本发明涉及抗氧化技术领域，具体而言，涉及麦角甾醇在抗氧化应激中的应用。
背景技术：
麦角甾醇最早是tanret于1889年从燕麦麦角菌中分离得到，后来人们在多种食用和药物真菌中均发现了含有麦角甾醇，其常见膳食来源包括蘑菇、羊肚菌和松露以及用酵母而得来的酱油、面包和啤酒等产品。它是微生物细胞膜的重要组成部份，对确保细胞活力、膜的流动性、膜结合酶的活性、膜的完整性以及细胞物质运输等起着重要作用。与高等动物膜中的胆固醇类似，麦角甾醇是真菌、某些原生动物和昆虫如果蝇中的主要固醇，通常大约占真菌中甾醇中的70％，并且主要存在于绝大多数的真菌细胞膜中。麦角甾醇是真菌类的特征甾醇，其含量与真菌的生物量存在着相关关系，是真菌生物量的重要标志物之一。因此麦角甾醇已经广泛用作真菌生物量的指示剂，用于确定真菌生长的程度、土壤真菌生物量、农业质量、土壤性质、食物恶化和空气中的颗粒物。
同时研究发现麦角甾醇及其衍生物具有多种生物活性。麦角甾醇是一种重要的药物中间体，为脂溶性维生素d2的前体。除此之外，还具有抗癌、抗肿瘤、抗炎剂多种药理活性。早在1994年，yasukawa等从真姬燕子实体中分离出了麦角甾醇，并且发现麦角甾醇对小鼠皮肤癌有显著的抑制作用。张娴等初步研究麦角甾醇对肝癌细胞hepg2增殖的影响及可能机制，结果表明麦角甾醇在浓度50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml均对hepg2有明显的抑制增殖作用。subbiah等人的研究证明了，酵母中提取分离出来的麦角甾醇在体外对乳腺癌细胞有较强的抑制作用。高虹等人采用小鼠移植瘤实验研究了巴西菇子实体中麦角甾醇的体内抗肿瘤活性，说明麦角甾醇有较强的抑瘤活性。kuo等人通过蛋白质组学方法使用凝胶电泳对麦角甾醇的免疫调节作用进行了测定。蛋白质印迹分析表明麦角甾醇通过抑制nf-jb信号通路抑制raw264.7巨噬细胞中lps诱导的炎症。
但是，目前，对于麦角甾醇在抗氧化应激方面的研究没有报道，为进一步开发麦角甾醇的新用途和提高麦角甾醇的利用率，需要对麦角甾醇的药理活性进行深入的研究。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供麦角甾醇在抗氧化应激方面的应用，为氧化应激相关疾病的治疗提供了新的治疗思路，并提高了麦角甾醇的利用率和在抗氧化应激方面的新用途。
本发明是这样实现的：
麦角甾醇在制备用于修复或改善或预防由氧化应激引起的细胞损伤的产品中的应用。
麦角甾醇在制备用于抵抗机体内的细胞成活率降低的药物中的应用，上述细胞成活率降低由氧化应激引起。
麦角甾醇在制备用于抵抗机体内的ros水平升高的药物中的应用，上述ros水平升高由氧化应激引起。
麦角甾醇在制备用于改善机体内的细胞形态异常的药物中的应用，上述细胞形态异常由氧化应激引起。
麦角甾醇在制备用于治疗或预防与氧化应激相关的疾病的药物中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明的研究结果显示，麦角甾醇可以有效地减少或修复或改善或预防或治疗由氧化应激引起的细胞损伤例如细胞成活率低、细胞内ros水平高以及细胞形态异常等。因此，本发明提供的麦角甾醇在制备修复或改善或预防由氧化应激引起的细胞损伤的产品等方面的新用途，以及在制备用于修复或改善或预防与氧化应激相关的疾病的药物中的新应用，为修复或改善或预防与氧化应激引起的损伤和相关疾病提供了理论依据和新的治疗思路。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例2提供的麦角甾醇氧化应激状态下的细胞形态影响结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的麦角甾醇在抗氧化应激中的应用进行具体说明。
