胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗及其制备和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗及其制备和应用，该疫苗为ISCOM-DNA复合物，其制备方法包括胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4全长cDNA的克隆，肿瘤坏死因子BAFF全长cDNA的克隆，重组载体pStar-CPEB4/BAFF的构建，pStar-CPEB4/BAFF工程菌的构建，CPEB4的诱导表达，ISCOM-DNA复合物的制备。该疫苗在神经胶质瘤的防治方面具有良好的应用前景。本发明具有高效、低毒、制备方法简单等优点，可用于肿瘤免疫治疗的药物。
【专利说明】胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗及其制备和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4的免疫增强型疫苗，还涉及该疫苗的制备方法和用途。
【背景技术】
[0002]脑胶质瘤是人体中枢神经系统最常见的肿瘤，尽管采取了多种方法进行积极治疗，但是预后仍不够理想。胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白(cytoplasmicpolyadenylation element-binding proteins, CPEBs)是一组介导 mRNA 胞质多聚腺苷酸化和翻译的RNA结合蛋白。近年来，人们发现其在大多数肿瘤细胞中有异常表达现象。随着CPEBs与肿瘤关系的研究开展，国外已有研究报道CPEB4在胶质母细胞瘤中呈阳性表达，并且其阳性率与肿瘤恶性程度的呈正相关。因此，CPEB4有望成为胶质瘤的一个新的治疗靶点。
[0003]BAFF是B细胞存活与成熟的必需因子，也被称为肿瘤坏死因子和凋亡配体相关的白细胞表达配体，为TNF家族成员，是II型跨膜蛋白，N末端在胞内无信号肽，C末端为胞外区，其中47~73位氨基酸为跨膜区，74~285位氨基酸为胞外区，133~285位氨基酸为其发挥功能的主要区域，128~285位氨基酸残基区域含有与受体结合的结构域。BAFF有膜结合蛋白和可溶性配体(hsBAFF)两种形式存在。hsBAFF能够增强B细胞、CD4 T细胞、N K细胞的活性，使机体的免疫应答增强。BAFF不仅是B细胞的存活因子，还对T细胞激活有共刺激作用。T细胞和树突状细胞表达的BAFF可作为T细胞激活的共刺激因子，人重组或内源BAFF刺激T细胞分泌IFN-Y和IL-2，上调⑶25 ( IL22受体α链)表达，并以IL-2依赖方式促进T细胞增生。
[0004]免疫刺激复合物(ISC0M)是一种新型的蛋白质疫苗佐剂，可增强蛋白质抗原诱导体液和细胞免疫应答，包括抗体的`产生、迟发性超敏反应、细胞毒性T细胞的激活等。ISCOM与裸DNA混合制备DNA疫苗诱导的中和抗体水平和免疫保护力，明显高于单独使用裸DNA，说明ISCOM还具有增强DNA疫苗免疫效果的作用。可能的机制是经ISCOM包裹的DNA能免受体内核酸酶的降解，从而保证DNA疫苗在鸡体内的持续表达。另外，ISCOM的结构特性使其更易于定居在淋巴组织内，有利于APC吞噬ISC0M-DNA复合物。ISCOM具有制备简单、价格低廉等优点。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗及其制备方法，以及基于此疫苗的应用，为胶质瘤的治疗提供新的治疗策略。
[0006]为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下:
一种胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗为ISC0M-DNA复合物，每毫升中含有0.1mg 胆固醇、0.1mg 卵憐脂、Img QuilA 和 0.5mg 质粒 pStar_CPEB4 /BAFF。
[0007]—种胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗的制备方法，包括以下步骤:(1)胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4全长CDNA的克隆
从胶质瘤细胞提取总RNA，然后逆转录为cDNA，以该总cDNA为模板，以Fl:5，-aatctgcagatgggggattacgg _3，，R1:5，_tacgaattcgctggaactaa_3，为上下游引物进行PCR扩增，扩增条件为:94°C预变性3分钟，然后94°C变性I分钟、58°C退火I分钟，72°C延伸I分钟，共30个循环，最后72°C延伸7分钟。
