175

xaatyrglyleuleualaglyasnglyxaatyrvalpheglyglnasn

180185190

glylysaspxaalysaspileglyleualaasnaspglyserilexaa

195200205

glyileasntyralaxaasertrptyrglulystrpprolysglymet

210215220

glnaspthrgluglyalaglyasnleuileglnthrxaapheglnglu

225230235240

glylysthralaalaileileaspglyprotrplysalaglnalaphe

245250255

lysaspalalysvalasntyrglyvalalathrileprothrleupro

260265270

asnglylysglutyralaalapheglyglyglylysalatrpvalile

275280285

proglnalavallysasnleuglualaxaaglnlysphevalaspphe

290295300

leuvalxaathrgluglnglnlysxaaleutyrasplysthrasnglu

305310315320

ileproalaasnthrglualaargsertyralagluglylysasnasp

325330335

gluleuthrthralavalilelysglnphelysxaathrglnproleu

340345350

proasnileserglnmetseralavaltrpaspproalalysasnmet

355360365

leupheaspalavalserglyglnlysaspalalysthralaalaasn

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<210>21

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成多肽

<220>

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<222>(6)..(6)

<223>met或thr

<220>

<221>mod_res

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<220>

<221>mod_res

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<220>

<221>mod_res

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<223>val或ile

<220>

<221>mod_res

<222>(97)..(97)

<223>val或ile

<220>

<221>mod_res

<222>(106)..(106)

<223>任意氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(123)..(123)

<223>ala或thr

<220>

<221>mod_res

<222>(200)..(200)

<223>thr或ala

<220>

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<222>(209)..(209)

<223>ala或gly

<220>

<221>mod_res

<222>(219)..(219)

<223>ala或pro

<220>

<221>mod_res

<222>(231)..(231)

<223>val或ala

<220>

<221>mod_res

<222>(237)..(237)

<223>任意氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(260)..(260)

<223>gln或his

<220>

<221>mod_res

<222>(321)..(321)

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<220>

<221>mod_res

<222>(330)..(330)

<223>ala或ser

<220>

<221>mod_res

<222>(336)..(336)

<223>val或ala

<220>

<221>mod_res

<222>(371)..(371)

<223>asn或ser

<400>21

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<212>prt

<213>肺炎链球菌

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202530

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leuaspleualaproglnvalproargaspprothrmetleuthrser

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lysasnargleuglnleuleuaspgluleualaglnhislysargphe

65707580

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leuargtyrleulysasnphephealahishisprolysglnlysval

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<212>prt

<213>肺炎链球菌

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859095

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<213>肺炎链球菌

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gataaaaattattggttgagtgataaaatccctcatgcgttcaattattataatggtggc780

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caagctattcgggcattaagaaaagcaggcattccaatggttgtcgctacgggtaactat1140

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gacactggaaatgtaacacgaactgcagcacatgaagatgcgatagcggtcgcttctgct1260

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aatataggggcctttttcgataagagtaaaatcacaacaaatgaagatggaacaaaagct1380

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tacaatagagataattggacagagcttccagctatgggatatgaagcggatgaaggtact1620

aaaagtcaagtgttttcaatttcaggagatgatggtgtaaagctatggaacatgattaat1680

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caatactatccaattgatatggaaagttttaattccaacaaaccgaatgtaggtgacgaa1800

