治疗缺血再灌注损伤的化合物的制作方法

本发明属于医药化学
技术领域：
，尤其是涉及式(i)化合物、或其药学上可接受的盐、或其溶剂化物、或其代谢产物在制备治疗缺血再灌注损伤及相关疾病，炎症疾病，细胞死亡相关疾病的药物中的用途，尤其是治疗肝脏、心脏、肾脏、脑等脏器的缺血再灌注导致的机体损伤的药物。
背景技术：
：缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusioninjury，iri)是1960年jennings首先提出的概念，是指组织器官缺血后血液再灌注，不仅不能使组织器官功能恢复，反而加重组织器官的功能障碍和结构损伤。缺血再灌注损伤在许多重要器官包括心、肝、肺、肾、胃肠道等均可发生。肝脏缺血再灌注损伤(hepaticischemiareperfusioninjury，hiri)是肝脏外科手术中常见的病理过程，多见于休克、需要阻断肝脏血流的肝外科手术以及肝移植术等病理生理过程中。近年来，随着临床治疗技术的发展，肝移植、溶栓治疗以及肝门阻断术等手术的开展越来越多，尽管肝脏保护、外科技巧及术中监护不断改进，但缺血再灌注所致肝损伤依然是引起术后脏器无功能，移植失败甚至患者死亡的主要原因。肝脏经历缺血再灌注后，肝脏组织细胞发生一系列代谢、结构和功能的损伤，易诱发肝功能衰竭，是影响疾病预后、手术成功率和病人存活率的主要原因之一。急性冠状动脉梗阻性疾病是目前心脑血管疾病的主要致死原因之一。尽管心脏搭桥术、介入及溶栓等治疗有了很大的进步，但急性心梗患者的死亡率依然较高，其中一个很重要的原因就是尚无有效办法抑制缺血心肌恢复血流时所引起的缺血再灌注损伤。心肌缺血一定时间后，重新恢复血供，会造成机体内炎症因子及氧自由基等大量释放，心肌细胞凋亡率增加，恶性心律失常如室颤、室速等发生增加，心肌能量代谢及结构上出现损伤。肾脏也同样是高灌注器官，对缺血以及缺血再灌注均敏感。肾脏缺血再灌注损伤是缺血性急性肾功能衰竭的重要损伤环节，也是肾移植中影响移植肾早期功能恢复的制约因素。因此，如何减轻和消除缺血再灌注损伤以及阐明这种损伤的机制，有重要的临床实用价值。目前认为有多个机制参与了器官的缺血再灌注损伤：如致炎性细胞因子(tnf-α和il等)、氧自由基、钙超载、微循环障碍、能量代谢紊乱等，还受缺血的时间、组织对氧的需求、侧枝循环的建立及电解质浓度等因素影响。技术实现要素：本发明通过实验研究发现了式(i)化合物、或其药学上可接受的盐、或其溶剂化物、或其代谢产物能够治疗和预防缺血再灌注损伤，特别是对肝脏、心脏、肾脏、脑的缺血再灌注损伤有良好的治疗和预防效果，尤其在肝脏的缺血再灌注损伤中有特别优异的治疗和预防效果，可以显著抑制缺血再灌注过程中的炎症反应和细胞死亡，在此基础上完成了本发明。本发明提供式(i)所示的化合物、或其药学上可接受的盐、或其溶剂化物、或其代谢产物在制备治疗缺血再灌注损伤及相关疾病，炎症疾病，细胞死亡相关疾病的药物中的用途，所述式(i)化合物的结构如下：其中，r1和r2独立地选自h、c1-6烷基、c1-6烷氧基、c2-6烯基、c2-6炔基、f、cl、br、氨基、芳基、杂芳基，上述基团各自任选被一个或多个选自如下基团所取代：c1-6烷基、c2-6烯基、c2-6炔基、f、cl、br、羟基、c1-6烷氧基；r3选自芳基、杂芳基，上述基团任选被一个或多个选自如下基团被取代：c1-6烷基、c2-6烯基、c2-6炔基、f、cl、br、氨基、羟基、c1-6烷氧基、c1-6烷氧基羰基、环烷基、芳基、哌嗪基、哌啶基、吡啶基、吗啉基、吡咯烷基、吡唑烷基、咪唑烷基和硫代吗啉基；上述基团c1-6烷基、c2-6烯基、c2-6炔基、c1-6烷氧基、环烷基、芳基、哌嗪基、哌啶基、吡啶基、吗啉基、吡咯烷基、吡唑烷基、咪唑烷基、硫代吗啉基还可以被一个或多个c1-6烷基、c1-6烷氧基、或c1-6烷氧基羰基所取代。本发明中，所述烷基指具有1-6个碳原子的直连或支链烷基，所述烷基例如为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、戊基、新戊基。所述烯基指具有2-6个碳原子的直连或支链烯基，所述烯基例如为乙烯基、丙烯基、异丙烯基。所述炔基指具有2-6个碳原子的直连或支链炔基，所述炔基例如为乙炔基、丙炔基、丁炔基。所述烷氧基指具有1-6个碳原子的直连或支链烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基。所述卤素为氟、氯、溴、碘，优选为氟、氯、溴。所述芳基指具有6-20个(优选6-14个)碳原子的单环或多环芳族基团，代表性的芳基包括：苯基、萘基、蒽基等。所述的杂芳基是指具有1-20个碳原子和1-4个选自n、o、s的杂原子的单环或多环芳族基团。杂芳基可以是具有3-7个环原子(2-6个碳原子和1-3个选自n、o、s的杂原子)的单环或具有7-10个环原子(4-9个碳原子和1至3个选自n、o、s的杂原子)的双环。杂芳基包括但不限于吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、s-三嗪基、噁唑基、咪唑基、噻唑基、异噁唑基、吡唑基、异噻唑基、呋喃基、噻吩基、吡咯基等。