[0008](2)肿瘤坏死因子BAFF全长cDNA的克隆
提取人脾脏组织总RNA，反转录得到总cDNA，再以该总cDNA为模板，以F2:5’-gatcggatccatggatgactccacagaaagg-3’ 和 R2:5’ -acgcgtcgactcacagcagtttcaatgcac-3> 为上下游弓丨物，PCR扩增BAFF全长cDNA，扩增条件为:94°C预变性5分钟，然后94°C变性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分钟，共30个循环；最后72°C延伸10分钟。
[0009](3)重组载体 pStar_CPEB4 /BAFF 的构建
将CPEB4全长cDNA插入pStar载体的IRES上游，再将BAFF全长cDNA插入pStar载体的IRES下游。
[0010](4)pStar-CPEB4 /BAFF 工程菌的构建
将CPEB4原核表达载体pStar-CPEB4 /BAFF用Sal I酶切使线性化，用电穿孔法转化毕赤酵母GSl 15感受态细胞，获得高拷贝CPEB4工程菌。
[0011](5)CPEB4的诱导表达
用甲醇诱导工程菌表达CPEB4，并进行分离纯化，得到高纯度的CPEB4。
[0012]纯化的方法为:培养上清液加入质量百分浓度为80%的硫酸铵使蛋白质沉淀，离心弃上清，蛋白质沉淀用浓度为0.02mol/L、pH为8.0的磷酸盐缓冲液(PBS)透析脱盐，再用琼脂糖凝胶(Q-Sepharose)柱进行分离纯化,用浓度为lmol/L的氯化钠溶液线性梯度洗脱，收集含有CPEB4的洗脱液，适当浓缩后用葡聚糖凝胶(S印hdex G-25)柱脱盐。
[0013](6) ISC0M-DNA复合物的制备
0.lmg/ml 胆固醇、0.lmg/ml 卵憐脂、lmg/ml QuilA 和 0.5mg/ml 质粒 pStar_CPEB4/BAFF，反复混匀并充分乳化使溶液完全清晰，混合物经透析后形成微絮状物即ISC0M-DNA 复合物。
[0014]一种胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗在神经胶质瘤防治中的应用。
[0015]本发明将CPEB4与BAFF重组真核表达载体有效地包封在脂质体中形成纳米级颗粒，来发挥抗肿瘤的作用，具有高效、低毒、制备方法简单等优点，可用于肿瘤免疫治疗的药物，在神经胶质瘤的防治方面具有良好的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为PCR扩增CPEB4基因的琼脂糖凝胶电泳结果。
[0017]图2为PCR扩增BAFF基因的琼脂糖凝胶电泳结果。
[0018]图3为蛋白免疫印迹(Western Blot)鉴定CPEB4。
[0019]图4为酶联免疫斑点(ELISP0T)法检测激发T分泌IFN-Y的能力，其中，实验组为=ISCOM复合物，空白对照组为:含有空白质粒的复合物，阴性对照组为:PBS。
[0020]图5为51Cr释放法检测激发T细胞对胶质瘤细胞U251的特异性杀伤效应，其中，实验组为=ISCOM复合物，空白对照组为:含有空白质粒的复合物，阴性对照组为:PBS。【具体实施方式】
[0021]实施例1
以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，见分子克隆实验指南(第三版，J-萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0022]1、CPEB4 全长 cDNA 的克隆
根据GenBank登录号为NM_030627的CPEB4基因序列，设计并合成如下引物以PCR扩增两端带有酶切位点的 CPEB4 cDNA 全长:F1:5，-aatctgcagatgggggattacgg _3’(SEQ IDN0.1)，下划线部分为 Pst I 酶切位点；R1:5’-tacgaattcgctggaactaa-3，(SEQ ID N0.2),下划线部分为EcoR I酶切位点。
[0023]分离手术后患者的胶质瘤细胞，用RPMI 1640培养基常规培养，调节细胞密度为2X IO7个/mL，收集细胞，PBS洗涤3次，用总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA ;将所得细胞总RNA逆转录为cDNA，再以该cDNA为模板、Fl和Rl为上下游引物进行PCR扩增，PCR条件为:94°C预变性3分钟，然后94°C变性I分钟、58°C退火I分钟，72°C延伸I分钟，共30个循环，最后72°C延伸7分钟；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与P-T Easy载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取阳性克隆质粒，委托上海生工公司测定质粒序列，将插入了CPEB4 cDNA全长序列(SEQ ID N0.3)的阳性克隆质粒命名为pT_CPEB4。