一方面，本发明提供了麦角甾醇在制备用于修复或改善或预防由氧化应激引起的细胞损伤的产品中的应用。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述细胞损伤的类型包括细胞成活率低、细胞内ros水平高以及细胞形态异常中一种或几种。
具体地，在本发明的一些实施方案中，相对于正常形态细胞，上述细胞形态异常的表现为：细胞收缩变圆，膜破裂，内容物溢出。
经h2o2处理后的细胞成活率降低，细胞形态异常以及细胞内的ros水平升高，本发明的研究结果显示，将h2o2处理后的细胞用麦角甾醇处理后，细胞成活率有提高、细胞形态得到改善且细胞内的ros水平降低。
麦角甾醇具有减少或修复或改善或预防或治疗由氧化应激引起的细胞损伤例如细胞成活率低、细胞内ros水平高以及细胞形态异常等的功能或作用。
基于此，另一方面，本发明提供了麦角甾醇在制备用于抵抗机体内的细胞成活率降低的药物中的应用，上述细胞成活率降低由氧化应激引起。
另一方面，本发明提供了麦角甾醇在制备用于抵抗机体内的ros水平升高的药物中的应用，上述ros水平升高由氧化应激引起。
另一方面，本发明提供了麦角甾醇在制备用于改善机体内的细胞形态异常的药物中的应用，上述细胞形态异常由氧化应激引起。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述机体为人。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，相对于正常形态细胞，上述细胞形态异常的表现为：细胞收缩变圆，膜破裂，内容物溢出。
另一方面，本发明提供了麦角甾醇在制备用于治疗或预防与氧化应激相关的疾病的药物中的应用。
氧化应激是指由内源性的活性氧所致的细胞毒性损伤。许多中枢神经系统疾病都涉及到氧化应激损伤，如阿尔茨海默病(又称帕金森病)、alzheimer病和衰老等病灶周围都要产生大量的活性氧簇(reactiveoxygenspecies，ros)自由基。细胞内氧化系统与抗氧化系统失衡，导致ros在细胞中累积是氧化应激的主要特征之一。阿尔茨海默病患者的脑和脑脊髓液中发现了的氧化应激标别物如丙烯醛、丙二醛和4-羟基-2,3-壬醛。具有很高反应性、对海马细胞有毒性作用的羟基壬酸钠在阿尔茨海默病患者中大量积累。氧化应激诱导的蛋白羰基化在阿尔茨海默病患者的脑额叶、顶叶皮层和海马中均有发现。
因此，基于本发明的研究结果，本领域技术人员容易理解到，麦角甾醇具有用于治疗由氧化应激相关的中枢神经系统疾病的前景，例如阿尔茨海默病。
基于此，进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述疾病为中枢神经系统疾病。
在较强的氧化应激条件下，细胞损伤可能影响胰腺b细胞功能，使得受损抗氧化酶的表达对ros变得敏感。ii型糖尿病的并发症与摄取大量葡萄糖后生成超氧自由基阴离子有关。
因此，基于本发明的研究结果，本领域技术人员容易理解到，麦角甾醇具有用于治疗ii型糖尿病的前景。
基于此，进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述疾病为ii型糖尿病。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
麦角甾醇提高处于氧化应激状态下的细胞成活率
1.细胞培养
将pcs-201-012细胞(猫原代皮肤成纤维细胞，购自atcc)从液氮管中取出进行复苏后换液、转移至dmem培养基中放到37±1℃，5％co2的培养箱中静止培养，细胞传代2-3次后收集传代的对数期pcs-201-012细胞，用完全培养液将细胞吹打成单细胞悬液进行细胞计数，用于后续实验。
2.氧化应激的细胞模型建立
用过氧化氢溶液处理细胞得到细胞氧化应激模型，实验分为损伤组、预保护组、治疗组、阳性对照组和空白对照组。每组的具体处理如下：
