技术领域：
：本发明涉及中药提取
技术领域：
，具体涉及一种具有雌激素样作用的覆盆子黄酮类成分提取方法。
背景技术：
：：覆盆子，又称树莓，蔷薇科悬钩子属浆果植物。覆盆子属于药食两用果实，富含氨基酸、矿质元素、有机酸和维生素e等人体必需的营养物质，还含有黄酮、多糖、粗三萜等功能性物质，因此，覆盆子具有抗衰老、调节生殖系统、促进细胞免疫功能以及减肥之功效，并具有优异的抑菌和提高免疫力作用。黄酮类化合物是覆盆子代谢过程中产生的重要天然有机化合物，是覆盆子中主要活性成分之一，具有抗氧化、抑菌消炎、消除自由基、抗过敏、抗感染、抗突变、抗肿瘤等生理活性，且毒性极低，因此可用作食品、化妆品的天然添加剂或作为药物药效成分。要想从覆盆子中高效提取出高含量的黄酮类化合物需要借助适宜的提取方法，同时还需依靠合适的分离纯化方法才能获得高提取得率和高纯度的覆盆子黄酮类成分。技术实现要素：：本发明所要解决的技术问题在于提供一种提取得率和纯度高、分离纯化操作简便易行的具有雌激素样作用的覆盆子黄酮类成分提取方法。本发明所要解决的技术问题采用以下的技术方案来实现：一种具有雌激素样作用的覆盆子黄酮类成分提取方法，包括如下步骤：(1)清洗：将覆盆子放入清水中浸泡5-10min，并用3-5倍覆盆子干重的清水清洗两次，每次搅拌5-10min；(2)干燥粉碎：将经清洗后的覆盆子用45-50℃热风风干，再利用粉碎机粉碎成粉末，过100目筛，即得覆盆子粉末；(3)醇提水沉：利用无水乙醇对上述所制覆盆子粉末回流提取三次，每次使用重量为覆盆子干重5-8倍的无水乙醇提取1-3h，并加入覆盆子干重0.5-1％的促提剂，合并滤液，将所得提取液减压浓缩至比重达到1.15-1.18，再在搅拌下加入蒸馏水，直至沉淀不再增加，然后于0-5℃环境中密封静置12h，过滤，即得水沉液；(4)一次纯化：将所得水沉液上聚酰胺柱，控制出液速度在0.5ml/min；再用蒸馏水冲洗至无色，控制出液速度在2ml/min；然后用70％乙醇洗脱，控制出液速度在2ml/min，收集洗脱液，即得一次纯化液；(5)二次纯化：将所得一次纯化液经浓缩后上葡聚糖凝胶柱，控制出液速度在0.5ml/min；再用10％乙醇冲洗杂质，控制出液速度在2ml/min；然后用85％乙醇洗脱，控制出液速度在2ml/min，收集洗脱液，即得二次纯化液；(6)浓缩干燥：将上述所得二次纯化液减压浓缩，并经真空干燥后粉碎成粉末。所述促提剂由如下重量份数的原料制成：田菁胶/多聚谷氨酸3-5份、糯米粉2-3份、泊洛沙姆0.5-1份、羟乙基纤维素0.5-1份、聚乙二醇40000.1-0.3份、甘草酸二钾0.05-0.1份、小苏打粉0.05-0.1份，其制备方法为：向糯米粉中加入泊洛沙姆和甘草酸二钾，升温至75-80℃保温研磨10min，然后加入聚乙二醇4000和小苏打粉，继续升温至105-110℃保温研磨15min，即得改性糯米粉，待自然冷却至室温后再加入田菁胶/多聚谷氨酸和羟乙基纤维素，充分混合后经真空压缩成块，并于0-5℃环境中密封静置1h，最后经粉碎机制成粉末，过300目筛，即得促提剂。所述田菁胶/多聚谷氨酸由田菁胶和多聚谷氨酸复合而成，其制备方法为：将田菁胶和藻酸丙二醇酯升温至80-85℃保温研磨5min，再加入多聚谷氨酸和橄榄油，继续在80-85℃保温研磨15min，向所得混合物中加入15-20℃水，充分搅拌后于15-20℃下保温静置30min，然后将所得混合液送入喷雾干燥机中，干燥所得颗粒经粉碎机制成粉末，过200目筛，即得田菁胶/多聚谷氨酸。