一种干细胞提取物及其制备方法与在制备皮肤创面修复制剂中的应用与流程

本发明涉及皮肤创面愈合技术领域，尤其涉及一种干细胞提取物及其制备方法与在制备皮肤创面修复制剂中的应用。

背景技术：

皮肤创面愈合是一个复杂的生物学过程，该过程是在各种细胞因子参与下的细胞与细胞、细胞与细胞外基质之间的相互作用、相互调控过程。当皮肤损伤发生时，创面愈合大致分为3个阶段，主要是炎症反应阶段，肉芽组织形成阶段和再生上皮化阶段。多种细胞和细胞因子参与了创面愈合各个过程。随着组织创面修复研究的不断深入，人们更加期待从传统意义的创面修复过度到美学意义上的创面修复。近年来促进创面损伤修复的方法很多，经典方法主要包括：工业敷料类(银离子纱布)、工业级药物(生长因子涂抹剂)和组织工程类(组织工程猪皮)。但是这些方法存在的主要问题是引入外源物质、制备技术复杂、生产周期长、单一因子作用效果差等问题。

目前，大量研究表明：干细胞在促进创面愈合时主要通过旁分泌作用(干细胞分泌大量因子)从而抑制创面炎性反应、促进血管生成、改善细胞外基质环境，动员机体自身干细胞迁移到损伤部位，达到创面的修复目的。随着干细胞技术的发展，其已应用在组织生长发育、创面愈合和器官再生等多个领域。但是，此前的研究主要是通过收集培养干细胞的上清液进行创面治疗，而这种上清液含有很多外源物质，包括凋亡的细胞、细胞碎片和代谢废物，很难稳定保存，易污染，造成很多负面问题，不利于规范化生产制备。

如何能够通过适当的提取工艺将干细胞培养过程中产生的生长因子、外泌体等活性成分富集，且去除凋亡细胞、细胞碎片和代谢废物，则对创面的愈合能够起到更加积极的作用。然而，此前的提取技术并无法充分对干细胞培养物中的活性成分进行富集，所得提取物对创面愈合的促进效果也十分有限。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种干细胞提取物及其制备方法与在制备皮肤创面修复制剂中的应用；本发明提供的干细胞提取物含有丰富的生长因子，活性较高，能够缩短创面愈合的时间、提高创面愈合的质量。

本发明提供了一种干细胞提取物包括：egf、fgf23、vegf、pdgf、kgf和fibronectin。

本发明提供的干细胞提取中各组分的质量份为：

一些实施例中，本发明提供的干细胞提取中各组分的质量份为：

一些实施例中，本发明提供的干细胞提取中各组分的质量份为：

一些实施例中，本发明提供的干细胞提取中各组分的质量份为：

本发明提供的提取物中，富含多种活性因子，各因子相互配合、共同对创伤起到良好的修复作用，其修复效果显著优于单因子产品。实验表明，采用本发明提供的制剂对创面进行修复，10天创面愈合率可达80％。

本发明提供的干细胞提取物的制备方法包括

步骤1：干细胞以含有il-6的hbss缓冲液刺激培养2h，弃掉培养液，加入hbss缓冲液培养2d，然后收集细胞培养的上清液；

步骤2：所述上清液经过滤后，滤液与peg溶液a混合，经离心收集沉淀；

步骤3：步骤2所述沉淀与peg溶液b混合，经离心，沉淀以pbs溶液重悬后，经冻干制得提取物。

本发明中，干细胞选自表皮干细胞，间充质干细胞、胚胎干细胞或多能诱导干细胞。

一些实施例中，干细胞为表皮干细胞。

干细胞可于市场购得，也可自行分离获得。干细胞的来源可为自体提供，也可为异体提供，本发明对此不做限定。

干细胞在以含有il-6的培养基刺激培养前，经过复苏培养。复苏培养的条件为37℃，5％co2，饱和湿度静置培养4d。对于表皮干细胞，复苏采用的培养基为表皮干细胞培养基。所述复苏具体包括：将冻存或冷藏的干细胞于解冻后，离心收集细胞沉淀，然后重悬于表皮干细胞培养基中，37℃，5％co2，饱和湿度静置培养4d。