[0024]PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图1，其中M泳道为DNA分子量标准，I泳道为PCR产物，可见PCR产物在约2000bp处呈单一特异性条带，与目的片段大小相符。
[0025]2、BAFF 全长 cDNA 的克隆
按Trizol试剂盒说明书提取人脾脏组织总RNA，反转录得到总cDNA，再以该总cDNA为模板，以 F2:5，_gatcggatccatggatgactccacaga aagg_3’(SEQ ID N0.4,下划线部分为BamHI 酶切位点)和 R2:5，-acgcgtcgactcacagcagtttcaatgcac-3’ (SEQ ID N0.5,下划线部分为Sal I酶切位点)为上下游引物，PCR扩增BAFF全长cDNA，PCR反应体系为50 μ 1，循环条件参数为:94°C预变性5分钟；然后94°C变性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分钟，共30个循环；最后72°C延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与pT-Easy载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，测序鉴定，将阳性克隆质粒命名为pT-BAFF。
[0026]琼脂糖凝胶电泳结果见图2，其中M泳道为DNA分子量标准，I泳道为PCR产物。结果显示PCR产物在约SOObp处呈单一特异性条带，与预期结果相符；测序结果显示阳性克隆质粒的插入基因序列与GenBank登录号为NM_006573的BAFF全长cDNA序列一致(SEQ IDN0.6)。
[0027]3、重组载体 pStar_CPEB4 /BAFF 的构建
根据CPEB4和BAFF全长cDNA两端所设计的酶切位点，首先将CPEB4全长cDNA插入pStar载体的IRES上游，再将BAFF全长cDNA插入pStar载体的IRES下游。具体方法为:先将PT-CPEB4载体用Pst I和EcoR I双酶切，双酶切产物经凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与同样经Pst I和EcoR I双酶切的pStar载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，Pst I和EcoR I双酶切鉴定，将阳性克隆质粒命名为pStar-CPEB4 ;再将pT_BAFF载体用BamH I和Sal I双酶切，双酶切产物经凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与同样经BamH I和Sal I双酶切的pStar-CPEB4载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，BamH I和Sal I双酶切鉴定，将阳性克隆质粒命名为pStar-CPEB4 -1RES-BAFF。
[0028]4、pStar-CPEB4 /BAFF 工程菌的构建
将CPEB4原核表达载体pStar-CPEB4 /BAFF用Sal I酶切使线性化，用电穿孔法转化毕赤酵母GSl 15感受态细胞，转化产物涂布于MD平板，30°C培养3~4天，挑取白色酵母菌落，分别点接于YPD平板(1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%琼脂粉)、MD和丽平板，30°C培养3飞天(每天向丽平板中添加甲醇100 μ L)，挑取MD平板上生长明显快于MM平板的酵母菌落，点接于含有浓度为4mg/mL的G418的YPD平板，30°C培养7天，所得酵母单菌落为高拷贝CPEB4工程菌。
[0029]5、CPEB4的诱导表达 将高拷贝CPEB4工程菌于30°C培养至0D600为2，按10%接种量接入BMGY培养基(ρΗ6.0, IOOmM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L,生物素0.4mg/L,甘油10mL/L)中，30°C培养24小时，5000g离心5分钟，弃上清，菌体用无菌水洗涤2次后，重悬于等体积的BMMY培养基(pH6.0, IOOmM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L,甲醇5mL/L)中，30°C诱导表达3天(每24小时补加诱导剂甲醇至最终体积百分浓度为0.5%)，40C、6000g离心5分钟，收集上清，加入质量百分浓度为80%的硫酸铵使蛋白质沉淀，离心弃上清，蛋白质沉淀用浓度为0.02mol/L、pH为8.0的磷酸盐缓冲液(PBS)透析脱盐，再用琼脂糖凝胶(Q-Sepharose)柱进行分离纯化,用浓度为lmol/L的氯化钠溶液线性梯度洗脱，收集含有CPEB4的洗脱液，适当浓缩后用葡聚糖凝胶(S印hdex G-25)柱脱盐，即得纯化的CPEB4。
