本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种动物肺表面活性物质的提取方法。
背景技术：
肺表面活性物质(pulmonarysurfactant，ps)是由脂质和表面活性蛋白组成的混合物，具有独特的铺展功能和动态表面张力特性，主要由肺泡ⅱ型上皮细胞生成，分布于肺泡的内衬层中，其对维持肺的顺应性，保障正常呼吸功能，机体防御等有着非常重要的作用。大量的研究表明，肺表面活性物质的缺乏或功能异常可引起呼吸窘迫、肺炎、肺水肿等疾病，甚至致人死亡。在环境科学、医学、生物学等领域，科学研究需要实验室自行提取大量的ps以便于对细颗粒物、挥发性有机物和工业废气等外源物质进入肺部后与ps之间产生的界面化学反应进行长期研究；药物生产者提取大量的动物肺表面活性物质作为生产外源ps的原料，对上述疾病进行缓解和治疗。因此一种简单快捷、行之有效的动物肺表面活性物质提取方法成为研究重点。
现有的天然肺表面活性物质的提取方法主要有：密度梯度离心法、有机溶剂萃取法、超临界二氧化碳提取等。密度梯度离心法对灌洗液的处理效率缓慢，提取耗费时间长，设备成本和人力成本过高，产量不稳定，纯度低和含无效成分多等诸多问题。现有的有机溶剂萃取法大都使用复合有机溶剂进行萃取，常用的有机试剂有氯仿、甲醇、二氯甲烷和丙酮等，工序复杂，而且醇类与水混溶，大大增加了分液难度，同时会导致有机溶剂中的部分ps进入水层中，降低了产率；复合有机溶剂的使用不但会造成有机溶剂难去除易残留的问题，还会对反析产生不良影响。现有的超临界二氧化碳提取法则存在设备成本高，提取剂量少、提取成本昂贵，不利于工业化生产等问题。以全肺灌洗法为例，现有提取方法的重点都放在从灌洗液中分离ps，而忽略了灌洗步骤ps溶出率的问题，导致灌洗不充分，大量ps没有随灌洗液流出而残留在肺泡内，大大降低提取效率。
因此急需开发一种操作简单、提取周期短、生产效率高、提取物种类齐全且纯度较高的动物肺表面活性物质的提取方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种操作简单、提取周期短、生产效率高、活性成分种类齐全纯度高的动物肺表面活性物质的提取方法。
本发明的目的是这样实现的，包括灌洗、提取和纯化工序，具体为：
1)灌洗：取新鲜无病的动物肺，纯水冲去其表面血液及组织，将动物肺的支气管连接于导管，扎紧后一并放入超声仪，进行超声，并往肺内通入nacl溶液，直至肺部充满灌洗液，停止加液，轻拍动物肺10～30次，抽出灌洗液，重复以上操作2～20次，关闭超声，合并灌洗液；
2)提取：将步骤1)中的灌洗液过滤，除去肺灌洗液中的组织残渣和细胞碎片，然后将滤液高速离心，弃去上层清液，收集沉淀，即得粗品ps；
3)纯化：将步骤2)得到的粗品ps用氯仿溶解，静止分层，收集下层乳白色氯仿溶液，离心，得ps氯仿清液，将ps氯仿清液浓缩至有固体析出，然后把浓缩液转入盛有乙酸乙酯的容器中进行反析，密封，静止分层，抽滤，用乙酸乙酯冲洗滤饼，收集固体，干燥后即得纯品ps。
本发明的有益效果：
1、本发明操作简单，提取周期短，生产效率高，提取物的磷脂种类齐全、纯度高，只含有少量蛋白b和蛋白c，不仅能快速在气-液界面吸附扩散，达到显著改善肺的顺应性的目的，而且能够避免医用时由于蛋白含量及种类过多而引起的特异性排斥反应；本发明极大的降低了提取成本，设备简单，提取率是普通提取方法的一倍以上，提取的ps中磷脂成分齐全，具有较强的表面活性功能，能快速的将表面张力降到10mn/m以下，si和ri也达到了制剂要求的范围。