根据本发明，所述式(i)化合物中，优选的，r3选自苯基、萘基、噻唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、咪唑基、苯并咪唑基、噻吩基、苯并噻吩基、吡啶基、喹啉基、异喹啉基、噁唑基、呋喃基、苯并呋喃基、吡咯基、吡唑基、吡嗪基、嘧啶基、三嗪基、吲哚基、嘌呤基，上述基团各自任选被一个或多个选自如下基团所取代：c1-6烷基、c2-6烯基、c2-6炔基、f、cl、br、氨基、羟基、c1-6烷氧基、c1-6烷氧基羰基、苯基、环烷基、哌嗪、哌啶、吡啶、吗啉、吡咯烷、吡唑烷、咪唑烷硫代吗啉、和c1-6烷基氧基羰基哌啶基。在一个优选技术方案中，r3选自苯基、萘基、噻唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并咪唑基、噻吩基、喹啉基、异喹啉基、吡啶基，上述基团任选被一个或多个选自如下取代基所取代：c1-6烷基、c1-6烷氧基、c1-6烷氧基羰基、f、cl、br、羟基、苯基、哌嗪基、哌啶基、吗啉基、c1-6烷氧基羰基哌啶基。在一个优选方案中，r3选自噻唑基、2-苯并噻唑基、2-苯并噁唑基、2-苯并咪唑基、4-甲基-2-苯并噻唑基、噻吩基、4-甲基-2-噻唑基、5-甲基-2-噻唑基、4,5-二甲基-2-噻唑基、苯基、1-萘基、2-萘基、1,4-联苯基、3-哌嗪-苯基、4-哌啶-苯基、4-哌嗪-3-吡啶基、4-甲基-3-吡啶基、3-吡啶基、2-吡啶基、3-叔丁基-苯基、6-甲氧基-2-苯并噻唑基、6-氟-2-苯并噻唑基、4-苯基-2-噻唑基、3-吗啉-苯基、4-(n-叔丁氧基羰基)哌啶基-3-苯基、3-哌啶基-苯基、3-异丙基-苯基、3-喹啉基、8-喹啉基、8-异喹啉。在一个优选技术方案中，r1和r2独立地选自h、f、cl、br、c1-6烷基、c1-6烷氧基。在又一个优选方案中，当r2为h时、r1选自甲氧基和c1；当r1为h时、r2选自br和cl；在一个优选方案中，式(i)化合物为如下式(ii)化合物，(ii)其中，x选自o、s、nh或c；r1和r2独立地选自h、卤素、羟基、c1-6烷氧基、c1-6烷基；r3至r6独立地选自h、卤素、c1-6烷氧基或c1-6烷基。在一个优选方案中，式(i)化合物为如下式(iii)化合物，r1和r2独立地选自h、卤素、羟基、c1-6烷氧基、c1-6烷基；r4、r5独立地选自h、卤素、c1-6烷氧基、c1-6烷基、苯基、c1-6烷基苯基、c1-6烷氧基苯基、卤素取代的苯基。在一个优选方案中，所述式(i)化合物为如下式(iv)化合物，r1和r2独立地选自h、卤素、羟基、c1-6烷氧基、c1-6烷基；r3、r4独立地选自h、卤素、c1-6烷氧基、c1-6烷基、任选取代的苯基、任选取代的哌啶基、任选取代的哌嗪基，所述取代基可为c1-6烷基、c1-6烷氧基、c1-6烷氧基羰基、卤素。优选的，r3、r4独立地选自h、叔丁基、异丙基、苯基、哌嗪基、4-哌啶基、4-叔丁基氧基羰基哌啶基。根据本发明，所述式(i)化合物优选为如下具体化合物：根据本发明，所述式(i)化合物进一步优选为如下具体化合物：在本发明的一个具体实施方案中，所述式(i)化合物是在此简称为ml355。本文所用术语“药学上可接受的盐”是指药物活性化合物的衍生物，其中通过制备其酸式盐或碱式盐来修饰母体化合物。药学上可接受的盐的实例包括但不限于，碱性残基(如胺类)的无机酸盐或有机酸盐，酸性残基(如羧酸)的碱性盐或有机盐，等。药学上可接受的盐包括由诸如无毒性的无机或有机酸形成的母体化合物的常规无毒性的盐或季铵盐。例如，这些常规的无毒性盐包括那些源自无机酸的盐，如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等；以及由有机酸制备的盐，如，乙酸、丙酸、琥珀酸、羟基乙酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、延胡索酸、甲磺酸、甲苯磺酸、水杨酸、对氨基苯磺酸等。本发明的药学上可接受的盐可以通过常规的化学方法从含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。通常，这种盐可以通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量的适当的碱或酸在水或有机溶剂或二者的混合物中反应制备。本发明式(i)化合物可以按照us2017001955a1记载的方法进行合成，该专利文献全文引入参考。对于ml355，可以商购获得，也可以按照文献记载的方法进行合成(参见us2017001955a1；journalofmedicinalchemistry2014，57，495-506)。根据本发明，所述缺血再灌注损伤及相关疾病优选为肝脏缺血再灌注损伤及相关疾病、心脏缺血再灌注损伤及相关疾病、肾脏缺血再灌注损伤及相关疾病、脑卒中；更优选为肝脏缺血再灌注损伤及相关疾病。根据本发明，所述缺血再灌注损伤优选为肝脏缺血再灌注损伤、心脏缺血再灌注损伤、肾脏缺血再灌注损伤、脑卒中；更优选为肝脏缺血再灌注损伤。肝脏缺血再灌注损伤及相关疾病的引发因素包括但不限于：肝脏囊肿、肝脏移植、溶栓治疗、肝门阻断术、肝昏迷。心脏缺血再灌注损伤及相关疾病的引发因素包括但不限于：心肌梗塞、心梗再通损伤、心脏移植、冠状动脉溶栓术、经皮冠状动脉成形术，冠状动脉内扩张术，冠状动脉旁路术。肾脏缺血再灌注损伤及相关疾病的引发因素包括但不限于：肾脏移植、肾脏囊肿、肾脏血管手术。脑缺血再灌注损伤及相关疾病的引发因素包括但不限于：脑卒中、脑血管手术等。所述的炎症疾病包括但不限于：肝炎、心肌炎、心内膜炎、肾炎。根据本发明，所述药物进一步包含药学上可接受的辅料。