[0030]Western Blot鉴定:取纯化的CPEB4，加入上样缓冲液，100°C加热3~5分钟，用质量百分浓度为12%的分离胶、质量百分浓度为5%的积层胶进行SDS-PAGE，电泳完毕后，将分离产物电转移至PVDF膜上，用质量百分浓度为5%的脱脂牛奶封膜，加入鼠抗人CPEB4单克隆抗体，温度37°C孵育I小时，洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG，温度37°C孵育I小时，洗膜，显色；同时设置阴性对照(不加入纯化的CPEB4 )。
[0031]结果见图3，其中I泳道为纯化的CPEB4，2泳道为阴性对照，可见I泳道有一明显蛋白条带，而2泳道未见相应条带。
[0032]6、免疫刺激复合物(ISC0M-DNA)的制备
每毫升ISC0M-DNA复合物中含有0.1mg胆固醇、0.1mg卵磷脂、Img QuilA和0.5mg质粒pStar-CPEB4 /BAFF反复混匀并充分乳化使溶液完全清晰，混合物经透析后形成微絮状物即ISC0M-DNA复合物，并进行无菌检验和物理性状检验。
[0033]7、ISC0M-DNA 的免疫
(I)体外诱导特异性的CTL
采用聚蔗糖-泛影葡氨分层液密度梯度离心法从HLA-A*0201阳性健康者的外周血浓缩白细胞中分离出外周血单个核细胞(PBMC)。将PBMC用RPMI 1640培养基在温度37°C、CO2气体体积分数为5%的条件下孵育2小时，分离非贴壁细胞[主要为淋巴细胞(PBL)]和贴壁细胞[树突状细胞(DC)]。将DC按细胞密度为2X 106/3ml加入含有浓度为800IU/ml的集落刺激因子(GM-CSF)、浓度为1000 IU/ml的白介素4 (IL-4)以及浓度为10% (w/w)的FCS的RPMI 1640培养基，在温度为37°C、C02气体体积分数为5%的条件下培养，每2天半量换液并补充GM-CSF和IL-4，第5天加入终浓度为10ng/ml的肿瘤坏死因子(TNF-α )，第7天获得成熟DC。向成熟DC中加入终浓度为IOM的ISCOM，在温度37°C、CO2气体体积分数为5%的条件下孵育2小时，30Gy放射性处理，获得负载肽的DC。按PBL与DC的数量比为3:1飞:I向PBL中加入负载肽的DC，再按PBL细胞密度为1.5 X 106/2ml加入含有浓度为10ng/ml的白介素7 (IL-7)以及浓度为10% (w/w)的FCS的RPMI 1640培养基，在温度为37°C、CO2气体体积分数为5%的条件下培养，第11天加入负载肽的DC再次刺激培养的PBL，24~48小时后向细胞培养液中加入浓度为10IU/ml的白介素2 (IL-2)并补充IL-7至终浓度为10ng/ml，之后每隔7天按照上述相同方法再次刺激培养的PBL，连续刺激4次，获得肽特异性CTL，用含有浓度为10% (w/w)的FCS的RPMI1640培养基调整至适当浓度，作为效应细胞。
[0034](2)特异性CTL对靶细胞的体外杀伤能力检测
将I X IO6个神经胶质瘤细胞U251转移至离心管中，用含有浓度为10% (w/w)的FCS的RPMI1640培养基洗涤I次，吸除大部分上清液，剩余约0.1ml培养基于管底，重悬细胞，加入相应量的51Cr溶液，在温度为37°C、C02气体体积分数为5%的条件下培养2小时，获得51Cr标记的靶细胞。在96孔板中，每孔分别按效靶比(E/T)为100: 1、50: I和25: I加入效应细胞与上述51Cr标记的靶细胞，每种效靶比设3个复孔，同时设最大释放孔(用浓度为2mol/L的盐酸替代效应细胞)和最小释放孔[用含有浓度为10% (w/w)的FCS的RPMI1640培养基替代效应细胞]。将96孔板1200r/min离心30秒，温度37°C孵育4小时，向最大释放孔中加入终浓度为2% (w/w)的Tri ton X-100并吹打混匀，孵育10分钟，再将96孔板1200r/min离心5分钟，分别吸取各孔上清液至SiCr计数管，用计数仪计数，计算不同效靶比时的杀伤率。
[0035]结果如图4所示，可见实验组在各效靶比对U251细胞均有特异性杀伤作用，且随着效靶比增大，特异性杀伤作用逐渐增强，说明ISCOM复合物能有效激发CTL的细胞毒活性，从而特异性杀伤靶细胞。
[0036](3)特异性CTL分泌IFN- Y的能力检测
