本发明涉及一种仿生关节滑液及其制备方法。采用该方法，可形成粘弹性与流动性指标达到正常关节滑液的仿生关节滑液，可在退行性或外伤性关节炎造成关节滑液缺失或粘弹性下降时，作为粘弹性补充剂使用，可有效减缓退行性或外伤性关节炎病变的进程，并缓解疼痛。
背景技术：
：关节滑液是由关节滑囊和腱鞘的滑液膜分泌的，含有类似粘蛋白物质的透明粘质润滑液，有润滑的作用，是人体器官组织的分泌物，起着润滑、滋润器官和排出毒素的作用。滑液的主要成分是水和大量营养物质，不仅能濡养关节、胃、脑、髓等组织器官，还能把人体的代谢产物通过汗、尿等方式不断地排出体外，使机体各器官组织的活动正常。若滑液减少，或滑液变得黏稠，就会使代谢产物潴留于体内，产生各种疾患。如关节滑液随年龄增大而减少，关节缺少润滑剂，关节就会因磨损而出现退行性关节炎、骨刺、骨质疏松等，节软骨长期缺乏关节滑液还会造成骨关节坏死。目前，退行性关节炎在发生的早期多采用注射粘弹性补充剂的方法治疗。常用的粘弹性补充剂包括透明质酸和羧甲基壳聚糖（又称羧甲基葡糖胺聚糖，几丁糖）。作为传统的粘弹性补充剂，透明质酸已经应用多年，效果良好，但作为新型粘弹性补充剂的羧甲基壳聚糖，作为粘弹性补充剂所产生的治疗效果要优于透明质酸。羧甲基壳聚糖是甲壳素经过脱乙酰化与羧甲基化处理后得到的产物。根据文献报道（白真龙等，外科研究与新技术，2015，4(3)，163-168），羧甲基壳聚糖具有高度黏弹性，与正常的关节液相似，注射入关节腔后可以模拟关节滑液的物理作用改善关节的润滑状况，缓解作用于关节软骨面的压力，且能覆盖在软骨表面或充填到退变的软骨裂隙中，防止关节炎（oa）滑液中有害炎性细胞因子与软骨基质及软骨细胞接触。在结构上与软骨细胞内的黏多糖相似，在体内可完全经由酶促自然降解。同时，羧甲基壳聚糖有助于防止金属蛋白酶表达，保护关节软骨，还可以调节白细胞中骨调素的表达，而后者可以诱导修复细胞的黏附和播散。此外，羧甲基壳聚糖还可以诱导二型胶原和蛋白聚糖基因的表达，有助软骨修复。其在理化性质上与关节内的氨基多糖相似，而氨基多糖是软骨和软骨基质构成代谢的基础，所以羧甲基壳聚糖具有良好的黏弹性和缓冲吸收性，可以黏附与骨软骨缺损处，甚至可以直接促进软骨增殖，然而关节腔内注射透明质酸并不能诱导受损软骨增值，而这正是骨关节炎患者能否获得长期良好疗效的关键。同时，羧甲基壳聚糖和透明质酸钠相比其生物屏障作用更长，羧甲基壳聚糖在体内能存留两周左右，而透明质酸钠仅留存一周，故羧甲基壳聚糖的效果可能优于透明质酸。然而，当前注射羧甲基壳聚糖治疗关节炎仍然需要多次注射才能保证治疗效果，这是由于羧甲基壳聚糖在体内的存留时间仍然不能满足单次注射的疗效，为保证羧甲基壳聚糖在发生关节炎的关节内长期起到治疗效果，就必须对羧甲基壳聚糖进行稳定化处理，延长羧甲基壳聚糖在体内的存留时间，同时还需要模仿正常关节滑液的粘弹性与流动性指标，制备得到仿生关节滑液。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种仿生关节滑液及其制备方法。采用该方法，可形成粘弹性与流动性指标达到正常关节滑液的仿生关节滑液，可在退行性或外伤性关节炎造成关节滑液缺失或粘弹性下降时，作为粘弹性补充剂使用，可有效减缓退行性或外伤性关节炎病变的进程，并缓解疼痛。本发明分别采用不同交联度的羧甲基壳聚糖与非交联的羧甲基壳聚糖通过技术混合后得到。仿生关节液可在关节腔内注射后迅速起效，并长期持续保持治疗效果，达到单次注射就能缓解关节炎病变的疗效。本发明提供的仿生关节滑液是以羧甲基壳聚糖作为主要原料，分别采用不同交联度的羧甲基壳聚糖与非交联的羧甲基壳聚糖通过物理方法混合制备得到，其中，羧甲基壳聚糖的分子量范围为20kda至2000kda，优选分子量范围为100kda至800kda；乙酰度范围为60%至99%，优选80%至95%；羧甲基的取代度范围为0.5至2.0。本发明提供的仿生关节滑液是由不同交联度的交联羧甲基壳聚糖与非交联的羧甲基壳聚糖混合组成,羧甲基壳聚糖的质量浓度（包括交联羧甲基壳聚糖与非交联羧甲基壳聚糖）范围为5~100mg/ml，优选20~50mg/ml。