所述药学上可接受的辅料是制药领域中常用或已知的各种辅料，包括但不限于：稀释剂、粘合剂、抗氧化剂、ph调节剂、防腐剂、润滑剂、崩解剂等。所述稀释剂例如：乳糖、淀粉、纤维素衍生物、无机钙盐、山梨醇等。所述粘合剂例如：淀粉、明胶、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮等。所述抗氧化剂例如：维生素e、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、丁羟基茴香醚等。所述ph调节剂例如：盐酸、氢氧化钠、柠檬酸、酒石酸、tris、乙酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等。所述防腐剂例如：对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、间甲酚、苯扎氯铵等。所述润滑剂例如：硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉等。所述崩解剂例如：淀粉、甲基纤维素、黄原胶、交联羧甲基纤维素钠等。本发明药物的剂型可以是口服剂的形式，例如片剂、胶囊、丸剂、粉剂、颗粒剂、悬浮剂、糖浆剂等；也可以是注射给药的剂型，例如注射液、粉针剂等，通过静脉内、腹膜内、皮下或肌肉内的途径。所有使用的剂型形式都是药学领域普通技术人员所熟知的。本发明的药物可施用于会发生或已经发生缺血再灌注损伤的任何动物。这些动物包括人类和非人类的动物，例如宠物或牲畜等。本发明的药物可以本领域已知的途径施用于受试者，包括但不限于口服，胃肠外，皮下，肌内，静脉内，腹腔内，肝内，心肌内，肾内，阴道，直肠，颊，舌下，鼻内，透皮方式等。施用的剂量将取决于接受者的年龄、健康和体重，联用药物的种类，治疗频率，给药途径等。药物可以单一日剂量施用，或者总日剂量以每天两次，三次或四次的分开剂量施用。药物可以手术前、手术中、手术后施用。剂量可以施用一次或多次，施药时间可以单日至几个月或更长时间。药物的单次剂量可以在每个患者每天约0.0001至约10000mg的宽范围内变化。该范围可以更特别地为成人(约60kg)每天约0.001mg/kg至100mg/kg体重/天。根据本发明，所述药物还可以与其他的治疗缺血再灌注相关损伤、炎症疾病、细胞死亡相关疾病的药物联用给药。本发明的发明人发现式(i)化合物具有所述治疗活性，与其是alox12抑制剂有关。本发明的发明人在研究中发现，在肝脏缺血再灌注损伤的组织中alox12蛋白表达量和mrna表达量都显著增加，变化的幅度和显著性远高于alox的其他成员(例如alox5、alox15)，表明alox12与缺血再灌注损伤，尤其是肝脏缺血再灌注损伤的关联更大。并且，发明人还发现，过表达alox12会促进缺氧和复氧处理后的肝细胞、心脏细胞和肾脏细胞的活性降低以及炎症反应，而低表达alox12则会缓解缺氧和复氧处理后的肝细胞、心脏细胞和肾脏细胞的活性降低以及炎症反应，表明alox12会促进缺血再灌注损伤的发生发展，以及这些脏器的炎症疾病和细胞死亡性疾病，抑制alox12的活性能够治疗缺血再灌注损伤，以及这些脏器的炎症疾病和细胞死亡性疾病。附图说明图1a和1b：肝脏缺血再灌注损伤中，给药ml3551mg/kg、2mg/kg、3mg/kg后，小鼠血清中alt、ast的检测结果(n.s.代表p≥0.05，*代表0.01≤p<0.05，**代表p<0.01)。图2：肝脏缺血再灌注损伤中，给药ml3551mg/kg、2mg/kg、3mg/kg后，小鼠肝脏he染色镜检图。图3a和3b：肝脏缺血再灌注损伤中，给药ml3553mg/kg后，随时间推移小鼠血清中alt、ast的检测结果(n.s.代表p≥0.05，*代表0.01≤p<0.05，**代表p<0.01)。图4：肝脏缺血再灌注损伤中，给药ml3553mg/kg后，随时间推移肝脏组织tunel染色结果，图中白色细胞代表凋亡的细胞。图5a和5b：肝脏缺血再灌注损伤中，给药ml3553mg/kg后，随时间推移肝脏mac1和ly6g阳性炎症细胞免疫荧光染色结果，图中浅灰色细胞代表炎症细胞。图6a和6b：心脏缺血再灌注损伤中，给药ml3553mg/kg后，随时间推移ck、ldh的检测结果(n.s.代表p≥0.05，*代表0.01≤p<0.05，**代表p<0.01)。图7a和7b：肾脏缺血再灌注损伤中，给药ml3553mg/kg后，随时间推移bun、scr的检测结果(n.s.代表p≥0.05，*代表0.01≤p<0.05，**代表p<0.01)。图8：脑缺血再灌注损伤中，给药ml3553mg/kg后，随时间推移脑梗死体积的检测结果(n.s.代表p≥0.05，*代表0.01≤p<0.05，**代表p<0.01)。图9a：肝脏缺血再灌注损伤中，alox12、alox5、alox15的mrna表达量rt-pcr的检测结果图(n.s.表示p≥0.05，**表示p<0.01)。图9b：肝脏缺血再灌注损伤中，alox12、alox5、alox15的蛋白表达量western-blot的检测结果图。图中gapdh为对照标准品。图10：l02细胞经gfp及alox12过表达慢病毒转染后alox12蛋白表达情况鉴定图。图中gapdh为对照标准品。图11：alox12过表达对h/r处理诱导的l02细胞损伤中，ldh释放检测结果(n.s.表示p≥0.05，*表示0.01≤p<0.05，**表示p<0.01)。