aaagagattgactttaagtttgcacctgacacagacaaagaactctataaagaagatatc1860

atcgttccagcaggatctacatcttgggggccaagaatagatttacttttaaaacccgat1920

gtttcagcacctggtaaaaatattaaatccacgcttaatgttattaatggcaaatcaact1980

tatggc1986

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hishishishishishis

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成多肽

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<213>肺炎链球菌

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<213>肺炎链球菌

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<213>肺炎链球菌

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<213>肺炎链球菌

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<213>肺炎链球菌

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<213>肺炎链球菌

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<213>肺炎链球菌

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<213>肺炎链球菌

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<213>肺炎链球菌

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<213>肺炎链球菌

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<213>肺炎链球菌

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15

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<213>肺炎链球菌

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<213>肺炎链球菌

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<213>肺炎链球菌

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15

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15

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<213>肺炎链球菌

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<213>肺炎链球菌

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15

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<213>肺炎链球菌

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15

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<213>肺炎链球菌

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15

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<213>肺炎链球菌

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glyserproargpropheiletyrglu

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<213>肺炎链球菌

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15

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<213>肺炎链球菌

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<213>肺炎链球菌

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15

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<213>肺炎链球菌

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tyrvaltyrproleuleualaglngly

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<213>肺炎链球菌

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valvalglnalathrthrseralalys

15

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<213>肺炎链球菌

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15

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<213>肺炎链球菌

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valalaalaglyvalleualaalacys

15

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<212>prt

<213>肺炎链球菌

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leuaspasnleulysvalilegluleu

15

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<213>肺炎链球菌

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asnmetalavalasnasnleusertyr

15

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<213>肺炎链球菌

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argleuleuaspleualaproglnval

15

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<213>肺炎链球菌

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metleugluileproalahisglnile

15

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<213>肺炎链球菌

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lysasnphephealahishisprolys

15

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<213>肺炎链球菌

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lysvalileleualaglyhisserlys

15

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<213>肺炎链球菌

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<213>肺炎链球菌

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<213>肺炎链球菌

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<213>肺炎链球菌

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<213>肺炎链球菌

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<213>肺炎链球菌

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glnserleuthrproglugluargglu

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<213>肺炎链球菌

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<213>肺炎链球菌

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leugluileproalahisglnile

15

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<213>肺炎链球菌

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15

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<213>肺炎链球菌

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<213>肺炎链球菌

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thrleuglyargleuthrglnleuleu

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serileasnaspleualaserleulys

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<213>肺炎链球菌

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serileasnaspleualaserleulys

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<213>肺炎链球菌

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<213>肺炎链球菌

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glnlysvalileleualaglyhisser

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<213>肺炎链球菌

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<213>肺炎链球菌

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<213>肺炎链球菌

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<213>肺炎链球菌

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<213>肺炎链球菌

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hisleuaspasnleuvalleulysval

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<213>肺炎链球菌

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aspleuilealaglyargvalhisleu

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<213>肺炎链球菌

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ileleuleuprolysasptyrglulys

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<213>肺炎链球菌

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asnproaspileserargmetileval

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<213>肺炎链球菌

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ileprotrpsergluasnleuproasp

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<213>肺炎链球菌

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<213>肺炎链球菌

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ileglyleuglutyrglnaspglnile

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<212>prt

<213>肺炎链球菌

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valtyrphehisaspglyglnasn

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<213>肺炎链球菌

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metgluvalvallyspropheile

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<213>肺炎链球菌

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<213>肺炎链球菌

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15

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<213>肺炎链球菌

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argilepheiletyrvalglythrglu

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<213>肺炎链球菌

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<213>肺炎链球菌

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<213>肺炎链球菌

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tyrileaspserserleucystyrtyr

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<213>肺炎链球菌

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<213>肺炎链球菌

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<213>肺炎链球菌

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leucystyrtyrhisaspleuileala

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<213>肺炎链球菌

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asnvalpheasnserlysgluserphe

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<213>肺炎链球菌

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metleulysasplysilealapheleu

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<213>肺炎链球菌

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<213>肺炎链球菌

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pheleuleuleuglyalaphetyrleu

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<213>肺炎链球菌

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<213>肺炎链球菌

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ileleualaserleuglypheleuleu

15

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<213>肺炎链球菌

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glyleuserglnleuleuprovalile

15

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<213>肺炎链球菌

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pheleuleuasnhistyrmetthrval

15

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<213>肺炎链球菌

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15

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<213>肺炎链球菌

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15

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<213>肺炎链球菌

<400>140

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15

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<213>肺炎链球菌

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15

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<212>prt

<213>肺炎链球菌

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thrleuasntyrgluhismetasnlys

15

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<212>prt

<213>肺炎链球菌

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asnileglytyrphephephelyslys

15

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<212>prt

<213>肺炎链球菌

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15

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<212>prt

<213>肺炎链球菌

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lystyraspaspservalserthrile

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

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15

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<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>147