本发明以il-6给予细胞外源刺激，模拟机体皮肤损伤发生过程。当皮肤发生损伤时，第一阶段炎性反应期会释放大量促炎性因子，例如：il6、il-1α和il-10等。释放的炎性因子刺激机体启动修复机制，基底细胞和成纤维细胞及免疫相关细胞会被动员，从而修复创面。所以当具有修复能力的表皮干细胞提前受到炎性因子il-6刺激后，会加速释放组织修复因子，达到缩短组织修复时间，促进组织的快速愈合。

一些实施例中，hbss缓冲液中il-6的浓度为10ng/ml～200ng/ml。

一些具体实施例中，hbss缓冲液中il-6的浓度为10ng/ml。

一些实施例中，刺激培养的条件为37℃，5％co2，饱和湿度静置培养2h。

一些实施例中，步骤2中所述过滤的滤径为0.22μm。

本发明采用peg对培养上清液中的活性因子进行沉淀。适宜浓度和分子量的peg能够起到良好的沉淀效果。而peg分子量过高或浓度不当则会导致提取获得活性因子的含量显著降低，相应的治疗效果也下降明显。

一些实施例中，步骤2中所述peg溶液a中的peg为peg6000，peg的质量分数为8％。

一些实施例中，向步骤2所述沉淀中加入peg溶液a体积为50ml。

一些实施例中，步骤2中所述离心的温度为0～4℃，转速为1000g，时间为30min。

一些实施例中，步骤3中所述peg溶液b中的peg为peg6000，peg的质量分数为6％。

一些实施例中，向步骤3所述沉淀中加入peg溶液b的体积为50ml。

一些实施例中，步骤3中所述离心的温度为0～4℃，转速为1000g，时间为20min。

一些实施例中，向步骤3所述沉淀加入15mlpbs溶液，重悬沉淀。

一些实施例中，冻干的程序包括：

预冻阶段：温度从20℃降至-50℃，维持-50℃30min～60min；

升华阶段：压力为0.15mbar～0.22mbar，两次升华：

第一次升华90min，期间温度从-40℃升至-15℃；

第二次升华120min，期间温度从-15℃升至0℃；

解析阶段：压力为0.16mbar～0.22mbar，时间为40min，期间温度从0℃升至30℃，随后30℃维持200min。

本发明提供的干细胞提取物在制备皮肤创面修复制剂中的应用。

所述皮肤创面为烫伤创面。

实验表明，将本发明提供的干细胞提取物溶解于生理盐水后涂敷创面，修复后上皮完整，真皮排列有序。10天创面愈合率显著优于单独使用egf的情况。

本发明还提供了一种皮肤创面修复制剂，包括本发明提供的干细胞提取物。本发明提供的皮肤创面修复制剂中还可包括药学上可接受的辅料。所述皮肤创面修复制剂的剂型为溶液剂、软膏剂、硬膏剂、油剂、霜剂、洗剂、糊剂、酊剂、外用散剂、喷雾剂、凝胶剂、贴敷剂、涂膜剂、乳剂。

本发明还提供了一种修复皮肤创面的方法，包括将本发明提供的皮肤创面修复制剂溶解于生理盐水，涂抹于创伤表面；

所述溶解至皮肤创面修复制剂的浓度为1mg/ml。

本发明提供的干细胞提取物中，主要包括egf、fgf23、vegf、pdgf、kgf和fibronectin。提取物中的各种生长因子相互配合，产生协同增效作用，从而对创面的修复起到良好的促进作用。本发明提供的干细胞提取物为干细胞经il-6刺激培养后，以peg沉淀后获得，该提取方法获得的提取物中，各因子的组成合理，能够用于制备皮肤创面修复制剂。实验表明，将本发明提供的干细胞提取物溶解于生理盐水后涂敷创面，修复后上皮完整，真皮排列有序。10天创面愈合率显著优于单独使用egf的情况。

