一种生物止血材料、制备方法及其应用与流程

本发明涉及医用生物材料领域，具体的为一种止血材料，以及该止血材料的制备方法及其应用。
背景技术：
：血液是在心脏和血管内循环流动的一种组织，成人血液约占体重的十三分之一。各种突发性事故中，人体的大出血非常常见。此外医院手术汇总也会有大量的出血。当失血量超过血液总量的40％时，将进入重度休克，有生命危险。因而创口止血是医学领域中非常重要的问题。传统的用于止血的方法通常为结扎止血、缝合止血、电凝止血、填压止血等止血方法。由于对无菌止血和止血性能的要求的提高，采用止血膜对创口进行止血成为医学界的关注重点。目前采用的止血膜主要有透明质酸、止血明胶、氧化纤维素、海藻酸钠、纤维胶原、壳聚糖、羧甲基纤维素和羧甲基壳聚糖等。然而现有止血膜也存在这样或那样的问题，例如透明质酸容易被机体组织中的酶所降解而存在降解时间过短的问题；为提高与组织粘附性止血明胶海绵由于需要与戊二醛进行交合而导致对组织的诱变性和致癌性；而氧化纤维素可能形成肉芽肿和脓肿等副作用。本发明提供一种生物止血材料，能够快速止血并且可以体内降解；此外具有组织缝合强度，且能够粘附于组织表面。由于该止血材料进行了免疫原去除处理，因而无免疫原反应，应用之后并发症少、恢复快。技术实现要素：本发明针对现有技术的上述不足，提供一种保留完整的三维空间结构、成型容易、不易分层，生物活性分子保留量高、降解过程可控的生物止血材料。为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种生物止血材料，其特征在于：所述生物止血材料由经脱细胞处理的小肠粘膜下层组织材料制成的多层结构，所述多层结构包括具有多孔三维结构的小肠粘膜下层组织材料层。所述生物止血材料可以为矩形、圆形、椭圆形或多边形，或者可以根据医学需求进行裁切。所述生物止血材料至少包括层状经干燥处理的小肠粘膜下层组织材料，以及颗粒状经破碎和干燥处理的小肠粘膜下层组织材料。本发明所述的小肠粘膜下层组织材料为哺乳动物的小肠粘膜下层组织材料，优选猪或牛的小肠粘膜下层组织材料。本发明还提供一种上述生物止血材料的制备方法，其特征在于：步骤包括：(1)原料的初处理：取小肠粘膜下层组织材料进行初处理；(2)病毒灭活：采用过氧乙酸-乙醇溶液浸泡小肠粘膜下层组织材料进行病毒灭活；(3)清洗过程：清洗小肠粘膜下层组织材料；(4)脱细胞：脱细胞液为包含0.01-0.2％质量百分比浓度的胰蛋白酶和0.1-1mmol/l浓度的edta的ph值6-8的pbs溶液，脱细胞液与小肠粘膜下层组织材料的体积比为(20-40)︰1，在多频超声环境中用脱细胞液处理进行脱细胞，所述多频超声至少包含频率不同的两个超声频率；(5)清洗过程：进行清洗，清洗过程在超声波清洗机中进行；(6)固定成形：取步骤(5)清洗后的一层或多层小肠粘膜下层组织材料进行在模具上固定；(7)干燥：取步骤(6)固定后的小肠粘膜下层组织材料进行干燥；(8)小肠粘膜下层基质浆料制备：使用低温破碎装置破碎由步骤(5)得到的脱细胞小肠粘膜下层组织材料，经过筛网筛选小肠粘膜下层组织材料颗粒；向所述小肠粘膜下层组织材料颗粒中加入醋酸溶液并混合均匀制成小肠粘膜下层基质浆料；(9)复合成形：在步骤(7)干燥中后但仍保持在模具上的烘干小肠粘膜下层组织上覆盖由步骤(8)得到的小肠粘膜下层基质浆料，使用刮平工具将浆料涂布在经步骤(7)干燥的小肠粘膜下层组织的上表面上；(10)真空冷冻干燥：对步骤(9)得到的带有浆料的小肠粘膜下层组织材料进行真空冷冻干燥。所述步骤(2)中过氧乙酸-乙醇溶液中过氧乙酸的体积百分比浓度为0.1-5％、乙醇的体积百分比浓度为5-40％，过氧乙酸-乙醇溶液与小肠粘膜下层组织材料的体积比为(3-20)︰1，灭活时间2-4小时，温度范围为10-40℃。所述步骤(3)中先用ph值6-8的pbs溶液清洗，pbs溶液温度为10-40℃，pbs溶液与小肠粘膜下层组织材料的体积比为(20-40)︰1，清洗2-4次，每次10-30分钟；然后采用纯化水清洗，纯化水与小肠粘膜下层组织材料体积比为(20-40)︰1，直至检测电导率为10μs/cm以下终止；清洗过程在超声波清洗机中进行，超声波频率为40khz，功率3000w以上。