一种治疗肿瘤的药物组合的制作方法

本发明涉及一种治疗肿瘤的药物组合，属于基因修饰细胞及肿瘤治疗技术领域。

背景技术：

嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor，简称：car)修饰的细胞是一种结合细胞免疫治疗和抗体靶向治疗的治疗手段，具有特异性识别并杀伤肿瘤细胞的能力，是一种全新的很有前景的肿瘤免疫治疗策略，能够显著提高细胞对靶细胞的杀伤力、增殖能力、体内维持时间、细胞因子的释放等，目前在临床应用的例已取得令人振奋的结果，有完全治愈急性或慢性淋巴细胞白血病的报道。

car应用的关键在于确定一种肿瘤相关抗原，这种抗原在肿瘤细胞表面高表达，而在正常组织中低表达或无表达。mucin1是膜结合型粘蛋白家族成员，简称muc1。muc1是一种异源二聚体跨膜糖蛋白，由氮端亚单位(muc1-n)和碳端亚单位(muc1-c)组成。muc1在多种上皮来源的肿瘤组织中异常表达，其与肿瘤的发生发展密切相关，可通过调控多个信号通路调节细胞恶性转化，是促进肿瘤发生与发展的重要癌基因。由于muc1在肿瘤细胞中的表达糖基化不全，并失去极性，遍布于整个细胞表面，容易被抗体识别，因此，构建muc1靶向嵌合抗原受体(car)t细胞，对表达muc1相关恶性肿瘤靶向细胞免疫治疗具有重要的理论和临床应用价值。

间充质干细胞(mesenchymalstemcells，简称：mscs)是来自于中胚层，并且可以向三个胚层分化的一类干细胞，在组织工程等方面有广泛的用途，是国内外广泛关注的一类细胞。目前从脐带的不同的组织部位都获得了间充质干细胞，而其主要来源是血管间的华通胶基质。与骨髓间充质干细胞相比，人脐带间充质干细胞(humanumbilicalcordmesenchymalstemcells,简称：hucmscs)以其易得、原始、增殖力强、免疫原性低、不涉及法律伦理等优势而越来越受到人们的重视。

肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor，简称：hgf)是一种肝细胞特有的血小板衍生促有丝分裂剂，可通过多个信号通路促进细胞增殖，并能促使原代培养肝细胞dna合成和细胞分裂，并且作为一种可以诱导上皮细胞分散(细胞离散和运动)的成纤维细胞衍生因子，能诱导细胞增殖、分散、迁移、器官形态形成、血管发生等一系列生物效应，对组织修复和胚胎发育起重要作用。

技术实现要素：

本发明提供一种治疗肿瘤的药物组合，以antimuc1car-t细胞对肿瘤进行特异性识别以及杀伤，联合msc-hgf增强人体免疫功能并促进组织再生修复，从而达到在一定程度上强杀伤肿瘤细胞的效果以应用于相应肿瘤疾病的预防和治疗。

本发明提供一种治疗肿瘤的细药物合，包括antimuc1car-t细胞，和人源肝细胞生长因子过表达的人脐带间充质干细胞msc-hgf。

在本申请的方案中，所述antimuc1car-t细胞和msc-hgf，二者作为整体称作本发明的治疗肿瘤的药物组合，该治疗肿瘤的药物组合在施用过程中，antimuc1car-t细胞用于对肿瘤细胞进行特异性识别以及杀伤，msc-hgf用于增强人体免疫功能并促进组织再生修复。

本发明的治疗肿瘤的药物组合是一种生物制剂，可以以注射制剂的形式实施具体治疗方式，例如将其用生理盐水悬浮后制成注射液的形式对患者进行注射。

在本发明所提供的方案中，肿瘤为腺体类肿瘤，尤其可以为乳腺肿瘤、、卵巢癌、肺癌以及胰腺肿瘤。

在本发明所提供的方案中，所述antimuc1car-t细胞在t细胞内表达scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白；所述scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白中，所述scfv用于结合所述muc1蛋白，并且所述scfv的氨基酸序列为所述scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白的第一序列，所述scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白的第一序列为：

evqlqqsggglvqpggsmklscvaskftfsnywmnwvrqspekglewvaeirlksnnyathyaesvkgrftisrddskssvylqmnnlraedtgiyyctfgnsfaywgqgttvtvssggggsggggsggggsdivvtqesalttspgetvtltcrsstgavttsnysnwvqekpdhlftgliggtnnrapgvparfsgskigdkaaltitgaqtedeaiyfcalwesnhwvfgggtkltvlgse

