本发明属于复合生物材料制备领域，具体涉及一种vegf转染生物活性玻璃组织修复材料的制备方法。
背景技术：
生物材料发展至今已经经历了三个主要阶段。自20世纪80年代以来，以医疗、保健及增进生活质量等为目的的生物医用材料取得了快速的发展，已经有超过50种植入器械被应用于临床，一般来源于技术成熟的工程材料，并且具有生物相容性和缺损组织替代功能，例如已广泛应用于临床的心人工血管、人工关节和人工肾等。上述生物医用材料，具有一个普遍的共性:生物惰性。即生物医用材料发展所遵循的原则是尽量将受体对植入器械的异物反应降到最低。从上世纪80年代到90年代，生物医用材料领域的重点逐渐由生物惰性转向生物活性和可控降解性，开发了第二代生物医用材料及产品。
20世纪90年代后期，第三代生物材料是伴随着组织工程学的建立、发展而迅速发展起来的。以组织工程生物材料支架为代表，其综合了工程科学和生命科学原理，为种子细胞提供了适合其生长、基质合成及发挥其他功能的生物学空间，克服了以往单一的细胞移植中细胞不易成活、基质合成能力低下等缺点，为组织工程化组织的构建提供了细胞载体和结构支架。这类生物医用材料将生物活性材料与可降解材料这两个独立的概念结合起来，在可降解材料上进行分子修饰，引起细胞整合素的相互作用，诱导细胞增殖、分化，以及细胞外基质的合成与组装。但目前所应用于组织工程的生物材料的性能还有待进一步提高，不能满足现代医药的需求。
技术实现要素：
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种vegf转染生物活性玻璃组织修复材料的制备方法，进一步提高了组织修复材料的细胞粘附性及生物活性。
本发明采用以下技术方案：
一种vegf转染生物活性玻璃组织修复材料的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：将1mllb液体培养基和20μl、10％v/v葡萄糖置于离心管中，将1mgpmal-v2/mbp-vegf加入到离心管中，置于30℃，120-260rpm/min，震荡培养过夜，得vegf悬液；
步骤二：将350mg明胶溶解于60ml水中，水浴加热到50℃搅拌至完全溶解制得明胶溶液；
步骤三：将明胶溶液与150mgn-羟基丁二酰亚胺、191mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺及103mg多巴胺混合，在电热恒温水槽中40℃搅拌48小时后，将溶液置于透析袋中，放入盛有超纯水的烧杯中，并置于电热恒温水槽于40℃条件下搅拌2-3day，且每隔8h换一次超纯水；
步骤四：取出透析袋中残留的溶液，置于-20℃冷冻箱中冷冻8h，再置于冻干机上干燥48h，得粘附性明胶；
步骤五：将粘附性明胶制成3mg/ml的水溶液，用hcl和naoh调节水溶液ph值至7，即得多巴胺修饰溶液；
步骤六：将15g十六烷基三甲基溴化铵溶于500ml35℃的去离子水中，加入3.9g正硅酸乙酯和3.54gca(no3)2·4h2o，用硝酸调节ph到2，水解4小时以后，加入0.435gnh4h2po4并用nh3·h2o调节ph＝10，反应12h后，把温度升到95℃沉化48小时，将反应液离心分离，用去离子水反复清洗，冷冻干燥，得介孔纳米生物活性玻璃；
步骤七：将介孔纳米生物活性玻璃按质量浓度为20％溶解于四氢呋喃中，使用超声波震荡对其进行分散，磁力搅拌1h溶解，制得溶液，将溶液在60℃水浴箱中，回流加热，磁力揽拌2h，直至全部溶解，将溶液转移至模具中，并迅速放入零下20℃低温冰箱中，待其形成凝胶后，在凝胶化温度下保持2h；
步骤八：将凝胶转入4℃冰箱中进行水置换1d，在冷冻干燥机中于-55℃、气压低于50pa冻干48h，得到介孔纳米生物活性玻璃薄膜；
步骤九：将多巴胺修饰溶液均匀喷涂于介孔纳米生物活性玻璃薄膜表面，并于37℃干燥箱干燥12h后，用磷酸盐缓冲液(pbs)漂洗3次；
步骤十：将介孔纳米生物活性玻璃薄膜浸泡于vegf悬液中48h得vegf转染生物活性玻璃组织修复材料。
步骤一中所述的pmal-v2/mbp-vegf由理化学研究所伊藤ナノ医工学研究室提供。
优选的，步骤三中所述的透析袋残留分子量为10000da。
优选的，所述的步骤三中超纯水用量为漫过透析袋。
优选的，步骤九中喷涂的厚度为5-30nm。
本发明的有益效果在于：