所述田菁胶、藻酸丙二醇酯、多聚谷氨酸、橄榄油和水的重量比为3-5:0.5-1:2-3:0.1-0.3:25-30。所述聚酰胺柱由聚酰胺填充而成，所用聚酰胺是由己二酸和己二胺经聚合反应后再经改性处理而制得，其具体制备方法为：将己二酸溶解于乙醇中，升温至65℃后滴加己二胺的乙醇溶液，继续升温至回流状态保温反应，反应结束后自然冷却，过滤，所得滤渣用乙醇洗涤，然后加入n-羟甲基丙烯酰胺、双季戊四醇和六羟甲基三聚氰胺六甲醚，升温至125-130℃保温研磨30min，所得混合物经真空压缩成块，并于10-15℃环境中密封静置1h，最后经粉碎机制成颗粒状。所述己二酸、己二胺、n-羟甲基丙烯酰胺、双季戊四醇和六羟甲基三聚氰胺六甲醚的140-150:125-130:15-20:5-10:5-10。本发明的有益效果是：(1)利用醇提水沉法提高黄酮类成分的提取得率以及对杂质起到粗分离的目的，同时促提剂的添加显著提高黄酮类成分的提取得率，使提取得率达到25mg/g；(2)利用聚酰胺柱和葡聚糖凝胶柱进行两次纯化，有效提高黄酮类成分的纯度，使纯度达到80％以上；(3)聚酰胺柱填充用聚酰胺经上述改性处理后，在保留其对黄酮类化合物优异吸附作用的同时改善其解吸能力，避免使用常规聚酰胺存在的解吸难致使黄酮类成分损失率高的问题；(4)通过上述提取方法提取所得覆盆子黄酮类成分具有植物雌激素的选择性雌激素受体调节剂作用，对雌激素具有双向调节作用，不同于化学合成的雌激素药物，不会增加乳腺癌、子宫癌的副作用。具体实施方式：为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。实施例1(1)清洗：将覆盆子放入清水中浸泡10min，并用5倍覆盆子干重的清水清洗两次，每次搅拌5min；(2)干燥粉碎：将经清洗后的覆盆子用45-50℃热风风干，再利用粉碎机粉碎成粉末，过100目筛，即得覆盆子粉末；(3)醇提水沉：利用无水乙醇对上述所制覆盆子粉末回流提取三次，每次使用重量为覆盆子干重5倍的无水乙醇提取1.5h，并加入覆盆子干重0.5％的促提剂，合并滤液，将所得提取液减压浓缩至比重达到1.15-1.18，再在搅拌下加入蒸馏水，直至沉淀不再增加，然后于0-5℃环境中密封静置12h，过滤，即得水沉液；(4)一次纯化：将所得水沉液上聚酰胺柱，控制出液速度在0.5ml/min；再用蒸馏水冲洗至无色，控制出液速度在2ml/min；然后用70％乙醇洗脱，控制出液速度在2ml/min，收集洗脱液，即得一次纯化液；(5)二次纯化：将所得一次纯化液经浓缩后上葡聚糖凝胶柱，控制出液速度在0.5ml/min；再用10％乙醇冲洗杂质，控制出液速度在2ml/min；然后用85％乙醇洗脱，控制出液速度在2ml/min，收集洗脱液，即得二次纯化液；(6)浓缩干燥：将上述所得二次纯化液减压浓缩，并经真空干燥后粉碎成粉末。促提剂的制备：向20g糯米粉中加入5g泊洛沙姆和0.5g甘草酸二钾，升温至75-80℃保温研磨10min，然后加入1g聚乙二醇4000和0.5g小苏打粉，继续升温至105-110℃保温研磨15min，即得改性糯米粉，待自然冷却至室温后再加入30g田菁胶/多聚谷氨酸和5g羟乙基纤维素，充分混合后经真空压缩成块，并于0-5℃环境中密封静置1h，最后经粉碎机制成粉末，过300目筛，即得促提剂。