该antimuc1car-t细胞以muc1为靶点，具体地，所述antimuc1car-t细胞的嵌合抗原受体car包括胞膜外抗原结合区、铰链区和胞内信号传导区，所述胞膜外抗原结合区为scfv，所述铰链区为igd，所述胞内信号传导区为cd28–ox40–cd3ζ。图1为是本发明的治疗肿瘤的药物组合中的antimuc1car设计示意图，请参考图1。

进一步地，所述scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白中，所述igd的氨基酸序列为第二序列。

具体地，第二序列为：

tftcfvvgsdlkdahltwevagkvptggveegllerhsngsqsqhsrltlprslwnagtsvtctlahpslppqrlmalrepaaqapvklstnllassdppeaa

进一步地，所述scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白中，所述cd28的氨基酸序列为第三序列。

具体地，第三序列为：

fwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrskrsallhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrs

进一步地，所述scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白中，所述ox40的氨基酸序列为第四序列，所述cd3ζ的氨基酸序列为第五序列。

具体地，第四序列为：

rrdqrlppdshkppgggsfrtpiqeeqadahstlaki

具体地，第五序列为：

rvkfsrsaeppayqqgqnqlynelnlgrseeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr

进一步地，所述scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白中，

所述scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白的氨基酸序列为第六序列。

具体地，第六序列为：

evqlvqsgaevkkpgesltisckasgysfpnywitwvrqmsggglewmgridpgdsyttynpsfqghvtisidkstntaylhwnslkasdtamyycaryyvslvdiwgqgtlvtvssggggsggggsggggsqsvltqpasvsgspgqsitisctgtsskvggynyvswyqqhpgkapklmiydvnnrpsevsnrfsgsksgntasltisglqaedeadyykssyttgsravfgggtkltvlgtftcfvvgsdlkdahltwevagkvptggveegllerhsngsqsqhsrltlpralwnagtsvtctlnhpslppqrlmalrepaaqapvklslnllassdppeaafwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrsrrdqrlppdahkppgggsfrtpiqeeqadahstlakirvkfsrsaeppakqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr

进一步地，所述msc-hgf中，所述人源肝细胞生长因子的氨基酸序列为所述msc-hgf的第一序列，所述msc-hgf的第一序列为：

mwvtkllpalllqhvllhllllpiaipyaegqrkrrntihefkksakttlikidpalkaktkkvntadqcanrctrnkglpftckafvfdkarkqclwfpfnsmssgvkkefghefdlyenkdyirnciigkgrsykgtvsitksgikcqpwssmiphehsflpssyrgkdlqenycknprgeeggpwcftsnpevryevcdipqcsevecmtcngesyrglmdhtesgkicqrwdhqtphrhkflperypdkgfddnycrnpdgqprpwcytldphtrweycaiktcadntmndtdvpletteciqgqgegyrgtvntiwngipcqrwdsqyphehdmtpenfkckdlrenycrnpdgsespacfttdpnirvgycsqipncdmshgqdcyrgngknymgnlsqtrsgltcsmwdknmedlhrhifwepdasklnenycrnpdddahgpwcytgnplipwdycpisrcegdttptivnldhpeiscaktkqlrvvngiptrtnigwmvslryrnkhicggslikeswvltarqcfpsrdlkdyeawlgihdvhgrgdekckqvlnvsqlvygpegsdlvlmklarpavlddfvstidlpnygctipektscsvygwsytglinydgllrvahlyimgnekcsqhhrgkvtlneseicagaekigsgpwegdyggplvceqhkmrmvlgvivpgrgcaipnrpgifvrvayyakwihkiiltykvpqs。

进一步地，所述antimuc1car-t细胞通过第一慢病毒感染t淋巴细胞获得，所述第一慢病毒通过携带有所述scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白的慢病毒表达载体感染293t细胞得到。

进一步地，所述msc-hgf通过第二慢病毒感染所述人脐带间充质干细胞获得，所述第二慢病毒通过带有所述人源肝细胞生长因子序列的慢病毒表达载体感染293t细胞得到。

本发明的所述药物组合中的antimuc1car-t细胞和msc-hgf均为单位制剂。所述单位制剂为满足一次给药所需有效成分的制剂，如一单位(针)针剂等。患者一次施用所需的药物的量可以方便地通过计算患者的体重和该患者一次用药所需单位体重剂量的乘积得到。