1)多巴胺是神经激素中的一种化合物，含有丰富的乙氨基和儿茶酚活性官能团，几乎能粘附在任何机体的表面，尤其对于有机表面效果更佳。多巴胺修饰后的明胶的黏附性较高，且在材料表面上形成了聚合的多巴胺-明胶层。多巴胺的修饰，不仅提高了固定的明胶的含量，同时促进了细胞的粘附，加强了材料表面的细胞相容性。
2)明胶分子结构上含有大量的羟基及少量的羧基和氨基，具有极强的亲水性。因此，明胶分子中的羧基可以与多巴胺的氨基发生缩合反应。明胶具有其他合成材料无法比拟的生物相容性、可降解性以及生物活性。
3)vegf又称血管通透性生长因子是目前发现的作用最强的促血管生成细胞生长因子，明胶可以和生长因子相互作用而结合在一起，可以有效提高组织修复材料上生长因子的数量。
4)采用本发明制得的介孔纳米生物活性玻璃具有较高的孔隙率，具有相互连通的三维结构，以便于细胞的增殖、迁移，为细胞的生长提供足够的营养物质，且生物活性玻璃生物相容性良好，能激活细胞基因，有利于增强细胞的增殖与分化，具有骨诱导和骨传导的作用。作为支架材料，为细胞生长、代谢提供场所，为形成新组织提供适宜的环境，此外还能调控和诱导的分化，形成新的具有功能性的组织和器官。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
一种vegf转染生物活性玻璃组织修复材料的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：将1mllb液体培养基和20μl、10％v/v葡萄糖置于离心管中，将1mgpmal-v2/mbp-vegf加入到离心管中，置于30℃，120-260rpm/min，震荡培养过夜，得vegf悬液；
步骤二：将350mg明胶溶解于60ml水中，水浴加热到50℃搅拌至完全溶解制得明胶溶液；
步骤三：将明胶溶液与150mgn-羟基丁二酰亚胺、191mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺及103mg多巴胺混合，在电热恒温水槽中40℃搅拌48小时后，将溶液置于透析袋中，透析袋残留分子量为10000da，将透析袋放入盛有超纯水的烧杯中，超纯水用量为漫过透析袋的位置，并将烧杯置于电热恒温水槽于40℃条件下搅拌2-3day，且每隔8h换一次超纯水；
步骤四：取出透析袋中残留的溶液，置于-20℃冷冻箱中冷冻8h，再置于冻干机上干燥48h，得粘附性明胶；
步骤五：将粘附性明胶制成3mg/ml的水溶液，用hcl和naoh调节水溶液ph值至7，即得多巴胺修饰溶液；
步骤六：将15g十六烷基三甲基溴化铵溶于500ml35℃的去离子水中，加入3.9g正硅酸乙酯和3.54gca(no3)2·4h2o，用硝酸调节ph到2，水解4小时以后，加入0.435gnh4h2po4并用nh3·h2o调节ph＝10，反应12h后，把温度升到95℃沉化48小时，将反应液离心分离，用去离子水反复清洗，冷冻干燥，得介孔纳米生物活性玻璃；
步骤七：将介孔纳米生物活性玻璃按质量浓度为20％溶解于四氢呋喃中，使用超声波震荡对其进行分散，磁力搅拌1h溶解，制得溶液，将溶液在60℃水浴箱中，回流加热，磁力揽拌2h，直至全部溶解，将溶液转移至模具中，并迅速放入零下20℃低温冰箱中，待其形成凝胶后，在凝胶化温度下保持2h；
步骤八：将凝胶转入4℃冰箱中进行水置换1d，在冷冻干燥机中于-55℃、气压低于50pa冻干48h，得到介孔纳米生物活性玻璃薄膜；
步骤九：将多巴胺修饰溶液均匀喷涂于介孔纳米生物活性玻璃薄膜表面，喷涂的厚度为5-30nm，并于37℃干燥箱干燥12h后，用磷酸盐缓冲液(pbs)漂洗3次；
步骤十：将介孔纳米生物活性玻璃薄膜浸泡于vegf悬液中48h得vegf转染生物活性玻璃组织修复材料。
步骤一中所述的pmal-v2/mbp-vegf由理化学研究所伊藤ナノ医工学研究室提供。
细胞粘附实验：取培养的huvec细胞，消化，细胞计数，以5×103cell/ml密度接种在实施例1制得的组织修复材料及空白对照组生物活性玻璃材料上，每孔1ml，接种0.5h、1h、2h后，用无菌的pbs溶液漂洗，镜下观察并照相计数，结果见下表1。可以看出经过多巴胺修饰后的生物活性玻璃组织修复材料所粘附的细胞数量明显多于没有经过修饰的空白对照组的细胞数量。
表1
细胞增殖实验：取培养的huvec细胞，消化，细胞计数，以5×103cell/ml密度接种在实施例1制得的组织修复材料及空白对照组生物活性玻璃材料上，每孔1ml，隔两天换液，接种5day后，细胞计数试剂盒wst-8检测材料表面的细胞活性，结果见表2，可以得出经过多巴胺修饰后的生物活性玻璃组织修复材料的细胞活性略高于空白实验组的细胞活性。
表2