图12：alox12过表达对h/r处理诱导的l02细胞损伤中，炎症因子il-6、tnf-α及趋化因子ccl2、cxcl10的mrna的检测结果(n.s.表示p≥0.05，*表示0.01≤p<0.05，**表示p<0.01)。图13：h9c2细胞经shrna及shalox12慢病毒转染后alox12蛋白表达情况鉴定图。图中gapdh为对照标准品。图14：alox12敲低对h/r处理后h9c2细胞活性的影响(n.s.表示p≥0.05，**表示p<0.01)。具体实施方式以下结合实施例对本发明做进一步描述。需要说明的是，实施例不能作为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员理解，任何在本发明基础上所作的改进和变化都在本发明的保护范围之内。以下实施例所用化学试剂都是常规试剂，均可商购获得。未做特殊说明的实验方法都是采用本领域已知的常规方法。在以下实施例中所采用的动物模型及各研究指标的检测方法：实验动物：选用8-10周龄、体重在24g-27g、背景为雄性c57bl/6品系的野生型小鼠(购自北京华阜康生物科技股份有限公司)。动物饲养:所有实验小鼠均饲养在武汉大学spf级实验动物中心。饲养条件：室温在22-24℃之间，湿度在40-70％之间，明暗交替照明时间为12h，自由饮水摄食。hek293t，人胚肾细胞，购自中国科学院细胞库，目录号gnhu43。l02，人肝细胞系，购自中国科学院细胞库，目录号gnhu6。h9c2，大鼠心肌细胞，购自中国科学院细胞库，目录号gnr5。细胞均培养于dmem高糖培养基(含10％fbs，1％青霉素-链霉素)中。培养环境：37℃，5％co2。1、小鼠肝缺血再灌注(ischemia/reperfusion，i/r)损伤模型构建及相关检测：手术前12h给小鼠禁食，可自由饮水。术前用3％戊巴比妥钠麻醉小鼠后，将其平卧固定肢体，用剃毛器将小鼠腹部术区毛刮净，用10％碘酒和75％乙醇对术区消毒。取腹正中切口进腹，暴露肝脏左、中叶之肝蒂。用无创血管夹夹闭中叶和左叶的门静脉和肝动脉，使约70％的肝脏缺血，以防止发生严重肠系膜静脉淤血。0.5min后，与非阻断的右叶相比，可见阻断叶变白，说明阻断成功。记录缺血开始时间，维持缺血60分钟，sham组的小鼠不进行肝脏血流阻断。缺血60min后去除血管夹，恢复缺血的肝脏血流，然后关闭腹腔缝合后，将手术后的小鼠置于干净的笼子中单独饲养，观察。取材：分别于术后0h、1h、3h、6h、12h、24h取假手术组(sham组)以及缺血再灌注组小鼠，3％戊巴比妥钠麻醉，眼眶静脉丛取血1ml，分离血清。同时统一取缺血区肝左叶组织分别置于液氮中进行速冻或于10％中性福尔马林中固定24h后脱水，包埋，制作石蜡切片。分离血清：收集血液的ep管于室温下静置1-2h使血液自然凝固。4℃、4000rpm/min离心30min，充分分离血清，保存于-80℃冰箱备用。肝脏缺血再灌注损伤严重程度的评估指标主要包括肝脏坏死面积、肝功能指标(ast、alt)、炎症反应、细胞死亡等，均与肝脏缺血再灌注损伤严重程度正相关。采用全自动生化分析仪(sysmex，chemix180i)测定小鼠血清的alt、ast含量。对石蜡切片采用he染色，显微镜拍照，观察肝脏病理改变。采用用tunel试剂盒染色石蜡切片检测肝细胞凋亡情况：tunel试剂盒：plusinsituapoptosisfluoresceindetectionkit(s7111，chemicon)。按照试剂盒说明书进行操作。用ly6g和mac1免疫荧光染色检测缺血再灌注后肝脏炎症细胞浸润情况，具体步骤如下：1)将石蜡切片置于烤箱中，60℃烤片30分钟；2)二甲苯，5分钟×3；3)100％乙醇，5分钟×2次；95％乙醇，5分钟；70％乙醇，5分钟；4)ddh2o漂洗，5分钟×2次；5)柠檬酸盐组织抗原修复液(100×，ph6.0，福州迈新)高压修复5min；6)ddh2o漂洗5分钟×2次，pbs漂洗5分钟×2次；7)组化笔划圈，滴加10％羊血清(gtx27481，genetex)封闭，于湿盒中37℃封闭60min；8)弃封闭液，滴加适当比例稀释的一抗：兔抗mac1(cd11b，1:100稀释，ab75476，abcam)；大鼠抗ly6g(1:100稀释，551459，bdbiosciences)，4℃孵育过夜；9)37℃复温30min；10)弃去一抗，pbs洗10min×3；11)滴加二抗(羊抗兔igg，invitrogen；羊抗大鼠igg，carlsbad)，于湿盒中37℃孵育60min；12)弃去二抗，pbs浸洗5min×3；13)slowfadegoldantifadereagentwithdapi封片14)荧光镜(olmpusdx51)下观察，拍照，用imageproplus(version6.0)软件进行图片分析。此外，于术后1h取假手术组(sham)以及缺血再灌注组小鼠，3％戊巴比妥钠过量麻醉，取缺血区肝组织，立即放入液氮中30min以上，之后保存于-80℃冰箱中，用于rt-pcr及westernblot分析。2、小鼠心脏缺血再灌注(ischemia/reperfusion，i/r)损伤模型构建及相关检测：采用阻断小鼠心脏左冠状动脉前降支(lad)造成心脏缺血，具体步骤如下：术前用3％戊巴比妥钠麻醉小鼠后，将其平卧固定肢体，用剃毛器将小鼠术区毛刮净。气管插管并连接呼吸机成功后，进行下步手术，整个手术过程用加热垫维持小鼠体温在37℃左右。