补骨脂在制备治疗儿童脂肪肝的药品中应用的制作方法

本发明涉及医药技术领域，具体地指一种补骨脂在制备治疗儿童脂肪肝的药品中应用。

背景技术：

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholicfattyliverdisease，nafld)呈现全球化、低龄化流行趋势，是儿童就诊消化专科或肝病专科的首要病因。肥胖与脂肪肝关系密切，我国儿童肥胖症的流行已是客观事实，肥胖儿童nafld患病率高达68.2％。起源于儿童期的nafld更是成人肝硬化、代谢综合征相关组分的主要后备人群。随着我国城市化进程、中产家庭崛起及“二胎”政策的全面开放，nafld迅速蔓延，已取代慢性病毒性肝炎，成为威胁我国儿童健康的重大问题。

目前，临床抗成人脂肪肝药物缺如，针对儿童nafld的有效药物就更加缺乏。然而，与成人不同，儿童非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholicsteatohepatitis，nash)汇管区病变(炎症和纤维化)通常较小叶内严重。近年来，“核因子κb(nuclearfactorκb，nf-κb)”相关炎症通路在nafld发病机制中的重要地位被不断证实。

中药补骨脂(psoraleacorylifolial.，pc)是儿科的传统常用药，具有温脾补肾壮阳的药用特点。该药的现代药理学研究主要与成人疾病相关，补骨脂具有治疗肿瘤和改善骨质疏松等功效，但目前，pc对儿童脂肪肝的治疗作用及其机制研究未见报道。

除抗肿瘤和改善骨质疏松等功效外，但是，pc对儿童脂肪肝的治疗作用及其机制研究未见报道。

技术实现要素：

本发明目的是提供了一种补骨脂在制备治疗儿童脂肪肝的药品中应用。

为实现上述目的，本发明提供的一种补骨脂在制备治疗儿童脂肪肝的药品中应用。

作为优选方案，所述儿童脂肪肝为儿童非酒精性脂肪性肝炎nash。

本发明还提供了一种治疗儿童脂肪肝的药物制剂，含有有效量的补骨脂和药学上可接受的辅料和/或辅料。

补骨脂还可以与其它化合物组合用于制备治疗儿童脂肪肝的药物制剂，特别是与胡芦巴组合制备用于治疗儿童脂肪肝的药物制剂。

进一步地，所述辅料为维生素c、山梨醇、甘露醇、木糖醇、果糖、氨基酸、葡甲胺、糊精、硬脂酸镁和蔗糖中任意一种或两种。

本发明药物制剂根据施用途径可以选择不同剂型，所述药物制剂为口服制剂或灌肠制剂。

作为优选方案，所述口服制剂为片剂、口服液或颗粒剂。

优选地，所述口服制剂由1重量份的补骨脂、3重量份的维生素c和1重量份蔗糖。

优选地，所述片剂由1重量份的补骨脂、1重量份的胡芦巴、3重量份的蔗糖和1重量份的糊精。

优选地，所述颗粒剂由1重量份的补骨脂、1重量份的胡芦巴、3重量份的蔗糖和1重量份的糊精。

本发明发现补骨脂具有如下药理作用：

1)补骨脂对儿童脂肪肝(尤其是儿童非酒精性脂肪性肝炎nash)具有预防和治疗作用

本发明通过建立幼龄小鼠nafld模型，检测血糖、血脂(tc、tg、ldl-c、hdl-c)、空腹胰岛素、肝功能(alt、ast)水平，计算胰岛素抵抗指数(homa-ir)，观察肝组织形态学改变，检测肝脏甘油三酯(tg)含量、cd44蛋白表达，同时检测肝组织核因子κb(nf-κb)p65磷酸化(p-p65)及非磷酸化蛋白(p65)表达及其下游细胞因子(tnf-α、il-8)水平，证明补骨脂具有抑制肝组织nf-κb活性的作用，从而对儿童脂肪肝(尤其是儿童非酒精性脂肪性肝炎nash)具有预防和治疗作用。