制备方法为：将交联羧甲基壳聚糖凝胶与非交联羧甲基壳聚糖溶液混合，采用分散机进行均质粉碎，115~121℃下加热15~45min，自然冷却，得到仿生关节液样品。本发明的仿生关节液的弹性模量范围为105~130pa，粘性模量范围为40~55pa。所述的交联羧甲基壳聚糖交联度范围为1~20%，其中交联度定义为质量交联度（下同），计算公式为：质量交联度=（加入交联剂的质量/羧甲基壳聚糖的质量）×100%。本发明所述的不同交联度的交联羧甲基壳聚糖选用3~6种不同交联度的交联羧甲基壳聚糖，其中非交联羧甲基壳聚糖为必备原料。非交联羧甲基壳聚糖占仿生关节液中总质量（交联羧甲基壳聚糖质量+非交联羧甲基壳聚糖质量）的10~70%。所述的不同交联度的交联羧甲基壳聚糖为三种交联度范围，其中交联度在1~7%范围内的为低交联度凝胶，占仿生关节液中羧甲基壳聚糖总质量的10~40%；交联度在8~14%范围内的为中交联度凝胶，占仿生关节液中羧甲基壳聚糖总质量的5~20%；交联度在15~20%范围内的为高交联度凝胶，占仿生关节液中羧甲基壳聚糖总质量的1~10%。本发明所述的交联羧甲基壳聚糖凝胶，凝胶中所选用的交联剂包括但不限于多元环氧类化合物，多元醛基类化合物，水溶性多卤代烃，以及同时含有上述两种或多种官能团的化合物（例如，环氧氯丙烷等）。在上述交联剂中，多元环氧化合物包括二元、三元以及四元环氧化合物，其中，二元环氧化合物包括但不限于1,4-丁二醇二缩水甘油醚（bdde），1,2,3,4-二环氧丁烷以及1,2,7,8-二环氧辛烷（deo）等化合物；三元环氧化合物包括但不限于三甲基丙烷三缩水甘油醚等化合物；四元环氧类化合物包括但不限于季戊四醇四缩水甘油醚等化合物。多元醛基类化合物包括但不限于戊二醛、京尼平等。多元水溶性卤代烃包括但不限于1,4-二氯-2,3-丁二醇等。本发明优选的交联剂为：1,4-丁二醇二缩水甘油醚（bdde），环氧氯丙烷以及1,2,7,8-二环氧辛烷（deo）；三甲基丙烷三缩水甘油醚；季戊四醇四缩水甘油醚；戊二醛、京尼平；1,4-二氯-2,3-丁二醇；更优选的交联剂为：1,4-丁二醇二缩水甘油醚（bdde），戊二醛，环氧氯丙烷。本发明提供的一种仿生关节滑液的制备方法包括以下步骤：1）预先制备3~6种不同交联度的交联羧甲基壳聚糖凝胶，凝胶中羧甲基壳聚糖的质量浓度范围为5~100mg/ml，优选20~50mg/ml，凝胶ph值范围为7.0~7.5。将交联羧甲基壳聚糖凝胶与非交联羧甲基壳聚糖溶液混合。2）采用分散机对上述混合材料进行均质粉碎，所选用的分散机型号包括但不限于ika公司t系列分散机，如t65basicultra-turrax®，t65digitalultra-turrax®package或t50digitalultra-turrax®等型号的分散机，所选用的转速范围为100~2000r/min，粉碎时间范围为10~60min，粉碎次数范围为2~10次。粉碎后，凝胶颗粒的粒径范围为100~2000μm，分布系数范围1.0~3.0；3）取出上述粉碎后的羧甲基壳聚糖凝胶，置于115~121℃的条件下持续15~45min进行高温高压灭菌操作，冷却至20~25℃后得到仿生关节液样品。本发明中所使用的交联羧甲基壳聚糖凝胶均采用已知的方法制备得到，交联羧甲基壳聚糖的制备工艺并不在本发明的保护范围之内。本发明中将不会对交联羧甲基壳聚糖的制备过程做特别说明。本发明提供的仿生关节滑液由于是一种可形成粘弹性与流动性指标达到正常关节滑液的仿生关节滑液，可在退行性或外伤性关节炎造成关节滑液缺失或粘弹性下降时，作为粘弹性补充剂使用，可有效减缓退行性或外伤性关节炎病变的进程，并缓解疼痛。本发明仿生关节液在理化性能上与正常关节滑液的更接近，具有更好的相容性，仅需单次注射就能缓解关节炎病变的疗效。具体实施方式以下通过实施例对本发明作进一步的详细说明，这并不限制本发明的保护范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可由商业途径获得。为确定正常关节滑液的粘弹性与流动性指标，本发明参考文献（jeffreyradeckiandetc.,int.j.clin.rheumatol.