在步骤(4)中所述多频超声环境由多频超声装置包括中进行，所述两个超声频率包含15-30khz的低频频率和60-90khz的高频频率，其中低频处理5-30min，高频处理5-30min；多频超声环境温度范围为20-35℃；超声功率5000w以上。所述步骤(5)中清洗液为ph6-8的pbs溶液，pbs溶液温度为10-40℃，pbs溶液与小肠粘膜下层组织材料的体积比为(20-40)︰1，清洗2-4次，每次10-30分钟，然后采用10-40℃的注射用水清洗，注射用水与小肠粘膜下层组织材料的体积比为(20-40)︰1，检测清洗注射用水与未清洗注射用水电导率之差小于1μs/cm终止；清洗过程在超声波清洗机中进行，超声波频率为40khz，功率3000w以上。所述步骤(6)所述的成型模具由带针底板、盖板与压块三部分组成，将一或多层小肠粘膜下层基质材料平铺于所述带针底板上，覆盖所述盖板，所述盖板上压5-10公斤的压块，使得材料平整、水分从四周溢出并且材料上下层之间紧密接触。模具结构可以参考发明专利zl201310203588.6和zl201310203602.2。所述步骤(7)在烘箱中进行，具体为：开启烘箱风机，预热至25-40℃，将小肠粘膜下层组织材料和模具放于烘箱中，时间8-16小时，将用于提供压力的压块和盖板缓缓取下，再次放于烘箱中干燥，时间需2-6小时后干燥完成。所述步骤(8)中的破碎过程中，膜下层组织材料浆料的破碎步骤中将小肠粘膜下层和液氮送入破碎装置中，小肠粘膜下层材料被液氮冷冻，利用破碎装置的高速旋转刀头进行破碎，破碎时间1-60min，经过筛网筛选的小肠粘膜下层组织的颗粒平均粒径为700微米以下；向所述颗粒加入醋酸溶液形成小肠粘膜下层基质材料浆料；其中所述醋酸溶液质量百分比浓度0.1％-0.8％，优选0.2％-0.3％，小肠粘膜下层基质材料与醋酸溶液质量比为1:25-1:500，优选1:30-1:100，破碎成上述的粒径范围，用于制备疏松层，有利于止血和细胞爬附。所述步骤(9)中包括：在(7)步骤中烘干型的产品上覆盖步骤(8)中的小肠粘膜下层基质浆料，使所述基质浆料均匀平铺在烘干产品上表面，浆料厚度为1-3mm。所述步骤(10)真空冷冻干燥在真空冷冻干燥机中进行，预冻至-45℃，保温1-2小时，然后调节温度至-15℃，保温5-7小时，再调节温度至0℃，保温2小时，最后调节温度至25℃，保温4小时。本发明上述的生物止血材料的制备方法，步骤还包括：(11)打孔包装和(12)灭菌解析，具体的：(11)打孔包装：烘干的产品取出后，切割成固定的形状，再放入机械打孔机中，以间距0.9cm进行打孔，孔直径1.5毫米，采用双层特卫强包装袋包装，该过程需要无菌转运与操作；(12)灭菌解析：产品采用环氧乙烷灭菌，灭菌条件：温度40℃，保温时间4小时，湿度70％，浓度为500mg/l，灭菌时间6小时；解析过程：通风的解析室中，温度控制在20℃之间，时间12-15天。本发明还提供一种生物止血材料在止血医疗器械中的应用，所述医疗器械能够用于各种手术中的创面止血、外伤创伤止血、溃疡面处理和烧烫伤面处理。本发明中注射用水的使用标准依照国家药典中规定。本发明中经脱细胞处理的小肠粘膜下层组织材料也可以称为小肠粘膜下层基质材料。与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：(1)多频超声脱细胞工艺：减少了细胞洗脱过程化学试剂使用量与作用时间，保护脱细胞外基质胶原蛋白纤维完整性与三维多孔结构；(2)酶法细胞洗脱工艺：采用胰蛋白酶和edta复合溶液，脱除细胞过程温和，减少对基质结构的破坏，保留基质中的活性生长因子；(3)成型工艺技术：模具法真空干燥，将定型与脱水过程同步化，去除多层基质间隙中气泡，使多层结构致密，不分层。采用将冻干颗粒结合至烘干材料上的方式，形成了上层疏松、下层致密的双层复合结构。疏松层孔隙率大，有利于止血和对于组织的贴附，致密层有隔离作用，有效保护被修复的组织；(4)脱细胞基质膏状粉体制备技术：首先采用自制小肠粉碎设备将小肠打碎，再通过醋酸膨化处理，形成蓬松的细小颗粒，再经过冻干形成蓬松状、可大量吸水的微颗粒粉体，与一定量的溶液混合型成膏状物便于涂布成型；(5)灭菌工艺：通过灭菌过程调整产品体内降解过程，使脱细胞基质补片逐步降解，与重建组织再生过程基本同步，最终脱细胞基质补片完全被宿主组织代替；(6)用于各种手术中的创面止血、外伤创伤止血和烧烫伤及溃疡面处理。