(1)损伤组：细胞计数完，用dmem完全培养液稀释细胞悬液后加到96孔板，每孔5000个细胞，每孔加入100μl，然后加入经完全培养基稀释的h2o2，使其终浓度为0.6mmol/l，每孔中液体总体积为200μl。在37±1℃，5％co2的培养箱中培养3h后，去除原培养液，用pbs清洗2次，再换仅含有10％胎牛血清的dmem介质培养细胞24h；
(2)预保护组：细胞计数完，用dmem完全培养液稀释细胞悬液后加到96孔板，每孔5000个细胞，每孔加入80μl，然后加入20μl经完全培养基稀释的麦角甾醇溶液，使其终浓度分别为200μg/ml、400μg/ml，每孔中液体总体积为200μl。在37±1℃，5％co2的培养箱中培养24h后，去除原培养液，用pbs清洗2次。再用含h2o2(终浓度为0.6mmol/l)、每孔液体总体积为200μl的培养液培养细胞3h；
(3)治疗组：细胞计数完，用dmem完全培养液稀释细胞悬液后加到96孔板，每孔5000个细胞，每孔加入100μl，然后加入经完全培养基稀释的h2o2，使其终浓度为0.6mmol/l，每孔中液体总体积为200μl。在37±1℃，5％co2的培养箱中培养3h后，去除原培养液，用pbs清洗2次。然后在含有20μl经完全培养基稀释，终浓度分别为200μg/ml、400μg/ml的麦角甾醇的培养液中培养细胞24h，每孔中液体总体积为200μl。
(4)阳性对照组：用200μg/mln-乙酰半胱氨酸代替麦角甾醇作为阳性对照，具体操作如上述的(2)、(3)。
(5)空白对照组：正常培养液进行培养的细胞为空白对照组。
3.pcs-201-012细胞增殖的测定
采用cck-8法检测麦角甾醇对成纤维细胞体外的增殖作用。cck-8试剂中的2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2h-四唑单钠盐(wst-8)，可用于细胞增殖和毒性分析。其工作的基本原理为：在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲酯盐(1-methoxypms)的作用下，细胞线粒体中的脱氢酶可以将wst-8还原为水溶性的橙黄色甲臜产物(formazan)。生成的产物的颜色深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比，产物的量与活细胞的数量成正比。具体的细胞增殖检测如下：
(1)取步骤2处理后的细胞悬液100μl接种于96孔板；
(2)在每个孔内加入10μl的cck-8试剂；
(3)把培养板放在培养箱内培养1～4h；
(4)用酶标仪测定450nm处的吸光度。
(5)细胞存活率计算：细胞存活率(％)＝(测试组od值)/(空白组od值)×100％。测试组od值指损伤组、预保护组、治疗组和阳性对照组的吸光度，空白组od值指空白对照组的吸光度。
(6)采用spss23.0和flowing2.5.1软件包进行数据的统计学分析。结果见表1。
表1麦角甾醇对细胞存活率的影响
注：a表示与损伤组比较，p<0.05；b,c分别表示麦角甾醇治疗组与预防组与相应浓度阳性对照的比较，p<0.05。
表1的结果显示，与空白对照组相比，0.6mmol/lh2o2处理可以造成细胞的损伤，使细胞成活率降低至36.47％。使用麦角甾醇的预防组和治疗组中的细胞相比于h2o2的处理组细胞的存活率均有所提高，并呈浓度依赖性，且麦角甾醇的预防组和400μg/ml时的治疗组显著高于h2o2处理组的成活率(p<0.05)。同浓度麦角甾醇治疗组的存活率高于n-乙酰半胱氨酸阳性组，且具有显著性差异(p<0.05)。而同浓度麦角甾醇预防组存活率显著低于阳性n-乙酰半胱氨酸组(p<0.05)。同时麦角甾醇的预防组和治疗组的效果有所差异，预防组的效果好于治疗组的。由此表明，麦角甾醇具有提高处于氧化应激状态下的细胞成活率的功能或作用。
实施例2
麦角甾醇改善由氧化应激引起的细胞形态异常
倒置显微镜可用于离体细胞的培养观察，本实施例中取实施例1中步骤2各组处理的细胞，于15×40倍，观察细胞形态。结果如图1所示。