2)pc可改善幼龄小鼠脂肪肝，疗效呈剂量依赖性。

本发明采用高脂饮食喂养的方法，可成功建立幼龄小鼠脂肪肝模型。该模型小鼠在体成熟(10周龄)前进行了取材，成年前出现了胰岛素抵抗、肝功能受损(alt＞ast)、肝脏tg含量增高、肝脏组织学显示脂肪变性和炎细胞浸润等表现，具备nafld典型特征。给予补骨脂颗粒灌胃后，模型小鼠homa-ir降低、alt及ast水平降低、肝脏tg含量减少，高剂量组优于低剂量组。进一步对比肝脏病理学改变显示pc治疗后肝细胞脂肪变性减轻、炎细胞浸润减少，且高剂量组优于低剂量组。说明pc可改善幼龄小鼠脂肪肝，疗效呈剂量依赖性。

3)pc可改善幼龄脂肪肝小鼠早期肝纤维化，疗效呈剂量依赖性。

本发明通过检测了肝组织cd44蛋白表达。cd44是i型跨膜蛋白，是细胞表面受体，通常表达在肝脏kupffer细胞和浸润淋巴细胞表面。当肝脏出现纤维变性时，可与过表达的细胞外基质产物透明质酸特异性结合。因此，cd44可视为是评估早期肝纤维化的间接指标。模型小鼠肝脏he染色见汇管区纤维组织增生，且汇管区淋巴细胞cd44蛋白表达呈强阳性，均提示肝纤维化存在。经pc治疗后，观察肝脏he染色，低剂量组小鼠汇管区纤维增生减轻，高剂量组消失；肝组织cd44蛋白表达下降，高剂量组较低剂量组下降更明显。说明pc可改善幼龄脂肪肝小鼠早期肝纤维化，疗效亦呈剂量依赖性。

4)pc可抑制nf-κb炎症通路活化，疗效呈剂量依赖性。

nafld的发病涉及氧化应激、胰岛素抵抗和炎症等多个机制，且各机制之间互相影响互相促进。慢性炎症反应不仅在上述关联中扮演重要角色，还推进肝纤维化进程。nf-κb炎症信号通路激活在众多有关nafld的临床和实验室研究中被证实，本发明亦显示模型小鼠肝组织磷酸化与非磷酸化nf-κbp65蛋白表达比值明显升高，并伴随nf-κb下游炎症因子肝组织tnf-α、il-8表达增多。进一步检测pc治疗组，发现：模型小鼠经pc治疗后，肝组织磷酸化与非磷酸化nf-κbp65蛋白表达比值明显下降，且肝组织tnf-α、il-8水平也明显减少。说明pc改善脂肪肝的疗效可能是通过抑制nf-κb炎症通路活化来实现的。同时，高剂量组的下调强度较低剂量组明显。

附图说明

图1为各组小鼠肝脏组织病理学结果比较图(he染色，×400)；

图中，a：正常组；b：模型组；c：补骨脂(低剂量)组；

d：补骨脂(高剂量)组；e：维生素e组；

图2为各组小鼠肝脏组织cd44表达比较图(×200，箭头所示为汇管区淋巴细胞阳性表达cd44)；

图中，a：正常组；b：模型组；c：补骨脂(低剂量)组；d：补骨脂(高剂量)组；e：维生素e组；

图3为各组小鼠肝组织p-p65/p65比值比较图(n＝3)；

图中，n：正常组；m：模型组；pc(l)：补骨脂(低剂量)组；pc(h)：补骨脂(高剂量)组；vite：维生素e组(与正常组比较^▲▲p<0.01；与模型组比较^△△p<0.01；与补骨脂低剂量组比较*p<0.05)。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。

本发明使用的实验动物和材料如下：

1.实验动物

spf级雄性c57bl/6j小鼠(3周龄)40只，购自北京华阜康生物科技股份有限公司(实验动物质量合格证号：no.11401300041293)。

2.饲料

d12451高脂饲料购自北京华阜康生物科技股份有限公司，配方为：45％kcal脂肪，20％kcal蛋白质，35％kcal碳水化合物。普通饲料由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，配方为：35％面粉，20％大豆粉，20％玉米粉，15.5％麸子，0.5％豆油，5％鱼粉，2.5％骨头粉，1％酵母粉，0.5％盐。