田菁胶/多聚谷氨酸的制备：将50g田菁胶和5g藻酸丙二醇酯升温至80-85℃保温研磨5min，再加入30g多聚谷氨酸和2g橄榄油，继续在80-85℃保温研磨15min，向所得混合物中加入300g15-20℃水，充分搅拌后于15-20℃下保温静置30min，然后将所得混合液送入喷雾干燥机中，干燥所得颗粒经粉碎机制成粉末，过200目筛，即得田菁胶/多聚谷氨酸。聚酰胺的制备：将150g己二酸溶解于乙醇中，升温至65℃后滴加130g己二胺的乙醇溶液，继续升温至回流状态保温反应，反应结束后自然冷却，过滤，所得滤渣用乙醇洗涤，然后加入20gn-羟甲基丙烯酰胺、5g双季戊四醇和5g六羟甲基三聚氰胺六甲醚，升温至125-130℃保温研磨30min，所得混合物经真空压缩成块，并于10-15℃环境中密封静置1h，最后经粉碎机制成颗粒状。实施例2(1)清洗：将覆盆子放入清水中浸泡10min，并用5倍覆盆子干重的清水清洗两次，每次搅拌5min；(2)干燥粉碎：将经清洗后的覆盆子用45-50℃热风风干，再利用粉碎机粉碎成粉末，过100目筛，即得覆盆子粉末；(3)醇提水沉：利用无水乙醇对上述所制覆盆子粉末回流提取三次，每次使用重量为覆盆子干重5倍的无水乙醇提取1.5h，并加入覆盆子干重0.5％的促提剂，合并滤液，将所得提取液减压浓缩至比重达到1.15-1.18，再在搅拌下加入蒸馏水，直至沉淀不再增加，然后于0-5℃环境中密封静置12h，过滤，即得水沉液；(4)一次纯化：将所得水沉液上聚酰胺柱，控制出液速度在0.5ml/min；再用蒸馏水冲洗至无色，控制出液速度在2ml/min；然后用70％乙醇洗脱，控制出液速度在2ml/min，收集洗脱液，即得一次纯化液；(5)二次纯化：将所得一次纯化液经浓缩后上葡聚糖凝胶柱，控制出液速度在0.5ml/min；再用10％乙醇冲洗杂质，控制出液速度在2ml/min；然后用85％乙醇洗脱，控制出液速度在2ml/min，收集洗脱液，即得二次纯化液；(6)浓缩干燥：将上述所得二次纯化液减压浓缩，并经真空干燥后粉碎成粉末。促提剂的制备：向30g糯米粉中加入10g泊洛沙姆和0.5g甘草酸二钾，升温至75-80℃保温研磨10min，然后加入3g聚乙二醇4000和0.5g小苏打粉，继续升温至105-110℃保温研磨15min，即得改性糯米粉，待自然冷却至室温后再加入50g田菁胶/多聚谷氨酸和10g羟乙基纤维素，充分混合后经真空压缩成块，并于0-5℃环境中密封静置1h，最后经粉碎机制成粉末，过300目筛，即得促提剂。田菁胶/多聚谷氨酸的制备：将30g田菁胶和5g藻酸丙二醇酯升温至80-85℃保温研磨5min，再加入20g多聚谷氨酸和2g橄榄油，继续在80-85℃保温研磨15min，向所得混合物中加入300g15-20℃水，充分搅拌后于15-20℃下保温静置30min，然后将所得混合液送入喷雾干燥机中，干燥所得颗粒经粉碎机制成粉末，过200目筛，即得田菁胶/多聚谷氨酸。聚酰胺的制备：将140g己二酸溶解于乙醇中，升温至65℃后滴加125g己二胺的乙醇溶液，继续升温至回流状态保温反应，反应结束后自然冷却，过滤，所得滤渣用乙醇洗涤，然后加入15gn-羟甲基丙烯酰胺、5g双季戊四醇和5g六羟甲基三聚氰胺六甲醚，升温至125-130℃保温研磨30min，所得混合物经真空压缩成块，并于10-15℃环境中密封静置1h，最后经粉碎机制成颗粒状。