小鼠采用右侧卧位，用医用碘酊及75％医用酒精对手术区皮肤进行消毒清洁处理，用眼科剪在左前肢下0.5cm处沿肋骨走向剪开皮肤，逐层分离筋膜、肌肉等组织，用显微剪于三、四肋间打开胸腔充分暴露心脏，用显微直镊夹起少量心包并于左心耳下撕开少许心包，充分暴露左冠状动脉前降支(lad)或所在区域。结扎冠状动脉：用无齿持针器持取7-0带针缝合线，于左心耳下缘1mm处进针，肺动脉圆锥旁出针，缝线从lad下方穿过，稳定5s后，结扎lad。结扎成功后，可见左室前壁明显由鲜红色变为苍白而不再恢复，同时心电图显示st段抬高和(或)t波高耸或者倒置呈弓背向上单向曲线。6-0缝线完全缝合胸腔开口关闭胸腔，5ml注射器接套管经切口插入胸腔，抽取1ml气体，平整各层肌肉，合拢皮肤切口暂不缝合，sham组不结扎lad，直接关胸。维持血流阻断60min。结扎完成后，6-0缝线完全缝合胸腔开口关闭胸腔，5ml注射器接套管经切口插入胸腔，抽取1ml气体。术后密切关注小鼠状态，有无呼吸异常等。待小鼠自然苏醒后将小鼠从呼吸机上取下并取下气管插管，放入干净的饲养笼。血清生化指标检测：分别于术后6h、12h、24h取假手术组(sham组)以及缺血再灌注组小鼠，3％戊巴比妥钠麻醉，眼眶静脉丛取血1ml，分离血清，用全自动生化分析仪(sysmex，chemix180i)测定血清中ck及ldh含量。3、小鼠肾脏缺血再灌注(ischemia/reperfusion，i/r)损伤模型构建及相关检测：模型构建：小鼠术前禁食12h，自由饮水。3％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠。小鼠背部去毛，消毒备皮。在背部脊椎旁0.5cm、肋骨下缘0.5cm处剪开皮肤及肌肉，可见到肾脏。分离出两侧肾脏的肾动脉，迅速用动脉夹夹闭两侧肾动脉。缺血60min后松开动脉夹，恢复血流，观察肾脏恢复情况。缝合开口。血清生化指标检测：于术后24h取假手术组(sham)以及缺血再灌注组小鼠，3％戊巴比妥钠麻醉，眼眶静脉丛取血1ml，离心后取血清，用全自动生化分析仪(sysmex，chemix180i)检测血清bun(尿素氮)和scr(血肌酐)水平。4、小鼠脑缺血再灌注(ischemia/reperfusion，i/r)损伤模型构建及相关检测：采用大脑中动脉闭塞构建脑缺血模型：3％异氟烷麻醉小鼠，8％硫化钠脱去颈部的鼠毛，3％活力碘消毒颈部及颅顶皮2次，75％酒精脱碘1次；分离左侧颈总动脉(cca)、颈外动脉(eca)和颈内动脉(ica)。用微动脉夹暂时夹闭ica、cca，在eca远心端结扎和剪一小口，将线栓由剪口送入ica，当线栓进入深度在9-11mm左右至血流下降遇阻力停，维持小鼠的肛温在37±0.5℃。从线栓进入脑血管至血流下降遇阻力时开始计时，45min后将线栓拔出，并将eca近心端结扎，迅速松开cca处动脉夹(sham组在从线栓进入脑血管至血流下降遇阻力时抽出线栓)。注意观察血流恢复情况，选择血流下降75％以上，血流恢复达70％以上的小鼠纳入实验。手术结束后，将小鼠放在温箱中，箱温维持在28℃，给水和饲料。脑组织ttc染色及梗死面积计算：腹腔注射3％戊巴比妥钠麻醉小鼠，取脑。将取下的脑组织放入1mm小鼠脑模，置于-20℃冰箱冻存。从-20℃冰箱取出脑组织，立即切成1mm厚的切片，共切7片。将切片立即置于10ml2％ttc溶液中，37℃恒温孵育10min。正常脑组织染色后呈鲜红色，而梗死区呈苍白色。用10％中性福尔马林溶液固定脑组织切片，大体拍照。脑梗体积计算(image-proplus6.0软件)：梗死体积％＝(对侧大脑半球体积-梗死侧未梗死体积)/(对侧大脑半球体积×2)×100％；总梗死体积为各自7张大脑切片结果数据之和。实施例1ml355对肝脏缺血再灌注损伤的抑制作用呈剂量依赖性为验证不同剂量ml355对肝脏缺血再灌注损伤的抑制作用，c57小鼠随机分为4组，分别通过尾静脉注射1mg/kgml355(hy-12341，mce公司)、2mg/kgml355、3mg/kgml355以及溶剂(对照组，dmso:solutol:peg400:水＝5:10:20:65(v:v:v:v))，之后按照前述肝脏i/r动物模型的方法进行i/r手术。术后不同时间点，取血清以及肝脏组织进行alt、ast酶活检测以及he染色。alt、ast检测结果分别如图1a、图1b所示，相比于溶剂对照组，ml355给药后，术后6h，小鼠血清中alt、ast含量显著降低，且ml3553mg/kg给药组alt、ast含量显著低于ml3551mg/kg及ml3552mg/kg给药组，ml355药效呈剂量依赖性。he染色结果如图2所示，溶剂组及ml3551mg/kg组肝组织结构模糊，排列紊乱，可见大面积坏死区，而随着ml355剂量的增加，肝脏组织坏死面积逐渐降低。ml3553mg/kg组肝组织基本正常，肝组织结构整齐，无明显的坏死区域。上述结果说明ml355对肝脏缺血再灌注损伤的抑制作用呈剂量依赖性，2mg/kg和3mg/kg的ml355可有效抑制肝脏缺血再灌注损伤。实施例2ml355有效减轻缺血再灌注引起的肝功能损伤为研究ml355对肝脏缺血再灌注后不同时间的保护作用，c57小鼠随机分为7组，每组20只。每组的其中10只小鼠通过尾静脉注射给以3mg/kg的溶于溶剂中的ml355，另外10只给以溶剂。