asptyrprogluthrglnservalphe

15

<210>148

<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>148

thrproargalaileasnasnthrleu

15

<210>149

<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>149

alaproleuleuvalasnglygluleu

15

<210>150

<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>150

tyrileasphisthrasnvalalatyr

15

<210>151

<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>151

lysglnasnglyaspsertyrglytyr

15

<210>152

<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>152

pheleuleuasnhistyrmetthrval

15

<210>153

<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>153

phetyrleutyrasnglyaspleuser

15

<210>154

<211>8

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>154

lysserphealaproleuleuval

15

<210>155

<211>8

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>155

aspgluthrvalvalargthrval

15

<210>156

<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>156

tyrileasphisthrasnvalalatyr

15

<210>157

<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>157

metleulysasplysilealapheleu

15

<210>158

<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>158

lysleuargphelysilelysthrasp

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>159

lysleugluleuphetyrgluthrgly

15

<210>160

<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>160

lysilealapheleuglyserasnile

15

<210>161

<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>161

servalproargthrsertyrleuser

15

<210>162

<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>162

pheglypheglyleuserleupheser

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

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serthrileargserilegluglnval

15

<210>164

<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>164

phearglysthrthraspasnprophe

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

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thrvalvalargthrvalargaspser

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>166

serthrileargserilegluglnval

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>167

aspglyleuserglnleuleuproval

15

<210>168

<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>168

pheglypheglyleuserleupheser

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>169

lysleuvalaspglnglygluglyphe

15

<210>170

<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>170

alailevalthrcysmetaspserarg

15

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<212>prt

<213>肺炎链球菌

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alaglnthrphegluasngluprophe

15

<210>172

<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>172

alatyrvalalaleuhisglyglnleu

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>173

aspaspvalileileserglyalaile

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>174

phegluasnglupropheglnglutyr

15

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<212>prt

<213>肺炎链球菌

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phemetglnalaasnglnalatyrval

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>176

ileserglnglnglnmetglythrarg

15

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<212>prt

<213>肺炎链球菌

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lysprolysthrargvalalaileval

15

<210>178

<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

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leuhisglyglnleuasnleuproleu

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>179

leuhisvalalaglnalaleuglyleu

15

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<213>肺炎链球菌

<400>180

leuproleulysprolysthrargval

15

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<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>181

metglythrarggluilevalvalleu

15

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<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>182

metglnleuleuilegluserproleu

15

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<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>183

glnalaasnglnalatyrvalalaleu

15

<210>184

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<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>184

glnphemetglnalaasnglnalatyr

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

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glnleuasnleuproleulysprolys

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

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glnglnmetglythrarggluileval

15

<210>187

<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>187

arggluilevalvalleuhishisthr

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

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serproleuileproaspaspvalile

15

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<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>189

serargleuhisvalalaglnalaleu

15

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<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>190

thrgluaspmetileargserleuval

15

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<212>prt

<213>肺炎链球菌

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valaspvalseraspglnasppheleu

15

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<213>肺炎链球菌

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valseraspglnasppheleuprophe

15

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<212>prt

<213>肺炎链球菌

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valthrgluaspmetileargserleu

15

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<212>prt

<213>肺炎链球菌

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glyilegluvalglulysproleutyr

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

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alaglualahisleuleutyrargmet

15

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<213>肺炎链球菌

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alaleuleuasnglnaspasnmetarg

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>197

alaproprogluargasntyrleutyr

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

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alaglnasnsertyrilehisileleu

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>199

alavalalasermetglythralaleu

15

<210>200

<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>200

alatyrleuleuthrlysthrargile

15

<210>201

<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>201

aspalaalalysphetyrhisalaile

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>202

aspthralaleuglugluleugluarg

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>203

gluglutyrglnglyvalpropheile

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>204

glupheleuglulysilealaproleu

15

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<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>205