更进一步的，根据申请人针对小鼠的实验，针对人的antimuc1car-t细胞单位制剂中可以包括1×10⁷-10×10⁸个antimuc1car-t细胞，所述msc-hgf单位制剂中可以包括1×10⁶-10×10⁷个msc-hgf。

根据本发明的方案，可以根据需要控制治疗肿瘤的药物组合中的antimuc1car-t细胞用量，方便对不同阶段的肿瘤患者的给药。所述antimuc1car-t细胞的量可以根据肿瘤种类，以及所要治疗的肿瘤患者的患病阶段，通过适当摸索而确定。一般在应用过程中，该药物组合中的antimuc1car-t细胞的量为msc-hgf的量的10倍。

本发明的治疗肿瘤的药物组合中，antimuc1car-t细胞将muc1抗体用于car-t细胞的构建，从而能够对muc1蛋白高表达的肿瘤细胞进行高效识别与结合；msc-hgf中，hgf可以诱导msc向特定组织样细胞分化，促进组织再生和修复。因此本发明的治疗肿瘤的药物组合能够通过识别环节、杀伤环节以及修复环节对癌症实施高效治疗。

附图说明

图1为是本发明的治疗肿瘤的药物组合中的antimuc1car设计示意图；

图2是本发明的治疗肿瘤的药物组合治疗乳腺癌(mcf-7)移植瘤模型小鼠后小鼠生存期示意图；

图3是本发明的治疗肿瘤的药物组合治疗胰腺癌(bxpc-3)移植瘤模型小鼠后小鼠生存期示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

antimuc1car-t细胞的制备

1、构建慢病毒表达载体

通过常规的基因工程手段，合成scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白基因序列，将scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白基因序列克隆到慢病毒表达载体上，获得scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ慢病毒表达载体pgreenpuro-car。其中，scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白的各序列如前所述。

2、慢病毒包装

1)用质量分数为10wt％胎牛血清(fetalbovineserum,简称：fbs)的1640培养基培养293t细胞；

2)将293t细胞以3x10⁵/cm²的密度传至直径15cm的培养皿中培养20h，保证转染时细胞汇合度为80-90％；

用不含血清的1640培养基换液，备用；

3)取两个ep管，分别在两个ep管中加入1ml1640，将慢病毒载体pgreenpuro-car与pmdlgprre、prsv-rev和pmd2.g质粒按照摩尔比1：1：1：1于其中一个ep管中混匀；在另一个ep管中加入150ullipo2000，混匀放置5min；将混有lipo2000的1640加入含有质粒的ep管中，混匀得混合液，室温放置20min，然后将混合液逐滴加入上述2)中制备的细胞培养皿中，继续培养4h后，用含10％fbs的1640培养基更换培养液，继续培养48h后收集细胞上清液，获得被scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白包装的慢病毒。

3、慢病毒纯化

将2中获得的被包装的慢病毒用0.22μm过滤膜过滤，滤液收集在50ml超滤管中，以3000g/min的速度离心45min；将剩余的上层病毒浓缩液转移至ep管，放-80℃保存备用。

4、cd8+t细胞的分离

1)全血倒入50ml离心管，室温离心20分钟，控制离心力ref为700g(普通离心)；

2)取上述离心下部细胞成分，加杜氏磷酸盐缓冲液dpbs至50ml；

3)分别取25ml上述液体加到20ml人淋巴细胞分离液,将离心管室温离心15分钟，控制离心力ref为800g；

5)取白膜层细胞，加入dpbs，补足至50ml；

6)离心10分钟，控制离心力ref为600g，弃上清液，得外周血单个细胞(peripheralbloodmononuclearcell，简称：pbmc)；

7)采用cd8+t细胞磁珠分选试剂盒分选cd8+t细胞。

5、慢病毒载体感染t淋巴细胞

用质量分数为10wt％fbs的rpmi1640完全培养基培养cd8+t细胞，第一天加入抗cd3单克隆抗体活化；第三天加入150moi的3中纯化后的慢病毒(antimuc1car)，16h后将培养基更换为含有50iu/ml重组人il-2的rpmi1640完全培养基，继续培养10-20天，得到antimuc1car-t细胞。

实施例2

msc-hgf的制备

1、构建慢病毒表达载体

通过常规的基因工程手段，合成hgf融合蛋白基因序列，将hgf基因序列克隆到慢病毒表达载体上，获得hgf慢病毒表达载体pgreenpuro-car。其中，hgf序列如前所述。