(7)此外，本发明采用胰蛋白酶和edta，使细胞与细胞外基质之间的连接被破坏；采用低频超声对细胞进行破碎，同时使用高频超声作用于破碎的细胞及细胞外基质，进一步使细胞脱离细胞外基质，达到脱细胞目的。采用上述方式，对整个细胞脱离基质过程中的各个步骤进行强化，使细胞被从基质上完全脱离。到达最佳的免疫原去除效果。通过上述脱细胞方法制备的生物组织基质材料为多孔结构，为提供细胞生长的支架。根据放置组织器官位置不同，各组织器官的功能性细胞在基质材料上爬附、生长，形成相应组织结构并发挥对应的组织功能，而且基质材料成为组织的一部分。附图说明图1是根据本发明一个实施方式的生物止血材料剖面示意图；图2是本发明一个实施方式的生物止血材料俯视示意图；附图仅为对本发明的解释，以有助于对本发明的理解，而并非对用于本发明的限制。具体实施方式以下结合实施例对本发明作进一步具体描述，但不局限于此。图1是本发明的一个实施方式的生物止血材料示意图，其中包括经干燥处理的小肠粘膜下层组织材料1和经破碎和干燥处理的小肠粘膜下层组织材料2；图2为一个实施方式的生物止血材料俯视图示意图。实施例1：生物止血材料的制备(1)原料的初处理：取小肠粘膜下层组织材料(如猪小肠粘膜下层组织材料sis，或者牛小肠粘膜下层组织材料)分割成规定尺寸，剔除无用组织(例如淋巴组织)，用纯化水清洗，然后将清洗后的置于筛网等滤水装置上，静置五分钟以上，将水滤干。(2)病毒灭活：采用过氧乙酸-乙醇溶液浸泡小肠粘膜下层组织材料，该过程可在不锈钢桶中进行，浓度过氧乙酸采用体积百分比浓度0.1％，乙醇采用体积百分比浓度5％，灭活时间2小时，溶液与小肠粘膜下层组织材料体积比为10：1，温度范围为20℃；(3)清洗过程：用ph6的pbs溶液清洗，pbs溶液温度为25℃，pbs溶液与小肠粘膜下层组织材料的体积比为30︰1，清洗3次，每次25分钟，在超声波清洗机中、超声功率为5000w以上；然后采用纯化水清洗，在超声波清洗机中、超声功率为3000w以下，纯化水与小肠粘膜下层组织材料体积比为30︰1，直至检测电导率为10μs/cm以下终止；清洗后晾干水分；(4)脱细胞：采用的脱细胞液为包含质量百分比0.1％的胰蛋白酶和浓度为0.04mmol/l的edta的ph值为7的pbs溶液，超声振荡清洗30分钟，温度20℃，溶液与小肠粘膜下层组织材料比例为20：1，脱细胞过程在双频超声波清洗机中进行，包含其中第一频率范围为20khz，高频频率为80khz，其中低频处理5min，高频处理5min，温度范围为20-35℃，超声功率5000w。(5)清洗过程：完成后在超声波清洗机中用pbs溶液清洗，然后用降温至25℃的注射用水清洗至检测清洗后的注射用水与清洗前的注射用水电导率差为1μs/cm以下终止；其中pbs溶液温度为25℃，pbs溶液与小肠粘膜下层组织材料的体积比为30︰1，清洗3次，每次25分钟，在超声波清洗机中、超声功率为5000w以上；注射用水清洗过程中，超声功率为3000w以下，注射用水水与小肠粘膜下层组织材料体积比为30︰1。(6)固定成形：该步骤在模具上进行，模具由带针底板、盖板与压块三部分组成，将一层或多层小肠粘膜下层基质材料平铺于带针底板上，产品上面覆盖有不透气的盖板，盖板的面积应为最终裁剪的尺寸或更宽，盖板上压5～10公斤的压块，使成一固定形状，让水分从四周溢出；上下层之间紧紧粘住。其中盖板优选不锈钢板，压块优选不锈钢块。(7)干燥：该步过程在热循环百级烘箱中进行。开启烘箱风机，预热至30℃，将上过模具的产品放于烘箱中，时间约16小时，将压块取下，取下盖板，再次放于烘箱中干燥，时间约需6小时干燥完成。(8)小肠粘膜下层基质浆料制备膜下层组织材料浆料的破碎步骤中将小肠粘膜下层和液氮送入破碎装置中，小肠粘膜下层材料被液氮冷冻，利用破碎装置的高速旋转刀头进行破碎，破碎时间1-60min，经过筛网筛选的小肠粘膜下层组织的颗粒平均粒径200微米；向所述颗粒加入醋酸溶液形成小肠粘膜下层基质材料浆料；其中所述醋酸溶液质量百分比浓度为0.3％，小肠粘膜下层基质材料与醋酸溶液质量比为1:40。