3.药物及主要试剂

补骨脂配方颗粒由华润三九医药股份有限公司提供(产品批号：1601002s)。

维生素e软胶囊购自浙江医药股份有限公司新昌制药厂。

血糖(bg)试纸、cocktail蛋白酶抑制剂均购自瑞士roche公司。

葡萄糖测定试剂盒购自上海名典生物工程有限公司。

总胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)、低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)测试盒；谷丙转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast)试剂盒；小鼠白细胞介素-8(il-8)酶联免疫检测试剂盒均购自南京建成科技有限公司。

小鼠胰岛素(ins)酶联免疫吸附测定试剂盒、小鼠肿瘤坏死因子α(tnf-α)酶联免疫吸附测定试剂盒均购自武汉伊莱瑞特生物科技有限公司。

edta修复液、bca蛋白浓度测定试剂盒、ripa总蛋白裂解液、pmsf、磷酸化蛋白酶抑制剂均购自武汉aspen生物技术有限公司。dab显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

兔抗小鼠cd44单克隆抗体、gapdh多克隆抗体、磷酸化nf-κbp65(磷酸化位点s276)多克隆抗体均购自abcam公司。兔抗小鼠nf-κbp65单克隆抗体购自cst公司。山羊抗兔多克隆二抗购自kpl公司。

4.模型制备、分组及处理

小鼠适应性喂养3天。随机抽取8只小鼠编为正常组，继续正常饲料喂养。其余32只小鼠随机编为4组：模型组、补骨脂(低、高剂量)组、维生素e组，每组8只小鼠，换用d12451高脂饲料喂养。3天后，正常及模型组给予0.02ml/g生理盐水灌胃；补骨脂(低剂量)组给予1.125mg/g补骨脂配方颗粒溶液灌胃；补骨脂(高剂量)组给予2.25mg/g补骨脂配方颗粒溶液灌胃；维生素e组给予0.01mg/g维生素e软胶囊混悬液灌胃。各组灌胃给药至10周龄。处死前禁食12小时，摘除眼球法采集血液标本，采血量2-3ml，3000r/min条件下离心30min，分离血清，-80℃保存；取肝脏组织：肝左外叶、左中叶装入冻存管，-80℃保存，备用；肝右中叶、右上叶和右下叶予4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，用于苏木精-伊红(he)及免疫组化检测。

实施例1补骨脂对幼龄脂肪肝小鼠ogtt及homa-ir的影响

1.口服葡萄糖耐量试验(ogtt)的方法

首先对处死前3天的小鼠进行ogtt实验。小鼠禁食12小时，剪尾取血法采集血液标本，用罗氏血糖仪/卓越型检测空腹血糖(fbg)值，之后予50％葡萄糖2g/kg灌胃，然后再次剪尾取血，血糖仪分别测定灌胃后1h、2h血糖(pg-1h、pg-2h)值。

2.计算胰岛素抵抗指数(homa-ir)的方法

1)葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖(fbg)，elisa方法测定空腹胰岛素(fins)。根据公式：fbg(mmol/l)×fins(miu/l)/22.5计算homa-ir。

3.结果

如图表1所示：与正常组比较，模型小鼠血清fbg、pg-2h、homa-ir均有升高(p<0.01)；与模型组比较，补骨脂各剂量组、维生素e组血清pg-2h水平无统计学差异(p＞0.05)，但fbg、homa-ir有不同程度降低(p<0.01，p<0.05)，其中补骨脂高剂量组降幅最大(p<0.01)，homa-ir较低剂量组有统计学意义(p<0.01)。各组小鼠血清pg-1h水平未见明显差异(p＞0.05)。

由上可知：补骨脂可降低模型小鼠空腹血糖水平，改善模型小鼠胰岛素抵抗。

表1补骨脂对幼龄脂肪肝小鼠ogtt的影响(mean±sd)