2、慢病毒包装

1)用质量分数为10wt％胎牛血清(fetalbovineserum,简称：fbs)的1640培养基培养293t细胞；

2)将293t细胞以3x10⁵/cm²的密度传至直径15cm的培养皿中培养20h，保证转染时细胞汇合度为80-90％；

用不含血清的1640培养基换液，备用；

3)取两个ep管，分别在两个ep管中加入1ml1640，将慢病毒载体pgreenpuro-hgf与pmdlgprre、prsv-rev和pmd2.g质粒按照摩尔比1：1：1：1于其中一个ep管中混匀；在另一个ep管中加入150ullipo2000，混匀放置5min；将混有lipo2000的1640加入含有质粒的ep管中，混匀得混合液，室温放置20min，然后将混合液逐滴加入上述2)中制备的细胞培养皿中，继续培养4h后，用含10％fbs的1640培养基更换培养液，继续培养48h后收集细胞上清液，获得被hgf氨基酸序列包装的慢病毒。

3、慢病毒纯化

将2中获得的被包装的慢病毒用0.22μm过滤膜过滤，滤液收集在50ml超滤管中，以3000g/min的速度离心45min；将剩余的上层病毒浓缩液转移至ep管，放-80℃保存备用。

4、人脐带间充质干细胞hucmscs的分离培养

脐带标本取自健康足月妊娠产妇的新生儿脐带(合作医院产科提供，经医院伦理委员会批准同意，产妇签署知情同意书)。

将无菌条件下取得的新鲜足月剖宫产胎儿脐带剪切成1～2cm大小的片段，放入培养皿中，并浸泡在生理盐水中，洗净残留液，剔除脐带动静脉血管避免内皮细胞污染，取出其中的华通氏胶(wharton’sjelly)剪碎成大小约1mm³小片段，以含10％fbsdmem/f12培养基重悬，接种于25cm²的培养瓶中，放置在37℃、5％co2的培养箱中培养。期间注意观察细胞形态变化。1周后首次换液，加入10ml完全培养基继续培养，此后3～4d换液一次。

5、慢病毒载体感染hucmscs

1x10⁶hucmscs加入150moi的3中纯化的慢病毒(hgf)，6h后更换为完全培养基，继续培养3天，获得msc-hgf。

实施例3

本发明的治疗肿瘤的药物组合(antimuc1car-t细胞+msc-hgf)的制备

利用20ml生理盐水将1×10⁷-antimuc1car-t细胞制成antiafpcar-t细胞单位制剂，利用20ml生理盐水将1×10⁶个msc-hgf制成msc-hgf单位制剂。混合antimuc1car-t细胞单位制剂与msc-hgf单位制剂，得到本发明的治疗肿瘤的药物组合。

实施例4

本发明的治疗肿瘤的药物组合对肿瘤细胞的杀伤作用

取6周龄雌裸鼠40只，其中20只裸鼠右腋下皮下注射5x10⁶mcf-7(乳腺癌)细胞，另外20只皮下注射5x10⁶bxpc-3(胰腺癌)细胞，待肿瘤长到60mm³大小，每种肿瘤模型随机分成4组：对照组、antimuc1car-t细胞组、msc-hgf细胞组、antimuc1car-t细胞+msc-hgf治疗组；对照组尾静脉注射生理盐水200ul/次，每周2次；antimuc1car-t细胞组尾静脉注射antimuc1car-t细胞(实施例1制备)1×10⁷个/次，每周2次；msc-hgf细胞组尾静脉注射msc-hgf细胞(实施例2制备)1×10⁶个/次，每周2次；antimuc1car-t细胞+msc-hgf治疗组尾静脉注射antimuc1car-t细胞+msc-hgf细胞(实施例3制备)，每周2次；统计100天内小鼠生存状态，做生存率曲线。图2是本发明的治疗肿瘤的药物组合治疗乳腺癌(mcf-7)移植瘤模型小鼠后小鼠生存期示意图；图3是本发明的治疗肿瘤的药物组合治疗胰腺癌(bxpc-3)移植瘤模型小鼠后小鼠生存期示意图。

图2与图3结果表明，本发明的药物组合(antimuc1car-t细胞+msc-hgf)可明显延长muc1高表达的乳腺癌和胰腺癌移植瘤小鼠模型的生存期。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。