(9)复合成形在(6)步骤中模具上的烘干成形的产品上覆盖步骤(8)中小肠粘膜下层基质膏状混合物，使用刮平工具将膏状混合物均匀平铺在烘干产品上表面，厚度为3mm。(10)真空冷冻干燥对步骤(9)中得到的带有膏状混合物的小肠粘膜下层组织进行真空冷冻干燥。将模具平铺于真空冷冻干燥机中，关闭冻干室的门，打开循环泵约1分钟，开启压缩机对冻干箱致冷，将产品预冻至-45℃，保温约2小时，开启真空泵，调节产品温度约-15℃升华，约6小时后，调节产品温度0℃，保温2小时，调节产品温度25℃，保温4小时，真空冷冻干燥完成。对本实施例所得材料进行化学成分检测，结果如下表1所示：表1本发明实施例样品的化学成分蛋白(％)碳水化合物(％)脂类(％)水分％灰分％75-8515-25<1<5<1实施例2：制备方法还可以包括以下步骤：(11)打孔包装：烘干的产品取出后，切割成固定的形状，再放入机械打孔机中，以间距0.9cm进行打孔，孔直径1.5毫米，采用双层特卫强包装袋包装，该过程需要无菌转运与操作。(12)灭菌解析：产品采用环氧乙烷灭菌，灭菌条件：温度40℃，保温时间4小时，湿度70％，浓度为500mg/l，灭菌时间6小时；解析过程：通风的解析室中，温度控制在20℃之间，时间约14天。对实施例中样品进行力学性能检测，检测项目与结果如下：1)缝合抗拉强度：按照实施例1制备样品，用3-0非吸收缝合线在修补片一端边缘2毫米处，将缝合线与修补片的另一端固定在拉力仪上，以20mm/min的速度进行拉伸，直到缝合点被撕裂，记录最大力值，结果显示，最大值可达13n。2)抗张强度：按照实施例1制备样品，将样品裁剪成2cm×5cm尺寸，在相对湿度为40％-60％，温度为22℃±2℃的条件下放置2小时后立即进行试验。将试样两端固定在拉伸试验机的夹头上，以100mm/min的速度依次向外拉伸直到试样断裂，纵向试样和横向试样分别进行试验。最后的测定结果显示纵向抗张强度可达32n，横向抗张强度可达18n。对实施例中样品进行化学成分检验，检测项目与结果如下：1)dna残留：依据生物制剂残留dna检测方法《中国药典》2015年版第四部，采用荧光染色法检测实施例1所提供的样品dna残留量，结果：实施例1所提供的样品的dna残留量小于10ng/mg。2)半乳糖苷酶(α-gal)清除率：取动物源性生物材料gal阳性参考品，gal抗原阴性参考品各2mg，加裂解液1ml，裂解30-90分钟，配制成20、10、5、2.5、1.25、0.625μg的gal标准曲线样品，测试脱细胞前后的测试品各取50mg，加裂解液2ml，裂解30-90分钟；取裂解液与m86抗体反应后的上清液，加入96孔板，加二抗，加显色剂，采用elisa方法450nm检测吸光度值，按标准曲线计算出样品的gal值，脱细胞处理前材料的gal值为23.41±2.34×1014/mg，实施例1中样品的gal值为0.13±0.02×1014/mg，半乳糖苷酶(α-gal)清除率在99.4％以上。3)病毒检测：选择伪狂犬病毒为指示病毒，采用实时定量pcr法检测病毒的dna拷贝数，检测3批样品。结果：病毒dna拷贝数为0。4)细菌内毒：按照gb/t14233.2-2005《医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分：生物学试验方法》进行检测，共3批样品，结果：细菌内毒小于20eu/包装。5)环氧乙烷残留量：按gb/t14233.1-2008《医用输液、输血、注射器具检验方法第1部分：化学分析法》中9的规定的方法试验，结果：产品环氧乙烷残留量不超过10μg/包装。6)重金属检查：铅、铬按gb/t14233.1-2008中5.9.1《医用输液、输血、注射器具检验方法第1部分：化学分析法》规定的方法试验，汞、砷按gb/t14233.1-2008中5.9.3《医用输液、输血、注射器具检验方法第1部分：化学分析法》规定的方法试验，产品检验液中铅、铬、汞、砷总重金属含量少于1ug/g。7)生长因子残留量：对实施例1中样品采用elisa法检测样品中碱性生长因子(bfgf)和血管内皮生长因子(vegf)含量，并对脱细胞前动物组织作为对照。