与正常组比较^▲▲p<0.01；与模型组比较^△△p<0.01，^△p<0.05；与补骨脂低剂量组比较**p<0.01。

实施例2补骨脂对幼龄脂肪肝小鼠血脂的影响

1.方法

小鼠处死前禁食12小时，然后摘除眼球法采集血液标本，采血量2-3ml，3000r/min条件下离心30min，分离血清，酶法测定血tc值、tg值、hdl-c值。

如表2所示：与正常组比较，模型小鼠出现血脂代谢紊乱，血清tg值、tc值及ldl-c值均显著升高(p<0.01)，且血清hdl-c水平明显降低(p<0.01)；与模型组比较，补骨脂各剂量组、维生素e组各血脂单项水平均有不同程度改善(p<0.01，p<0.05)，其中补骨脂高剂量组改善幅度最明显(p<0.01)，差异较低剂量组有统计学意义(p<0.01，p<0.05)。

由上可知：补骨脂可降低模型小鼠血tg、tc、ldl-c水平，升高模型小鼠血hdl-c水平，调节模型小鼠血脂紊乱。

表2补骨脂对幼龄脂肪肝小鼠血脂的影响(mean±sd)

与正常组比较^▲▲p<0.01；与模型组比较^△△p<0.01，^△p<0.05；与补骨脂低剂量组比较**p<0.01，*p<0.05。

实施例3补骨脂对幼龄脂肪肝小鼠肝脏形态学的影响

1.方法

a.材料处理：

小鼠处死前禁食12小时，取肝脏组织，肝右中叶、右上叶和右下叶予4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，用于苏木精-伊红(he)检测备用；

b.苏木精-伊红(he)染色

取石蜡切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，去离子水冲洗，苏木精染色1-5min，去离子水冲洗2min，1％盐酸酒精分化15sec，去离子水冲洗1min，1％氨水泛蓝30sec，去离子水冲洗1min，伊红染色30sec，去离子水冲洗30sec，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，干燥后中性树胶封片，于光学显微镜观察。

2.结果

如图1(a-e)所示：图1正常组小鼠肝小叶结构可见，肝细胞索及肝血窦排列正常。与正常组比较，模型组肝细胞明显水肿、变性，肝细胞明显脂肪变性，汇管区纤维组织及小胆管增生，较多炎性细胞浸润。与模型组比较，各治疗组肝脏病理改变均有改善，补骨脂高剂量组病变最轻。镜下具体情况为：补骨脂低剂量组肝细胞水肿，其内见散在脂滴空泡，汇管区纤维组织轻度增生，炎性细胞浸润；补骨脂高剂量组部分肝细胞轻度脂肪变性，汇管区少许炎性细胞浸润；维生素e组汇管区炎性细胞浸润，肝细胞内见散在脂滴空泡。

由上可知：补骨脂可减轻模型小鼠肝细胞损伤、脂肪变性，改善汇管区纤维变性及炎症。

实施例4补骨脂对幼龄脂肪肝小鼠肝功能及肝脏tg含量的影响

1.方法

a.材料前期处理：

小鼠处死前禁食12小时，摘除眼球法采集血液标本，采血量2-3ml，3000r/min条件下离心30min，分离血清，-80℃保存；取肝脏组织：肝左外叶、左中叶装入冻存管，-80℃保存。

b.酶法测定血alt、ast及肝组织tg含量

2.结果

如表3所示：与正常组比较，模型小鼠血清alt、ast均有升高(p<0.01)，肝脏tg含量升高(p<0.01)；与模型组比较，补骨脂各剂量组、维生素e组血清alt、ast均降低(p<0.01)，肝脏tg含量降低(p<0.01)，其中补骨脂高剂量组较低剂量降幅明显(p<0.01，p<0.05)。见表3。

由上可知：补骨脂可减轻模型小鼠肝功能受损及减少肝脏tg含量。

表3补骨脂对幼龄脂肪肝小鼠肝功能及肝脏脂肪含量的影响(mean±sd)

与正常组比较^▲▲p<0.01；与模型组比较^△△p<0.01；与补骨脂低剂量组比较**p<0.01，*p<0.05

实施例5补骨脂对幼龄脂肪肝小鼠肝组织cd44蛋白表达的影响

1.方法

a.材料前期处理：

小鼠处死前禁食12小时，取肝脏组织：肝右中叶、右上叶和右下叶予4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，用于免疫组化检测备用；