给药完成后对7组小鼠进行i/r手术(其中一组为sham对照组，剩余6组为i/r实验组)，分别取sham对照组以及术后0h、1h、3h、6h、12h、24hi/r实验组小鼠血清，进行alt、ast检测，以评价肝功能损伤程度；取sham对照组以及术后0h、6hi/r实验组小鼠肝脏组织，制作石蜡切片，进行tunel染色、mac1免疫荧光染色和ly6g免疫荧光染色，以评价肝脏细胞的凋亡情况以及肝脏炎症细胞浸润情况。alt、ast检测结果如图3a和3b所示，sham假手术组alt、ast含量均较低，且ml355组与溶剂组之间无显著性差异。ml355组与溶剂组在i/r术后，随时间点的延长，alt、ast含量逐渐升高，并在术后6h达到最高点，随后alt、ast含量缓慢降低。而ml355组在术后1h、3h、6h、12h、24h，小鼠血清中alt、ast含量均较溶剂组显著降低。tunel染色结果如图4所示，随i/r术后时间的延长，肝脏细胞凋亡数量逐渐增多，在同一时间点，ml355组凋亡肝细胞数量显著低于溶剂组。mac1以及ly6g免疫荧光染色结果如图5a和5b所示，i/r术后6h，相比于sham组，mac1阳性细胞数以及ly6g阳性细胞数显著增多，说明i/r术后6h，小鼠肝脏中出现了明显的炎症细胞浸润情况；而相比于溶剂组，ml355组小鼠炎症细胞浸润情况显著降低。上述结果说明ml355可显著抑制缺血再灌注导致的肝脏损伤，减轻肝细胞凋亡，抑制炎症细胞浸润，保护肝功能。由上述实验可见，ml355对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用不仅起效快，并在足够长的时间内均有显著作用。实施例3ml355对不同组织缺血再灌注损伤的抑制1、ml355抑制心脏缺血再灌注损伤c57小鼠随机分为4组(sham组、i/r6h组、i/r12h组、i/r24h组)，sham组7只，其余3组每组15只，i/r组的其中7只小鼠通过尾静脉注射给以3mg/kg的溶于溶剂中的ml355，另外8只以及sham组给以溶剂。给药完成后对4组小鼠进行i/r手术，分别取sham对照组以及术后6h、12h、24hi/r实验组小鼠血清，进行ck及ldh检测，以评价心脏损伤程度。实验结果如图6a和6b所示，i/r术后血清中ck及ldh含量显著增加。当通过尾静脉给以ml355后，i/r术后各时间点，血清中ck含量较未给ml355组降低；同时血清中ldh含量在i/r术后6h和12h明显低于未给ml355组，而术后24h，由于ldh基本已恢复到本底水平，未见ml355给药组和溶剂对照组有显著差异。上述结果说明ml355对缺血再灌注造成的心脏损伤具有抑制作用。2、ml355抑制肾脏缺血再灌注损伤c57小鼠随机分为2组(sham组、i/r24h组)，每组14只。每组的其中7只小鼠通过尾静脉注射给以3mg/kg的溶于溶剂中的ml355，另外7只给以溶剂。给药完成后对小鼠进行i/r手术，分别取sham对照组以及术后24hi/r实验组小鼠血清，进行血清bun(尿素氮)和scr(血肌酐)检测，以评价肾脏损伤程度。实验结果如图7a和7b所示，i/r术后血清中bun及scr含量较sham组显著增加，当通过尾静脉给以ml355后，i/r术后24h血清中bun及scr含量低于未给ml355组，并出现统计学的显著性差异。上述结果说明ml355对缺血再灌注造成的肾脏损伤也具有抑制作用。3、ml355抑制脑缺血再灌注损伤c57小鼠随机分为2组(溶剂组、ml355组)，每组6只。ml355组小鼠通过尾静脉注射给以3mg/kg的溶于溶剂中的ml355，溶剂组给以溶剂作为对照，给药完成后对2组小鼠进行i/r手术。术后取脑组织，进行ttc染色，以评价脑损伤程度。i/r术后溶剂组与ml355组ttc染色结果如图8所示，ml355可显著降低缺血再灌注导致的脑部梗死面积，说明ml355对脑卒中有抑制作用。rt-pcr：组织中rna的提取①取100mg组织，放入1ml玻璃匀浆器中，加入1mltrizol，在冰浴中研磨，悬液转入1.5ml离心管中，室温静置5min，使核蛋白完全从核酸上解离；②4℃12000r/min离心5min，取上清液，加氯仿200μl，漩涡混匀器震荡30s，冰盒上静置10min；③4℃12000r/min离心15min，取上清液，加入0.5ml异丙醇，充分混匀，冰盒上静置10min，使rna充分沉淀；④4℃12000r/min离心15min，弃去上清，加入1ml预冷的75％乙醇，漩涡混匀器震荡30s洗涤rna沉淀；⑤4℃12000r/min离心5min，弃去上清液，沉淀快速风干。提取rna加适量的depc去离子水溶解。细胞中rna的提取收集细胞并用pbs缓冲液洗涤2次，完成后加入1mltrizol，用加样器吹打均匀，吸入1.5ml离心管中，漩涡混匀器震荡30s，室温静置5min，使核蛋白完全从核酸上解离。其余操作步骤同组织中rna提取②-⑤。反转录使用transcriptorfirststrandcdnasynthesiskit(04896866001,roche,basel,switzerland)反转录试剂盒根据试剂盒说明书进行反转录实验。westernblot：1)组织蛋白提取①向于干冰中预冷的ep管中放入3-4颗钢珠，并加入称重定量之后的组织样本。②向裂解液中加入pmsf，混匀后加至样品中，迅速摇匀。③于-80℃预冷研磨仪适配器中研磨样品，研磨参数设置为30hz/s，90s。④研磨结束后，冰上放置10min，取出钢珠。⑤超声裂解仪裂解样本(5khz/次，每次1s，间隔1s，重复10次)，超声完成后冰上放置10min。