采用ELISP0T检测试剂盒进行检测，具体操作参照试剂盒说明书:调整效应细胞密度至IX 106/ml，取100 μ I铺板，加入终浓度为10Μ的肽(按实验分组加入相应肽)，刺激48小时后去除细胞，按试剂盒说明书依次加入一抗、二抗和显色剂进行反应，显色晾干后读数。
[0037]结果如图5所示，可见实验组的斑点数均明显高于阴性对照组，说明ISCOM复合物具有良好的免疫原性，能够有效激发CTL分泌IFN- Y。
[0038]最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
【权利要求】
1.一种胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗，其特征在于:该疫苗为ISCOM-DNA复合物，每毫升中含有0.1mg胆固醇、0.1mg卵磷脂、Img QuilA和0.5mg质粒pStar-CPEB4 /BAFF。
2.一种如权利要求1所述的胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗的制备方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4全长cDNA的克隆； (2)肿瘤坏死因子BAFF全长cDNA的克隆； (3)重组载体pStar-CPEB4/BAFF的构建:将CPEB4全长cDNA插入pStar载体的IRES上游，再将BAFF全长cDNA插入pStar载体的IRES下游； (4)pStar-CPEB4/BAFF工程菌的构建:将CPEB4原核表达载体pStar_CPEB4 /BAFF用Sal I酶切使线性化，用电穿孔法转化毕赤酵母GS115感受态细胞，获得高拷贝CPEB4工程菌； (5)CPEB4的诱导表达:用甲醇诱导工程菌表达CPEB4，并进行分离纯化，得到高纯度的 CPEB4 ； (6)ISC0M-DNA复合物的制备。
3.如权利要求2所述的 胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗的制备方法，其特征在于:所述的步骤(1)从胶质瘤细胞提取总RNA，然后逆转录为cDNA，以该总cDNA为模板，以Fl:5，_aatctgcagatgggggattacgg _3，，R1:5，_tacgaattcgctggaactaa_3，为上下游引物进行PCR扩增，扩增条件为:94°C预变性3分钟，然后94°C变性I分钟、58°C退火I分钟，72°C延伸I分钟，共30个循环，最后72°C延伸7分钟。
4.如权利要求2所述的胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗的制备方法，其特征在于:所述的步骤(2)提取人脾脏组织总RNA，反转录得到总cDNA，再以该总cDNA为模板，以F2:5’-gatcggatccatggatgactccacaga aagg-3’和 R2:5’-acgcgtcgactcacagcagtttcaatgcac-3’为上下游引物，PCR扩增BAFF全长cDNA，扩增条件为:94°C预变性5分钟，然后94°C变性50秒，58 °C退火50秒，72 °C延伸2分钟，共30个循环；最后72°C延伸10分钟。
5.如权利要求2所述的胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗的制备方法，其特征在于:所述的步骤(5)纯化的方法为:培养上清液加入质量百分浓度为80%的硫酸铵使蛋白质沉淀，离心弃上清，蛋白质沉淀用浓度为0.02mol/L、pH为8.0的磷酸盐缓冲液透析脱盐，再用琼脂糖凝胶Q-Sepharose柱进行分离纯化,用浓度为lmol/L的氯化钠溶液线性梯度洗脱，收集含有CPEB4的洗脱液，适当浓缩后用葡聚糖凝胶S印hdex G-25柱脱盐。
6.如权利要求2所述的胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗的制备方法，其特征在于:所述的步骤(6) 0.lmg/ml胆固醇、0.lmg/ml卵磷脂、lmg/ml QuilA和0.5mg/ml质粒pStar-CPEB4 /BAFF，反复混匀并充分乳化使溶液完全清晰，混合物经透析后形成微絮状物即ISC0M-DNA复合物。
7.—种如权利要求1飞所述的胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4疫苗在神经胶质瘤防治中的应用。
【文档编号】C12R1/84GK103705920SQ201310593368
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年11月23日 优先权日:2013年11月23日
【发明者】袁邦清, 陈羽建, 沈汗超, 林立, 吴贤群 申请人:中国人民解放军南京军区福州总医院四七六医院