结果发现碱性生长因子(bfgf)洗脱细胞前后含量分别为2632±328ng/l、1080±134ng/l，保留生长因子40％以上；血管内皮生长因子(vegf)含量洗脱细胞前后含量分别为760±5ng/l、294±20ng/l，保留生长因子35％以上。对实施例1中样品进行生物相容性实验，检测项目包括：热原、细胞毒性、迟发型超敏反应、皮内反应、急性全身毒性、ames试验、小鼠淋巴瘤细胞突变试验、染色体畸变、植入、亚慢性毒性1)热原按质量比1：5浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水。按gb/t14233.2-2005规定的方法进行，产品无热原反应。2)细胞毒性按质量比1：5浸提介质的比例，37±1℃，24±2hr制备试验液，浸提介质：含血清的mem培养基。取试验液按照gb/t16886.5-2003中规定的试验方法进行试验，结果产品的细胞毒性反应不大于1级。3)迟发型超敏反应按质量比1：5浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水和棉籽油。按照gb/t16886.10-2005第10部分:刺激与迟发型超敏反应试验方法规定进行试验，结果产品无迟发型超敏反应。4)皮内反应按质量比1：5浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水和棉籽油。按照gb/t16886.10-2005第10部分:刺激与迟发型超敏反应试验试验方法规定进行试验，结果：试验样品与溶剂对照平均记分之差小于1.0。5)急性全身毒性按质量比1：5浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水和棉籽油。取试验液按照gb/t16886.11-2011规定的试验方法进行试验，结果：产品无急性全身毒性反应。6)ames试验按质量比1：5浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水和dmso。按gb/t16886.3-2008规定的方法进行，结果：产品的ames试验为阴性。7)小鼠淋巴瘤细胞突变试验按质量比1：5浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水和dmso。按gb/t16886.3-2008规定的方法进行，结果：产品的小鼠淋巴瘤细胞突变试验为阴性结果8)染色体畸变试验按质量比1：5浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水和dmso，按gb/t16886.3-2008规定的方法进行，结果：产品的染色体畸变试验为阴性9)植入按gb/t16886.6-1997规定的方法进行，结果：肌肉植入1周：样品周围可见嗜中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞浸润，应无囊腔形成；肌肉植入4周：样品周围可见少量巨噬细胞和淋巴细胞，胶原纤维和纤维母细胞增生，有纤维囊腔形成；肌肉植入12周：样品周围可见少量淋巴细胞、胶原纤维、纤维囊腔较致密规整。10)亚慢性毒性按gb/t16886.11规定的方法进行，结果：无亚慢性毒性反应。本发明所使用小肠粘膜下层组织材料可以为猪或牛小肠粘膜下层组织材料。综上，本发明异形生物止血材料：(1)保留细胞外基质中胶原蛋白纤维的三维空间结构；(2)保留细胞外基质中活性生长因子；(3)通过控制产品的超声功率，能够在高功率的情况下，达到破碎细胞、dna的效果，在低功率的情况下，将破碎的细胞内物质有效的清洗掉；(4)dna残留能够达到10ng/mg以下，较同类产品低30-50ng/mg、半乳糖苷酶去除率较高，能够达到99.4％以上。(5)力学强度更强，能够承受更大的力学性能，能够有效的控制降解时间；(6)塑形较好，多层复合不分层；(7)采用烘干材料与冻干材料相结合的方式，形成了上层疏松、下层致密的双层复合结构。疏松层孔隙率大，有利于止血以及细胞的长入。本发明的上述实施例是对本发明的说明而不能用于限制本发明，与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。当前第1页12