⑥样本放入4℃预冷的离心机中，12000rpm/min离心30min。⑦吸取上清转移到新的ep管中，4℃，14000rpm/min离心10min。⑧吸取上清转移到新的ep管中继续离心，4℃，14000rpm/min离心5min。⑨准确吸取上清液并利用bcaproteinassaykit(pierectm，23225)进行蛋白定量。2)细胞中蛋白提取细胞加入裂解液，裂解完成后离心取上清，运用bcaproteinassaykit定量收集蛋白样品。3)上样与电泳配置好电泳凝胶，并在电泳槽内加入电泳液。把蛋白样品上样到sds-page胶加样孔内，点样完成后开始电泳。4)转膜①配制转膜液，于4℃预冷。②将pvdf在甲醇中浸泡15s后放入转膜液中备用。③取出凝胶板中的凝胶，用转膜液洗涤凝胶，将凝胶平铺在负极的滤纸上，将pvdf膜覆盖其上，夹上夹板。④将夹板放入转膜槽中，灌满转膜液以淹没凝胶。⑤转膜槽接通电源，电压设为250v，电流设为0.2a。转移1.5h。⑥转移结束后，取出pvdf膜。5)封闭把蛋白膜放置到预先准备好的tbst中，洗去膜上的转膜液。蛋白膜放入封闭液中，在摇床上缓慢摇动，室温封闭1-4h。6)一抗孵育①用tbst洗涤蛋白膜3次，每次5min。②封口机将薄膜封入杂交袋中，加上一抗。③将杂交袋放入4℃摇床中，过夜。7)二抗孵育①将薄膜取出用tbst洗涤3次，每次5min，回收一抗。②将膜放入对应的加有二抗的二抗稀释液中，避光孵育1h。8)蛋白检测孵育后用tbst洗涤3次，每次5min。利用bio-radchemidocxrs+凝胶成像系统检测目的条带。alox12过表达质粒构建：1)pcr扩增alox12基因，引物为：正向：5’-tcgggtttaaacggatccatgggccgctaccgcatccg-3’；反向；5’-gggccctctagactcgagtcagatggtgacactgttct-3’；2)pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，随后使用dna凝胶回收试剂盒(天根)进行dna片段的回收；3)将所得dna产物和限制性内切核酸酶fastdigestrestrictionenzymes(thermo)、10×bufferor10×greenbuffer、ddh2o混合均匀(50μl体系)，置于37℃条件下反应。使用axypreptmpcrclean-upkit(axygen)回收酶切产物；4)使用pcr一步定向克隆试剂盒(novoprotein)按照试剂盒说明书进行重组反应；5)制作大肠杆菌感受态细胞，将上述连接产物进行转化实验，涂板，置于37℃培养箱，过夜培养；6)从37℃培养箱中取出过夜培养的平板，挑克隆摇菌，并检测菌落pcr阳性克隆；7)将pcr鉴定为阳性的菌液吸取5-10μl接种至5mllb(含抗性)培养基中，在220rpm，37℃摇床中过夜培养；8)取出过夜培养的菌液，对已经混浊的菌液进行质粒提取(天根质粒dna小提试剂盒)；9)提取后的质粒可直接用于alox12瞬转或构建慢病毒稳转细胞系。alox12干扰质粒构建：1)alox12靶向干扰序列为gcatcgagagaaggaactgaa，设计适合plko.1载体的寡聚核苷酸；阴性对照sirna序列为：caacaagatgaagagcaccaa；正向寡聚核苷酸:5’ccgggcatcgagagaaggaactgaactcgagttcagttccttctctcgatgctttttg3’；反向寡聚核苷酸:5’aattcaaaaagcatcgagagaaggaactgaactcgagttcagttccttctctcgatgc3’；2)将上述两条寡聚核苷酸分半加无菌水溶解，终浓度为100mm，进行融合；3)根据“alox12表达质粒构建”步骤进行酶切反应、酶切产物的回收、连接反应、转化、挑单克隆、测序和提取质粒；4)所得质粒可用于慢病毒介导的alox12敲低细胞系构建；慢病毒载体构建和包装：1)用胰酶消化并记数293t细胞，按1×106个293t/孔传至6孔板中；2)第二天细胞汇合度至80％时开始转染；3)取1.5ml灭菌ep管，加入2个包装质粒(pspax和pmd2g)和过表达或干扰质粒各1μg溶于100μl的无血清培养基。轻柔混匀，室温孵育5min。4)取1.5ml灭菌ep管，取3μlpei(1.6μg/μl)溶于100μl无血清培养基中。轻柔混匀，室温孵育5min。5)将dna溶液和pei溶液轻柔混匀，室温孵育15min；6)将上述dna-pei混合液，逐滴加入6孔板中；7)转染6h后，换新鲜培养基；8)转染后48-72h收获含病毒的上清，3000rpm离心10min，去除沉淀，并用0.45μm的滤膜过滤；9)过滤后的病毒可立即用于感染或-80℃贮存。细胞缺氧复氧(h/r)：1)细胞培养至对数期，预温pbs洗2次，弃去；2)将细胞分成正常对照组和h/r实验组，对照组换完全培养基，放37℃，5％co2培养，实验组换无糖无血清的dmem培养基，并放o2/co2细胞培养系统的培养箱内(37℃，5％co2，5％o2)缺氧培养，1h后，实验组换完全培养基复氧培养；3)复氧至预定的复氧培养时间后，弃去上清，用pbs洗2次，保存；ldh释放及细胞活性(cellviability)检测：使用ldh细胞毒性比色测试试剂盒(g1782,promega,madison,wi,usa)检测ldh的释放量。