对照例1(1)清洗：将覆盆子放入清水中浸泡10min，并用5倍覆盆子干重的清水清洗两次，每次搅拌5min；(2)干燥粉碎：将经清洗后的覆盆子用45-50℃热风风干，再利用粉碎机粉碎成粉末，过100目筛，即得覆盆子粉末；(3)醇提水沉：利用无水乙醇对上述所制覆盆子粉末回流提取三次，每次使用重量为覆盆子干重5倍的无水乙醇提取1.5h，并加入覆盆子干重0.5％的促提剂，合并滤液，将所得提取液减压浓缩至比重达到1.15-1.18，再在搅拌下加入蒸馏水，直至沉淀不再增加，然后于0-5℃环境中密封静置12h，过滤，即得水沉液；(4)一次纯化：将所得水沉液上聚酰胺柱，控制出液速度在0.5ml/min；再用蒸馏水冲洗至无色，控制出液速度在2ml/min；然后用70％乙醇洗脱，控制出液速度在2ml/min，收集洗脱液，即得一次纯化液；(5)二次纯化：将所得一次纯化液经浓缩后上葡聚糖凝胶柱，控制出液速度在0.5ml/min；再用10％乙醇冲洗杂质，控制出液速度在2ml/min；然后用85％乙醇洗脱，控制出液速度在2ml/min，收集洗脱液，即得二次纯化液；(6)浓缩干燥：将上述所得二次纯化液减压浓缩，并经真空干燥后粉碎成粉末。促提剂的制备：向30g糯米粉中加入50g田菁胶/多聚谷氨酸和10g羟乙基纤维素，充分混合后经真空压缩成块，并于0-5℃环境中密封静置1h，最后经粉碎机制成粉末，过300目筛，即得促提剂。田菁胶/多聚谷氨酸的制备：将30g田菁胶和5g藻酸丙二醇酯升温至80-85℃保温研磨5min，再加入20g多聚谷氨酸和2g橄榄油，继续在80-85℃保温研磨15min，向所得混合物中加入300g15-20℃水，充分搅拌后于15-20℃下保温静置30min，然后将所得混合液送入喷雾干燥机中，干燥所得颗粒经粉碎机制成粉末，过200目筛，即得田菁胶/多聚谷氨酸。聚酰胺的制备：将140g己二酸溶解于乙醇中，升温至65℃后滴加125g己二胺的乙醇溶液，继续升温至回流状态保温反应，反应结束后自然冷却，过滤，所得滤渣用乙醇洗涤，然后加入15gn-羟甲基丙烯酰胺、5g双季戊四醇和5g六羟甲基三聚氰胺六甲醚，升温至125-130℃保温研磨30min，所得混合物经真空压缩成块，并于10-15℃环境中密封静置1h，最后经粉碎机制成颗粒状。对照例2(1)清洗：将覆盆子放入清水中浸泡10min，并用5倍覆盆子干重的清水清洗两次，每次搅拌5min；(2)干燥粉碎：将经清洗后的覆盆子用45-50℃热风风干，再利用粉碎机粉碎成粉末，过100目筛，即得覆盆子粉末；(3)醇提水沉：利用无水乙醇对上述所制覆盆子粉末回流提取三次，每次使用重量为覆盆子干重5倍的无水乙醇提取1.5h，并加入覆盆子干重0.5％的促提剂，合并滤液，将所得提取液减压浓缩至比重达到1.15-1.18，再在搅拌下加入蒸馏水，直至沉淀不再增加，然后于0-5℃环境中密封静置12h，过滤，即得水沉液；(4)一次纯化：将所得水沉液上聚酰胺柱，控制出液速度在0.5ml/min；再用蒸馏水冲洗至无色，控制出液速度在2ml/min；然后用70％乙醇洗脱，控制出液速度在2ml/min，收集洗脱液，即得一次纯化液；(5)二次纯化：将所得一次纯化液经浓缩后上葡聚糖凝胶柱，控制出液速度在0.5ml/min；再用10％乙醇冲洗杂质，控制出液速度在2ml/min；然后用85％乙醇洗脱，控制出液速度在2ml/min，收集洗脱液，即得二次纯化液；(6)浓缩干燥：将上述所得二次纯化液减压浓缩，并经真空干燥后粉碎成粉末。