2.免疫组化方法测定肝组织cd44蛋白表达

将石蜡切片置于65℃烘箱中烘片2h，脱蜡、水化。用pbs洗涤后，将切片置于edta缓冲液中微波修复，自然冷却后用pbs洗涤。再将切片置于3％过氧化氢溶液中，室温下避光孵育10min。pbs洗涤甩干后5％牛血清蛋白封闭20min。去除封闭液，每张切片加入约50μl稀释的(比例为1:150)兔抗小鼠cd44单克隆抗体覆盖组织，4℃过夜。用pbs洗涤后，37℃下每张切片孵育二抗50min。pbs洗涤后，每张切片加新鲜配制dab溶液显色。显色完全后，蒸馏水或自来水冲洗，苏木素复染，1％盐酸酒精分化，自来水冲洗，氨水返蓝，流水冲洗。切片经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。

如图2(a-e)所示：正常组小鼠肝组织汇管区淋巴细胞呈阴性表达cd44。与正常组比较，模型组小鼠汇管区淋巴细胞呈强阳性表达cd44。与模型组比较，各治疗组cd44表达均有减少：补骨脂低剂量小鼠汇管区部分淋巴细胞表达cd44；补骨脂高剂量组及维生素e组小鼠汇管区部分淋巴细胞弱表达cd44。

由上可知：补骨脂可下调模型小鼠肝脏cd44蛋白表达，改善幼龄脂肪肝小鼠早期肝纤维化。

实施例6补骨脂对幼龄脂肪肝小鼠肝组织炎症因子的影响

1.方法

a.材料前期处理：

小鼠处死前禁食12小时，取肝脏组织：肝左外叶、左中叶装入冻存管，-80℃保存；

b.elisa方法测定肝组织tnf-α、il-8水平。

2.结果

如表4所示：与正常组比较，模型小鼠肝组织tnf-α、il-8均有升高(p<0.01)；与模型组比较，补骨脂各剂量组、维生素e组肝组织tnf-α、il-8均降低(p<0.01)，其中补骨脂高剂量组较低剂量降幅明显(p<0.01)。

由上可知：补骨脂可减少肝脏炎症因子含量，改善肝脏炎症反应。

表4补骨脂对幼龄脂肪肝小鼠肝组织炎症因子的影响(mean±sd)

与正常组比较^▲▲p<0.01；与模型组比较^△△p<0.01；与补骨脂低剂量组比较**p<0.01

实施例7补骨脂对幼龄脂肪肝小鼠肝组织nf-κb的活性的影响

1.方法

a.材料前期处理：

小鼠处死前禁食12小时，取肝脏组织：肝左外叶、左中叶装入冻存管，-80℃保存；

b.westernblot方法测定肝组织nf-κbp65、磷酸化nf-κbp65蛋白表达

提取肝组织总蛋白，用bca法测定蛋白浓度，-80℃保存。取40ug蛋白，变性后用10％sds-page分离胶电泳，pvdf膜转膜，5％脱脂奶粉(非磷酸化蛋白)或0.5％牛血清蛋白(磷酸化蛋白)封闭，4℃孵育一抗(gapdh稀释比例为1:10000；nf-κbp65稀释比例为1:2000；磷酸化nf-κbp65稀释比例为1:1000)摇床过夜，tbst洗膜后，孵育二抗30min，tbst洗膜后，化学发光法检测pvdf膜，用alphaeasefc软件进行分析灰度值(p-p65/p65比值表示nf-κb的活性)。

2.结果

如图3所示：与正常组比较，模型小鼠肝组织p-p65/p65比值显著升高(p<0.01)；与模型组比较，补骨脂各剂量组、维生素e组肝组织p-p65/p65比值均明显降低(p<0.01)，其中补骨脂高剂量组较低剂量降幅明显(p<0.05)。

由上可知：补骨脂可下调肝组织磷酸化与非磷酸化nf-κbp65蛋白表达比值，抑制nf-kb激活。

实施例8口服制剂的制备

取补骨脂、维生素c和蔗糖按重量比1:3:1的比例，按常规方法制成口服制剂。

实施例9片剂的制备

取补骨脂、胡芦巴、蔗糖和糊精按重量比1:1:3:1的比例，按常规方法制成片剂。

实施例10颗粒剂的制备

取补骨脂、胡芦巴、蔗糖和糊精按重量比1:1:3:1的比例，按常规方法制成颗粒剂。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。