2、本发明具有原料廉价易得，提取周期短，提取产率高，环保效应好等优点，得到的提取物适用于治疗肺表面活性物质缺乏或功能异常引起的相关疾病，如呼吸窘迫、急性肺损伤、肺炎、肺水肿、胎粪吸入综合征以及肺移植术后的辅助治疗等，也可分离纯化作为辅料用于食品及化妆品等领域。
3、本发明灌洗时采用超声和辅助拍打的方法，加上多次重复灌洗，大大提高肺表面活性物质的溶出率，有效提高提取效率；采用一步高速离心，相对比传统梯度离心大大缩短了提取时间，含有杂质的粗品ps直接使用氯仿溶解，ps溶入氯仿，进行两次分离后浓缩，反析即可。
4、本发明的肺表面活性物质的有机萃取只采用氯仿，工序简单，有助于分液，避免了复合溶剂分液时部分ps进入水层，提高了萃取效率，溶剂易除残留少，同时有助于反析，还避免了使用复合溶剂难以回收利用和气氛不良、污染环境等问题。
5、本发明使用安全低毒的乙酸乙酯作为肺表面活性物质的反析溶剂，有效提高ps的安全性，避免使用高毒性的丙酮等，扩大了产品的应用范围，使提取的ps能很好的在医药和化妆领域应用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述的动物肺表面活性物质的提取方法，包括灌洗、提取和纯化工序，具体为：
1)灌洗：取新鲜无病的动物肺，纯水冲去其表面血液及组织，将动物肺的支气管连接于导管，扎紧后一并放入超声仪，进行超声，并往肺内通入nacl溶液，直至肺部充满灌洗液，停止加液，轻拍动物肺10～30次，抽出灌洗液，重复以上操作2～5次，关闭超声，合并灌洗液；
2)提取：将步骤1)中的灌洗液过滤，除去肺灌洗液中的组织残渣和细胞碎片，然后将滤液离心，弃去上层清液，收集沉淀，即得粗品ps；
3)纯化：将步骤2)得到的粗品ps用氯仿溶解，静止分层，收集下层乳白色氯仿溶液，离心，得ps氯仿清液，将ps氯仿清液浓缩至有固体析出，然后把浓缩液转入盛有乙酸乙酯的容器中进行反析，密封，静止分层，抽滤，用乙酸乙酯冲洗滤饼，收集固体，干燥后即得纯品ps。
步骤1)中所述的动物肺为哺乳动物肺。
所述的哺乳动物肺为猪肺、牛肺、兔肺、羊肺、鼠肺、狗肺中的任一种。
步骤1)中所述的超声的频率为50～100kmz。
步骤1)中所述的nacl溶液为浓度为0.5～1％，温度为0～15℃的nacl溶液。
步骤2)中所述的过滤为使用4～32层医用纱布或80～200目滤网进行过滤。
步骤2)中所述的离心为在0～4℃下进行转速为8000～15000r/min，时间为5～15min的离心。
步骤3)中所述的粗品ps用氯仿溶解后加入4～20℃盐水。
步骤3)中所述的离心为在0～4℃下进行转速为6000～10000r/min，时间10～45min的离心。
步骤3)中所述的浓缩为在30～40℃下进行浓缩，浓缩方法为减压蒸馏或氮吹。
步骤3)中所述的反析用乙酸乙酯的温度为-20～35℃。
步骤3)中所述的干燥为抽干、氮吹、真空干燥、冷冻干燥中的任一种。
实施例1
1)灌洗：取新鲜无病的动物肺，所述的动物肺为猪肺，纯水冲去其表面血液及组织，将动物肺的支气管连接于导管，扎紧后一并放入超声仪，进行频率为50kmz超声，并往肺内通入质量浓度0.5％，温度0℃的nacl溶液，直至肺部充满灌洗液，停止加液，轻拍动物肺10次，抽出灌洗液，重复以上操作2次，关闭超声，合并灌洗液；
2)提取：将步骤1)中的灌洗液过滤，所述的过滤为使用4层医用纱布进行过滤，除去肺灌洗液中的组织残渣和细胞碎片，然后将滤液离心，所述的离心为在0℃下进行转速为8000r/min，时间为5min的离心，弃去上层清液，收集沉淀，即得粗品ps；