glupheglnvalleutyraspleuleu

15

<210>206

<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>206

gluhisvalgluhisleulysargleu

15

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<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>207

gluleusergluvalglumetthrarg

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

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gluserproleuvalleuasnasptyr

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

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glyglulysthrproserpheasnval

15

<210>210

<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

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glyleucysprophehisglyglulys

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

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ileglyaspmetprovalglnileval

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

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ilethrmetprovalthrlysglnleu

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

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lysalaleuleuasnglnaspasnmet

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>214

lysargleuthrlyslysleuvalleu

15

<210>215

<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>215

leuthrlysthrargileserproile

15

<210>216

<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

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leuvalleuvaltyraspglyasplys

15

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<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>217

metargalaglualahisleuleutyr

15

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<213>肺炎链球菌

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asnglyprogluaspleualatyrleu

15

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<213>肺炎链球菌

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glnthrglugluvalgluargalatrp

15

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<213>肺炎链球菌

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sergluiletyrleumetgluglyphe

15

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<213>肺炎链球菌

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serprohisglnalaleutyraspmet

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

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valasplysglnvalileglugluile

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>223

valglumetthrargasnlysalaleu

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>224

valleutyraspleuleuglyglntyr

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

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valpropheileglualavalglnile

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>226

trptyrglnvalleualaglnaspleu

15

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<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>227

tyrleumetgluglyphemetaspval

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>228

alaalatyralaproasngluvalval

15

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<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>229

alaglyaspleuargglylysileile

15

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<212>prt

<213>肺炎链球菌

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aspgluilealaasngluvaltrptyr

15

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<213>肺炎链球菌

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aspasntyrleuiletyrglyaspleu

15

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<212>prt

<213>肺炎链球菌

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aspglnlysgluhisproglulysphe

15

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<212>prt

<213>肺炎链球菌

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aspserleuthraspargleulysleu

15

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<212>prt

<213>肺炎链球菌

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glualalysasnlysasnlyspheval

15

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<213>肺炎链球菌

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gluglyglnglyargasnarglysleu

15

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<212>prt

<213>肺炎链球菌

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gluilelysglyalaglyaspleuarg

15

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<213>肺炎链球菌

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gluproilealagluglyglntyrphe

15

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<212>prt

<213>肺炎链球菌

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gluvalsergluleulysprohisarg

15

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<213>肺炎链球菌

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glyalaphepheasplysserlysile

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

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glyaspleulystrpaspglyleuile

15

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<212>prt

<213>肺炎链球菌

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glygluvalglulysasnleugluval

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>242

ilehisphegluservalgluglumet

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

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ilemetpheilevalglyilepheleu

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>244

ileproglythrleuasnlysglyile

15

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<212>prt

<213>肺炎链球菌

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ileargtyrglnvalphethrphelys

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

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ileserasplysglyglypheasntrp

15

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<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>247

ilevalserglugluasppheileleu

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>248

lysgluileglyvalgluglualaile

15

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<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>249

lysilevalvallysaspphealaarg

15

<210>250

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<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>250

lyslysileasnpheglnproserleu

15

<210>251

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<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>251

lysleulysphevaltyrileglylys

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>252

lysvaltyrtyrglyasnasntyrlys

15

<210>253

<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>253

lystyrtrpglnalaileargalaleu

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>254

leuhisileaspasnthrargaspphe

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>255

metargphelyslysgluaspleulys

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>256

asngluservalvalaspasntyrleu

15

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<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>257

asngluvaltrptyralaglyalaala

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>258

asnileasnaspilevalaspglyleu

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>259

glntyrleuleulysaspasnileile

15

<210>260

<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>260

serproargglnglnglyalaglyleu

15

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<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>261

serargserlysthrleuglyglytyr

15

<210>262

<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>262

serserleulysasnthrlysvalleu

15

<210>263

<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>263

thralaalavalileleualaalatyr

15

<210>264

<211>9

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>264

trpthrgluleuproalametglytyr

15