附图说明

图1透射电镜扫描图片显示的沉淀；

图2示各组治疗效果；其中图2-a示实施例1提取物治疗效果；图2-b示对比例1提取物的治疗效果；图2-c示egf的治疗效果；图2-d示不做处理的效果。

具体实施方式

本发明提供了一种干细胞提取物及其制备方法与在制备皮肤创面修复制剂中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

egf(表皮细胞生长因子)是人体内一种重要的活性蛋白质多肽物质，能够快速修复受损皮肤，以及改善性的提高皮肤的修复、护理。

fgf23(成纤维细胞生长因子23)是一种尿磷酸盐激素，抑制骨化三醇合成，能够激活成纤维细胞，加速组织修复。

vegf(血管内皮生长因子)是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子,可在体内诱导血管新生，强力修复组织。

pdgf(血小板衍生因子)是从人的血小板中分离出来的促血管生成因子，是一种重要的促有丝分裂因子，具有刺激特定细胞群分裂增殖的能力。

kgf(角质细胞生长因子)又称为fgf-7，参与组织、器官的发育；参与皮肤、胃、肠、肾、膀胱、肺等上皮的损伤修复；具有损伤防护功能。

fibronectin(纤维连接蛋白)缩写fn，一种高分子糖蛋白，在伤口修复和愈合过程中具有重要作用。

il-6是多功能细胞因子，可促进t、b淋巴细胞成熟与分化，促进nk细胞和ctl细胞的免疫活性，招募免疫细胞等功能细胞涌向损伤部位。

表皮干细胞的分离方法为：

无菌条件下，将腹部组织用pbs清洗2次，每次5min，

在组织中，加入50mg/ml的dispase酶溶液，腹部组织与dispase酶溶液的质量-体积比为1:10，37℃酶解1h；

显微镜下，收集表皮组织，终浓度为0.05％胰蛋白酶，37℃消化10min；

以含有10％fbs血清培养基终止反应，1000r离心10min，收集沉淀；

将沉淀重悬于表皮干细胞培养基中(gibco)，37℃，5％co2，饱和湿度静置培养至对数期；

将培养获得的细胞按照2×10⁶个/ml细胞量用含有10％fbs的dmso冻存液冻存于-196℃液氮中。

间充质干细胞的分离方法为：无菌条件下，将获得的脐带组织用含有抗生素的pbs液清洗3次，每次10min，用眼科镊夹持脐带，弃去脐带组织血管内血液，然后将组织剪成3cm/段，用眼科镊和眼科剪刀弃去脐带静脉和动脉血管，收获脐带间组织，用眼科剪剪成1cm²组织块，平铺于6孔培养板中，加入3ml脐带间充质专用培养基(invitrogen)，于37℃，co2培养箱中培养10天，10天后会观察到贴壁组织周围有梭形细胞。待梭形细胞汇合成80％以上时，用0.25％胰酶消化细胞，100g离心10min，沉淀用脐带间充质干细胞培养基重悬，按照2×10⁴/cm重悬于培养瓶中，培养至对数生长期。

本发明采用的胚胎干细胞是利用商业化细胞系的干细胞采用胚胎干细胞专用培养基进行扩增培养。

本发明采用的多能诱导干细胞是利用商业化细胞系的干细胞采用多能诱导干细胞专用培养基进行扩增培养。

所述复苏是指将经冷藏或经冻存的细胞进行培养从而使其恢复活性。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