使用非放射性cck-8试剂盒(ck04；dojindo,kumamoto,japan)检测细胞活性。按照说明书进行相关检测。实施例4不同alox在缺血肝脏组织中表达变化c57小鼠随机分为2组，分别为sham组及手术组，取缺血1h后手术组小鼠以及sham组小鼠肝脏组织，westernblot及rt-rcr检测肝脏组织中alox12、alox5、alox15蛋白含量以及mrna含量。其中wb所用一抗为：12-loantibody(c-5)(sc-365194；santacruz),15-loantibody(b-7)(sc-133085；santacruz),5-lipoxygenase(c49g1)rabbitmab(#3289；cst)，二抗为：peroxidaseaffinipuregoatanti-rabbit-igg(h+l)(#111-035-003；jacksonlaboratory)和goatanti-mouse-igg(h+l)(#115-035-003；jacksonlaboratory)；rt-rcr所用引物序列如下：基因正向引物反向引物alox12tccctcaacctagtgcgtttggttgcagctccagtttcgcalox5aacgatcacccaccttctgctcgcagataagctgttcccgalox15gctgcccaatcctaatcagtcttccttatccaaggcagccag结果如图9a和9b所示，肝脏缺血1h后，肝脏组织中alox12基因mrna含量相对于sham组显著上升，约为sham组的2.6倍，而alox5及alox15的mrna含量相比于sham组则上升不明显(图9a)。与rt-pcr结果相似，wb分析三种不同alox蛋白表达量，结果显示alox12蛋白在缺血1h后表达量相比于sham组显著增加，而alox5及alox15蛋白表达量则增加不明显(图9b)。上述rt-pcr及wb结果一致地表明了，在肝脏缺血后，肝脏组织中不同alox表达量变化间存在差异，且alox12表达量增加最明显。表明相比于alox的其他主要成员，肝脏组织缺血再灌注损伤和alox12之间关联更明显。实施例5alox12过表达对h/r处理诱导的l02细胞损伤及炎症反应的影响l02细胞分为4组：gfp过表达对照组、alox12过表达对照组、gfp过表达h/r组、alox12过表达h/r组。对应质粒分别转染贴壁l02细胞(融合度约80％)，24h后进行h/r处理(缺氧6h，复氧6h)。质粒转染完成后提取细胞总蛋白，进行wb分析(3次独立重复实验，每次2个重复)，检测alox12的过表达情况。h/r处理完成后，检测培养基中ldh的释放量(每组6个重复)，以评价alox12过表达对h/r诱导的肝细胞损伤的影响；提取rna进行rt-pcr分析(2次独立重复实验，每次3个技术重复)，检测炎症相关细胞因子及趋化因子mrna含量变化，以评价alox12过表达对h/r诱导的肝细胞炎症反应的影响。以gfp过表达对照组ldh释放检测结果以及炎症相关因子mrna含量为1，计算其余各组相比于该组的比值。rt-rcr所用引物序列如下：alox12过表达wb检测结果如图10所示，相比于gfp组，alox12过表达组蛋白条带显著增强，即l02细胞中alox12过表达显著。ldh释放检测结果如图11所示，alox12过表达对照组ldh释放与gfp过表达对照组相比无显著差异，表明alox12的过表达对正常培养的l02细胞无影响。当进行h/r处理后，ldh的释放量显著增加，且alox12过表达组ldh的释放量的增加程度显著高于gfp组。这一结果表明，alox12过表达加重h/r处理引起的肝细胞损伤及肝细胞毒性。炎症因子及趋化因子mrna检测结果如图12所示，与ldh释放检测结果相同，alox12过表达对照组炎症因子il-6、tnf-α，趋化因子ccl2、cxcl10的mrna含量与gfp过表达对照组相比无显著差异，表明alox12的过表达对正常培养的l02细胞炎症反应无影响。当进行h/r处理后，各因子mrna含量显著增加，且alox12组的增加量显著大于gfp组。这一结果表明，alox12过表达加重h/r处理引起的肝细胞炎症反应。实施例6alox12敲低(shalox12)对h/r处理后h9c2细胞活性的影响h9c2细胞分为4组：shrna对照组、shalox12对照组、shrnah/r组、shalox12h/r组。对应的重组慢病毒病毒液分别感染培养的h9c2细胞，24h后进行h/r处理(缺氧1h，复氧6h)。质粒转染完成后提取细胞总蛋白，进行wb分析(3次独立重复实验)，检测alox12的敲低情况。h/r完成后检测细胞活性(每组6个重复)。以shrna对照组检测结果为1，计算其余各组相比于该组的比值。alox12敲低wb检测结果如图13所示，相比于shrna组，shalox12组蛋白条带显著减弱，即h9c2细胞中alox12表达被敲低。细胞活性检测结果如图14所示，shalox12对照组细胞活性相比于shrna对照组无显著差异。当对h/r的两组细胞进行h/r处理后，shrna组细胞活性相比于对照组显著降低。而当alox12的表达被敲低后，shalox12h/r组细胞活性的降低程度显著低于shrnah/r组。这一结果表明alox12表达的降低可显著缓解h/r诱导的心肌细胞损伤，维持心肌细胞的活性。即alox12可促进心肌细胞损伤相关疾病的发生发展。当前第1页12