促提剂的制备：向30g糯米粉中加入10g泊洛沙姆和0.5g甘草酸二钾，升温至75-80℃保温研磨10min，然后加入3g聚乙二醇4000和0.5g小苏打粉，继续升温至105-110℃保温研磨15min，即得改性糯米粉，待自然冷却至室温后再加入50g田菁胶/多聚谷氨酸和10g羟乙基纤维素，充分混合后经真空压缩成块，并于0-5℃环境中密封静置1h，最后经粉碎机制成粉末，过300目筛，即得促提剂。田菁胶/多聚谷氨酸的制备：将30g田菁胶升温至80-85℃保温研磨5min，再加入20g多聚谷氨酸，继续在80-85℃保温研磨15min，向所得混合物中加入300g15-20℃水，充分搅拌后于15-20℃下保温静置30min，然后将所得混合液送入喷雾干燥机中，干燥所得颗粒经粉碎机制成粉末，过200目筛，即得田菁胶/多聚谷氨酸。聚酰胺的制备：将140g己二酸溶解于乙醇中，升温至65℃后滴加125g己二胺的乙醇溶液，继续升温至回流状态保温反应，反应结束后自然冷却，过滤，所得滤渣用乙醇洗涤，然后加入15gn-羟甲基丙烯酰胺、5g双季戊四醇和5g六羟甲基三聚氰胺六甲醚，升温至125-130℃保温研磨30min，所得混合物经真空压缩成块，并于10-15℃环境中密封静置1h，最后经粉碎机制成颗粒状。对照例3(1)清洗：将覆盆子放入清水中浸泡10min，并用5倍覆盆子干重的清水清洗两次，每次搅拌5min；(2)干燥粉碎：将经清洗后的覆盆子用45-50℃热风风干，再利用粉碎机粉碎成粉末，过100目筛，即得覆盆子粉末；(3)醇提水沉：利用无水乙醇对上述所制覆盆子粉末回流提取三次，每次使用重量为覆盆子干重5倍的无水乙醇提取1.5h，合并滤液，将所得提取液减压浓缩至比重达到1.15-1.18，再在搅拌下加入蒸馏水，直至沉淀不再增加，然后于0-5℃环境中密封静置12h，过滤，即得水沉液；(4)一次纯化：将所得水沉液上聚酰胺柱，控制出液速度在0.5ml/min；再用蒸馏水冲洗至无色，控制出液速度在2ml/min；然后用70％乙醇洗脱，控制出液速度在2ml/min，收集洗脱液，即得一次纯化液；(5)二次纯化：将所得一次纯化液经浓缩后上葡聚糖凝胶柱，控制出液速度在0.5ml/min；再用10％乙醇冲洗杂质，控制出液速度在2ml/min；然后用85％乙醇洗脱，控制出液速度在2ml/min，收集洗脱液，即得二次纯化液；(6)浓缩干燥：将上述所得二次纯化液减压浓缩，并经真空干燥后粉碎成粉末。聚酰胺的制备：将140g己二酸溶解于乙醇中，升温至65℃后滴加125g己二胺的乙醇溶液，继续升温至回流状态保温反应，反应结束后自然冷却，过滤，所得滤渣用乙醇洗涤，然后加入15gn-羟甲基丙烯酰胺、5g双季戊四醇和5g六羟甲基三聚氰胺六甲醚，升温至125-130℃保温研磨30min，所得混合物经真空压缩成块，并于10-15℃环境中密封静置1h，最后经粉碎机制成颗粒状。对照例4(1)清洗：将覆盆子放入清水中浸泡10min，并用5倍覆盆子干重的清水清洗两次，每次搅拌5min；(2)干燥粉碎：将经清洗后的覆盆子用45-50℃热风风干，再利用粉碎机粉碎成粉末，过100目筛，即得覆盆子粉末；(3)醇提水沉：利用无水乙醇对上述所制覆盆子粉末回流提取三次，每次使用重量为覆盆子干重5倍的无水乙醇提取1.5h，并加入覆盆子干重0.5％的促提剂，合并滤液，将所得提取液减压浓缩至比重达到1.15-1.18，再在搅拌下加入蒸馏水，直至沉淀不再增加，然后于0-5℃环境中密封静置12h，过滤