1、异体表皮干细胞的培养：取吸脂术后切除的多余腹部组织，无菌转移到生物安全柜中，用pbs清洗2次，每次5min，按照组织重量：酶体积为1：10的比例加入适量50mg/mldispase酶，37℃作用1h，体式显微镜下分离表皮干细胞，将收获的表皮组织，用5ml0.05％胰蛋白酶消化10min，37℃水浴锅中，加入含有10％fbs血清培养基终止反应，1000r离心10min，收集沉淀。将沉淀重悬于表皮干细胞培养基中(gibco)，待细胞达到对数生长期后将表皮干细胞按照2×10⁶细胞量用含有10％volfbs的dmso冻存液进行表皮干细胞冻存，应用程序降温盒进行冻存，最后保存于-196℃液氮罐中。

2、复苏冻存的表皮干细胞1管，将其快速在37℃进行复苏，待细胞悬液融化后，迅速离心，1000r，5min，将沉淀重悬于商业化的表皮干细胞培养基中，放置于t75平方厘米的培养瓶中。待体外生长4d后，将表皮干细胞培养基更换为hbss缓冲液，其中含有0.1vol％胎牛血清，并向其中加入10ng/mlil-6(白细胞介素-6)在37℃，5％co2条件下培养2h,弃掉上清液，加入hbss缓冲液培养48h后收集细胞培养上清液。

3、将收集的细胞培养上清液用0.22针式滤膜进行过滤除去杂质。

4、然后向过滤的细胞上清液加入质量分数为8％的peg6000溶液,1000g，4℃离心30分钟收集沉淀，再加入质量分数为6％的peg6000溶液

，4℃离心20分钟，弃掉上清液，沉淀(以电镜观察，结果如图1)重悬于pbs溶液中，4℃过夜。

5、次日将pbs重悬液用elisa试剂盒检测溶液中：egf、fgf23、vegf、pdgf、kgf、fibronectin含量，elisa结果表明，其中含有egf20μg/ml，fgf2350ng/ml，vegf500pg/ml，pdgf-cc32ng/ml，kgf2.5ng/ml，fibronectin21ng/ml。

6、将收集的溶液于冻干机上进行冻存，冻存条件是：预冻阶段：设置温度从室温20℃降至设定值-50℃，持续保持维持该温度30～60min；升华阶段：真空干燥箱内压力控制在0.15～0.22mbar，采用两次升华方式：第一次升华温度从-40℃升至-15℃，此过程保持在90min左右；第二次升华温度从-15℃升至0℃，这个过程持续时间在120min；解析阶段：真空箱内压力控制在0.16～0.22mbar，温度在40min内从0℃升温至30℃，随后在30℃维持200min。

实施例2

1、间充质干细胞的培养：无菌条件下，将获得的脐带组织用含有抗生素的pbs液清洗3次，每次10min，用眼科镊夹持脐带，弃去脐带组织血管内血液，然后将组织剪成3cm/段，用眼科镊和眼科剪刀弃去脐带静脉和动脉血管，收获脐带间组织，用眼科剪剪成1cm²组织块，平铺于6孔培养板中，加入3ml脐带间充质专用培养基(invitrogen)，于37℃，co2培养箱中培养10天，10天后会观察到贴壁组织周围有梭形细胞。待梭形细胞汇合成80％以上时，用0.25％胰酶消化细胞，100g离心10min，沉淀用脐带间充质干细胞培养基重悬，按照2×10⁴/cm重悬于培养瓶中，培养至对数生长期。

待细胞达到对数生长期后将间充质干细胞按照2×10⁶细胞量用含有10％fbs的dmso冻存液进行间充质干细胞冻存，应用程序降温盒进行冻存，最后保存于-196℃液氮罐中。