图1显示了h2o2和麦角甾醇对细胞氧化损伤造成的形态变化(图中：a：空白对照组；b：0.6mmol/lh2o2损伤组；c：200μg/ml麦角甾醇治疗组；d：200μg/mln-乙酰半胱氨酸治疗组)。从图中可看出，于倒置显微镜下观察，空白对照组细胞呈梭形，大小均匀，边缘清晰，呈铺路石状单层镶嵌排列，细胞生长良好，贴壁牢固，细胞间紧密连接(图1-a)；0.6mmol/lh2o2处理的损伤组细胞形态异常，表现为细胞收缩变圆，膜破裂，内容物溢出，造成损伤(图1-b)。200μg/ml麦角甾醇治疗组细胞排列不规则，细胞膨大(图1-c)。200μg/mln-乙酰半胱氨酸组部分细胞膨大，出现细胞破裂，内容物溢出(图1-d)。由此表明，麦角甾醇改善由氧化应激引起的细胞形态异常。
实施例3
麦角甾醇抑制由氧化应激引起的ros水平升高
ros主要通过利用活性氧检测试剂盒(reactiveoxygenspeciesassaykit)中的荧光探针dcfh-da检测细胞内ros水平变化。dcfh-da探针本身没有荧光，但可穿过细胞膜进入细胞内，同时被酯酶水解生成dcfh。生成的dcfh可以被活性氧氧化成有荧光的dcf，荧光强度与细胞内活性氧水平成正比。
用流式细胞仪对细胞内的ros进行测定，具体操作方法如下：
(1)取对数生长期的细胞消化成单细胞悬液，调节细胞浓度为2.5×105/ml，按每孔1ml接种于12孔细胞培养板中，37±1℃，5％co2培养箱中培养24h。
(2)弃去旧的培养液，用无血清培养基重复洗三次，再按上述分组进行处理，每组设3个重复孔，按照要求继续培养细胞3h。
(3)用无血清dmem培养基按照1：1000比例稀释dcfh-da(活性氧检测试剂盒)，使其终浓度为10μmol/l。去除培养皿里的细胞培养液，加入1ml稀释好的dcfh-da，然后在37℃细胞培养箱内，孵育20min，再用无血清的dmem培养基洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的dcfh-da。
(4)胰酶消化后收集细胞，1000rpm，4℃离心3min，弃上清，用预冷的pbs洗涤3次，再用pbs重悬细胞，400目的细胞筛过滤细胞，用流式细胞在488nm激发波长，525nm发射波长下进行检测。结果见表2。
表2麦角甾醇对细胞内ros的影响
注：a表示与对照组比较，p<0.01；b表示与损伤组比较，p<0.01。损伤组是指用h2o2处理而未用麦角甾醇处理的细胞组。
根据表2的结果可知，与对照组的正常细胞相比，0.6mmol/l的h2o2处理后的细胞，胞内的荧光强度增加，说明在此浓度下的h2o2能够诱发细胞内ros水平的增加。麦角甾醇作为治疗组时可以降低受损细胞内的荧光强度，并呈浓度依赖的趋势，由此可知麦角甾醇可以通过降低ros水平来减少细胞的受损，在400μg/ml时麦角甾醇使ros水平降至正常水平以下。当麦角甾醇作为预防组时也可以降低受损细胞内的荧光强度，与正常细胞组相比，较低浓度时就可使ros水平降至正常水平以下，说明麦角甾醇能够降低h2o2诱发的细胞产生的ros，并且麦角甾醇的处理组与h2o2的处理组具有显著性差异(p<0.05)。200μg/mln-乙酰半胱氨酸治疗组和预防组也能显著降低h2o2诱导的ros水平，并且降低ros水平的能力强于相应浓度麦角甾醇。由此表明，麦角甾醇具有抑制由氧化应激引起的ros水平升高的作用。
综上，麦角甾醇可以有效地减少或修复或改善或预防或治疗由氧化应激引起的细胞损伤例如细胞成活率低、细胞内ros水平高以及细胞形态异常等。因此，本发明提供的麦角甾醇在制备修复或改善或预防由氧化应激引起的细胞损伤的产品等方面的新用途，以及在制备用于修复或改善或预防与氧化应激相关的疾病的药物中的新应用，为修复或改善或预防与氧化应激引起的损伤和相关疾病例如ii型糖尿病或中枢神经系统疾病提供了理论依据和新的思路。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。