，即得水沉液；(4)一次纯化：将所得水沉液上聚酰胺柱，控制出液速度在0.5ml/min；再用蒸馏水冲洗至无色，控制出液速度在2ml/min；然后用70％乙醇洗脱，控制出液速度在2ml/min，收集洗脱液，即得一次纯化液；(5)二次纯化：将所得一次纯化液经浓缩后上葡聚糖凝胶柱，控制出液速度在0.5ml/min；再用10％乙醇冲洗杂质，控制出液速度在2ml/min；然后用85％乙醇洗脱，控制出液速度在2ml/min，收集洗脱液，即得二次纯化液；(6)浓缩干燥：将上述所得二次纯化液减压浓缩，并经真空干燥后粉碎成粉末。促提剂的制备：向30g糯米粉中加入10g泊洛沙姆和0.5g甘草酸二钾，升温至75-80℃保温研磨10min，然后加入3g聚乙二醇4000和0.5g小苏打粉，继续升温至105-110℃保温研磨15min，即得改性糯米粉，待自然冷却至室温后再加入50g田菁胶/多聚谷氨酸和10g羟乙基纤维素，充分混合后经真空压缩成块，并于0-5℃环境中密封静置1h，最后经粉碎机制成粉末，过300目筛，即得促提剂。田菁胶/多聚谷氨酸的制备：将30g田菁胶和5g藻酸丙二醇酯升温至80-85℃保温研磨5min，再加入20g多聚谷氨酸和2g橄榄油，继续在80-85℃保温研磨15min，向所得混合物中加入300g15-20℃水，充分搅拌后于15-20℃下保温静置30min，然后将所得混合液送入喷雾干燥机中，干燥所得颗粒经粉碎机制成粉末，过200目筛，即得田菁胶/多聚谷氨酸。聚酰胺的制备：将140g己二酸溶解于乙醇中，升温至65℃后滴加125g己二胺的乙醇溶液，继续升温至回流状态保温反应，反应结束后自然冷却，过滤，所得滤渣用乙醇洗涤，烘干最后经粉碎机制成颗粒状。实施例3分别利用实施例1、实施例2、对照例1、对照例2、对照例3和对照例4所述方法对同批等量覆盆子进行黄酮类成分进行提取，测定其黄酮类成分的提取得率和纯度，结果如表1所示。表1本发明黄酮类成分提取得率和纯度项目实施例1实施例2对照例1对照例2对照例3对照例4提取得率25.8mg/g26.1mg/g24.2mg/g21.4mg/g17.8mg/g14.3mg/g纯度83.5％82.4％80.3％76.5％73.1％71.6％实施例4测定实施例1、实施例2提取所得覆盆子黄酮类成分的雌激素样作用。采用动物模型：未成熟小鼠、去卵巢小鼠、衰老大鼠模型分别模拟女性一生雌激素低下的三个生理阶段。空白对照组(灌喂蒸馏水)、实施例1试验组(灌喂实施例1所制黄酮类成分)、实施例2试验组(灌喂实施例2所制黄酮类成分)、阳性对照组(灌喂尼尔雌醇)，结果如表2、3、4所示。表2对未成熟小鼠靶器官的雌激素样作用项目空白对照组实施例1实施例2阳性对照组剂量-5mg/kg5mg/kg0.5mg/kgn10101010动情期1101010动情期百分比10％100％100％100％子宫重量百分率0.936.086.135.25水摄取增加百分率2.615.875.985.76表3对成熟去卵巢小鼠靶器官的雌激素样作用表4对衰老大鼠靶器官的雌激素样作用项目空白对照组实施例1实施例2雌二醇剂量-5mg/kg5mg/kg0.5mg/kgn10101010子宫重量百分率0.490.530.510.61e2(pmol/l)21.6421.8322.0823.15以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。当前第1页12