2、复苏冻存的间充质干细胞1管，将其快速在37℃进行复苏，待细胞悬液融化后，迅速离心，1000r，5min，将沉淀重悬于商业化的间充质干细胞培养基中，放置于t75平方厘米的培养瓶中。待体外生长4d后，将间充质干细胞培养基更换为hbss缓冲液，其中含有0.1vol％胎牛血清，并向其中加入10ng/mlil-6(白细胞介素-6)在37℃，5％co2条件下培养2h,弃掉上清液，加入hbss缓冲液培养48h后收集细胞培养上清液。

3、将收集的细胞培养上清液用0.22针式滤膜进行过滤除去杂质。

4、然后向过滤的细胞上清液加入质量分数为8％的peg6000溶液,1000g，4℃离心30分钟收集沉淀，再加入质量分数为6％的peg6000溶液，4℃离心20分钟，弃掉上清液，沉淀(以电镜观察，结果如图1)重悬于pbs溶液中，4℃过夜。

5、次日将pbs重悬液用elisa试剂盒检测溶液中：egf、fgf23、vegf、pdgf、kgf、fibronectin含量，elisa结果表明，其中含有egf10μg/ml，fgf2375ng/ml，vegf200pg/ml，pdgf-cc60ng/ml，kgf1ng/ml，fibronectin50ng/ml。

6、将收集的溶液于冻干机上进行冻存，冻存条件是：预冻阶段：设置温度从室温20℃降至设定值-50℃，持续保持维持该温度30～60min；升华阶段：真空干燥箱内压力控制在0.15～0.22mbar，采用两次升华方式：第一次升华温度从-40℃升至-15℃，此过程保持在90min左右；第二次升华温度从-15℃升至0℃，这个过程持续时间在120min；解析阶段：真空箱内压力控制在0.16～0.22mbar，温度在40min内从0℃升温至30℃，随后在30℃维持200min。

实施例3

1、培养多能诱导干细胞，待细胞达到对数生长期后将多能诱导干细胞按照2×10⁶细胞量用含有10％fbs的dmso冻存液进行多能诱导干细胞冻存，应用程序降温盒进行冻存，最后保存于-196℃液氮罐中。

2、复苏冻存的多能诱导干细胞1管，将其快速在37℃进行复苏，待细胞悬液融化后，迅速离心，1000r，5min，将沉淀重悬于商业化的多能诱导干细胞培养基中，放置于t75平方厘米的培养瓶中。待体外生长4d后，将多能诱导干细胞培养基更换为hbss缓冲液，其中含有0.1vol％胎牛血清，并向其中加入10ng/mlil-6(白细胞介素-6)在37℃，5％co2条件下培养2h,弃掉上清液，加入hbss缓冲液培养48h后收集细胞培养上清液。

3、将收集的细胞培养上清液用0.22针式滤膜进行过滤除去杂质。

4、然后向过滤的细胞上清液加入质量分数为8％的peg6000溶液,1000g，4℃离心30分钟收集沉淀，再加入质量分数为6％的peg6000溶液，4℃离心20分钟，弃掉上清液，沉淀(以电镜观察，结果如图1)重悬于pbs溶液中，4℃过夜。

5、次日将pbs重悬液用elisa试剂盒检测溶液中：egf、fgf23、vegf、pdgf、kgf、fibronectin含量，elisa结果表明，其中含有egf30μg/ml，fgf2330ng/ml，vegf900pg/ml，pdgf-cc10ng/ml，kgf8ng/ml，fibronectin10ng/ml。

6、将收集的溶液于冻干机上进行冻存，冻存条件是：预冻阶段：设置温度从室温20℃降至设定值-50℃，持续保持维持该温度30～60min；升华阶段：真空干燥箱内压力控制在0.15～0.22mbar，采用两次升华方式：第一次升华温度从-40℃升至-15℃，此过程保持在90min左右；第二次升华温度从-15℃升至0℃，这个过程持续时间在120min；解析阶段：真空箱内压力控制在0.16～0.22mbar，温度在40min内从0℃升温至30℃，随后在30℃维持200min。对比例1