(2009)4(6),631–639）中报道的关节滑液指标（具体数据见表一），本发明中所制备的仿生关节滑液各项性能指标均依照参考文献中的数据制定。实施例中所使用的交联羧甲基壳聚糖凝胶均采用已知的方法（中国专利cn201610492982.x，cn201510401940.6，cn201410589982.2等以及本申请人同日申请的另一个发明专利：壳聚糖或其衍生物多重交联凝胶和制备方法）制备得到，交联羧甲基壳聚糖的制备工艺并不在本发明的保护范围之内。本发明中将不会对交联羧甲基壳聚糖的制备过程做特别说明。实施例1选用bdde为交联剂，交联度分别为2%、5%、10%、20%等四种交联羧甲基壳聚糖凝胶（分子量500kda，脱乙酰度85%，取代度1.2），交联凝胶中羧甲基壳聚糖的质量浓度为30mg/ml，ph值为7.2。配置非交联羧甲基壳聚糖溶液，质量浓度为20mg/ml，ph值为7.2。其中，非交联羧甲基壳聚糖、2%交联羧甲基壳聚糖、5%交联羧甲基壳聚糖、10%交联羧甲基壳聚糖、20%交联羧甲基壳聚糖的比例分别为：40%、20%、20%、15%、5%。将交联羧甲基壳聚糖凝胶与非交联羧甲基壳聚糖溶液混合后，采用ika公司t65digitalultra-turrax®package型分散机在500r/min的条件下分散30min，重复分散5次。粉碎完成后，取出凝胶，置于121℃条件下保持15min进行高温高压灭菌操作，冷却至25℃后得到仿生关节液样品1。经检测，样品1粒径为300μm，粒径分布为1.6。实施例2选用戊二醛为交联剂，交联度分别为2%、8%、15%等三种交联羧甲基壳聚糖凝胶（分子量200kda，脱乙酰度90%，取代度0.9），交联凝胶中羧甲基壳聚糖的质量浓度为35mg/ml，ph值为7.2。配置非交联羧甲基壳聚糖溶液，质量浓度为25mg/ml，ph值为7.2。其中，非交联羧甲基壳聚糖、2%交联羧甲基壳聚糖、8%交联羧甲基壳聚糖、15%交联羧甲基壳聚糖的比例分别为：50%、30%、18%、2%。将交联羧甲基壳聚糖凝胶与非交联羧甲基壳聚糖溶液混合后，采用ika公司t65digitalultra-turrax®package型分散机在800r/min的条件下分散35min，重复分散8次。粉碎完成后，取出凝胶，置于115℃条件下保持30min进行高温高压灭菌操作，冷却至25℃后得到仿生关节液样品2。经检测，样品2粒径为500μm，粒径分布为2.1。实施例3选用环氧氯丙烷为交联剂，交联度分别为2%、5%、8%、12%、15%等五种交联羧甲基壳聚糖凝胶（分子量200kda，脱乙酰度90%，取代度1.2），交联凝胶中羧甲基壳聚糖的质量浓度为30mg/ml，ph值为7.2。配置非交联羧甲基壳聚糖溶液，质量浓度为20mg/ml，ph值为7.2。其中，非交联羧甲基壳聚糖、2%交联羧甲基壳聚糖、5%交联羧甲基壳聚糖、8%交联羧甲基壳聚糖、12%交联羧甲基壳聚糖、15%交联羧甲基壳聚糖的比例分别为：40%、20%、15%、10%、10%、5%。将交联羧甲基壳聚糖凝胶与非交联羧甲基壳聚糖溶液混合后，采用ika公司t65digitalultra-turrax®package型分散机在1200r/min的条件下分散40min，重复分散10次。粉碎完成后，取出凝胶，置于120℃条件下保持15min进行高温高压灭菌操作，冷却至25℃后得到仿生关节液样品3。经检测，样品3粒径为400μm，粒径分布为2.4。实施例4：仿生关节液样品流变学性能检测。分别取样品1、样品2与样品3各1ml，采用锥板式旋转流变仪（沃特斯中国有限公司dhr-1）进行流变学性能检测，以确定各三种凝胶的流变学数据，检测时，固定应力应变值为10%，频率值固定为2.5hz，检测结果见表一。从表一中可以看出，各样品弹性模量与粘性模量指标均与正常滑液的指标相近。表一、正常关节滑液与仿生关节液的粘弹性模量数据弹性模量粘性模量正常滑液117pa45pa样品1119pa49pa样品2129pa50pa样品3126pa53pa注：正常滑液数据参考文献：jeffreyradeckiandetc.,int.j.clin.rheumatol.(2009)4(6),631–639。当前第1页12