1、异体表皮干细胞的培养：取吸脂术后切除的多余腹部组织，无菌转移到生物安全柜中，用pbs清洗2次，每次5min，按照组织重量：酶体积为1：10的比例加入适量50mg/mldispase酶，37℃作用1h，体式显微镜下分离表皮干细胞，将收获的表皮组织，用5ml0.05％胰蛋白酶消化10min，37℃水浴锅中，加入含有10％fbs血清培养基终止反应，1000r离心10min，收集沉淀。将沉淀重悬于表皮干细胞培养基中(gibco)，待细胞达到对数生长期后将表皮干细胞按照2×10⁶细胞量用含有10％fbs的dmso冻存液进行表皮干细胞冻存，应用程序降温盒进行冻存，最后保存于-196℃液氮罐中。

2、复苏冻存的表皮干细胞1管，将其快速在37℃进行复苏，待细胞悬液融化后，迅速离心，1000r，5min，将沉淀重悬于商业化的表皮干细胞培养基中，放置于t75平方厘米的培养瓶中。待体外生长4d后，将表皮干细胞培养基更换为hbss缓冲液，其中含有0.1％胎牛血清，并向其中加入10ng/mlil-6(白细胞介素-6)在37℃，5％co2条件下培养2h,弃掉上清液，加入hbss缓冲液培养48h后收集细胞培养上清液。

3、将收集的细胞培养上清液用0.22针式滤膜进行过滤除去杂质。

4、然后向过滤的细胞上清液加入质量分数为8％的peg8000溶液,1000g，4℃离心30分钟收集沉淀，再加入质量分数为3％的peg8000溶液，4℃离心20分钟，弃掉上清液，沉淀重悬于pbs溶液中，4℃过夜。

5、次日将pbs重悬液用elisa试剂盒检测溶液中：egf、fgf23、vegf、pdgf、kgf、fibronectin含量，elisa结果表明，其中含有egf0ug/ml，fgf230ng/ml，vegf230pg/ml，pdgf-cc20ng/ml，kgf0ug/ml，fibronectin0ng/ml。

6、将收集的溶液于冻干机上进行冻存，冻存条件是：预冻阶段：设置温度从室温20℃降至设定值-50℃，持续保持维持该温度30～60min；升华阶段：真空干燥箱内压力控制在0.15～0.22mbar，采用两次升华方式：第一次升华温度从-40℃升至-15℃，此过程保持在90min左右；第二次升华温度从-15℃升至0℃，这个过程持续时间在120min；解析阶段：真空箱内压力控制在0.16～0.22mbar，温度在40min内从0℃升温至30℃，随后在30℃维持200min。

实施例4

构建小鼠烫伤模型，方法为用剃毛器剔除小鼠背部皮肤毛发，大小为直径2cm。然后用直径为2cm的100℃预热的金属块在脱毛鼠背部烫伤10s。小鼠随机分为6组，每组5只。

将实施例1～3和对比例1制备的冻干粉，溶解于生理盐水，溶解至冻干粉的浓度为1mg/ml。将各冻干粉的溶液涂抹于创伤表面。

观察烫伤后涂敷不同冻干粉溶液的修复效果。实验设涂敷egf溶液的阳性对照，以及未给予治疗的空白对照。各组创面愈合情况如表1。其中：

创面愈合率＝检测日创面面积/造模创面面积×100％

表1创面愈合情况

注：*表示与未处理组相比存在显著性差异，***p<0.001；

#表示与对比例1有显著差异，#p<0.05；

％表示与egf组比有显著差异，％％％p<0.001。

对给予实施例1、对比例1、egf和未处理组的治疗10天后的小鼠的创面进行切片观察，结果如图2。图2和表1结果表明，实施例1～3提供的提取物能够对烫伤起到良好的修复作用，修复效果快，基底干细胞再生数量显著提高，修复后上皮完整，真皮排列有序。该效果显著优于对比例1和单独使用egf的对照组。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。