3)纯化：将步骤2)得到的粗品ps用氯仿溶解，静止分层，收集下层乳白色氯仿溶液，离心，所述的离心为在0℃下进行转速为6000r/min，时间10min的离心，得ps氯仿清液，将ps氯仿清液浓缩至有固体析出，所述的浓缩为在30℃下进行浓缩，浓缩方法为减压蒸馏，然后把浓缩液转入盛有-20℃乙酸乙酯的容器中进行反析，密封，静止分层，抽滤，用-20℃的乙酸乙酯冲洗滤饼，收集固体，抽干干燥(抽滤后不取下来，继续抽气，直到滤饼干燥)后即得纯品ps。
实施例1所得的纯品ps提取周期短，短短数小时内即可获取产品，而且可以处理步骤2或者步骤3的同时再次开始步骤1的操作；生产效率高，提取率是传统方便的2倍以上，提取的ps活性组分种类齐全、纯度高。
实施例2
1)灌洗：取新鲜无病的动物肺，所述的动物肺为牛肺，纯水冲去其表面血液及组织，将动物肺的支气管连接于导管，扎紧后一并放入超声仪，进行频率为100kmz超声，并往肺内通入质量浓度1％，温度15℃的nacl溶液，直至肺部充满灌洗液，停止加液，轻拍动物肺30次，抽出灌洗液，重复以上操作5次，关闭超声，合并灌洗液；
2)提取：将步骤1)中的灌洗液过滤，所述的过滤为使用32层医用纱布进行过滤，除去肺灌洗液中的组织残渣和细胞碎片，然后将滤液离心，所述的离心为在4℃下进行转速为10000r/min，时间为15min的离心，弃去上层清液，收集沉淀，即得粗品ps；
3)纯化：将步骤2)得到的粗品ps用氯仿溶解，静止分层，收集下层乳白色氯仿溶液，离心，所述的离心为在4℃下进行转速为10000r/min，时间45min的离心，得ps氯仿清液，将ps氯仿清液浓缩至有固体析出，所述的浓缩为在40℃下进行浓缩，浓缩方法为氮吹，然后把浓缩液转入盛有35℃乙酸乙酯的容器中进行反析，密封，静止分层，抽滤，用35℃的乙酸乙酯冲洗滤饼，收集固体，氮吹干燥后即得纯品ps。
实施例2所得的纯品ps提取周期短，短短数小时内即可获取产品，而且可以处理步骤2或者步骤3的同时再次开始步骤1的操作；生产效率高，提取率是传统方便的2倍以上，提取的ps活性组分种类齐全、纯度高。
实施例3
1)灌洗：取新鲜无病的动物肺，所述的动物肺为兔肺，纯水冲去其表面血液及组织，将动物肺的支气管连接于导管，扎紧后一并放入超声仪，进行频率为60kmz超声，并往肺内通入质量浓度0.85％，温度2℃的nacl溶液，直至肺部充满灌洗液，停止加液，轻拍动物肺15次，抽出灌洗液，重复以上操作3次，关闭超声，合并灌洗液；
2)提取：将步骤1)中的灌洗液过滤，所述的过滤为使用16层医用纱布，除去肺灌洗液中的组织残渣和细胞碎片，然后将滤液离心，所述的离心为在1℃下进行转速为9000r/min，时间为8min的离心，弃去上层清液，收集沉淀，即得粗品ps；
3)纯化：将步骤2)得到的粗品ps用氯仿溶解，静止分层，收集下层乳白色氯仿溶液，离心，所述的离心为在1℃下进行转速为7000r/min，时间20min的离心，得ps氯仿清液，将ps氯仿清液浓缩至有固体析出，所述的浓缩为在32℃下进行浓缩，浓缩方法为氮吹，然后把浓缩液转入盛有-10℃乙酸乙酯的容器中进行反析，密封，静止分层，抽滤，用-10℃乙酸乙酯冲洗滤饼，收集固体，真空干燥后即得纯品ps。
实施例3所得的纯品ps提取周期短，短短数小时内即可获取产品，而且可以处理步骤2或者步骤3的同时再次开始步骤1的操作；生产效率高，提取率是传统方便的2倍以上，提取的ps活性组分种类齐全、纯度高。
实施例4
1)灌洗：取新鲜无病的动物肺，所述的动物肺为羊肺，纯水冲去其表面血液及组织，将动物肺的支气管连接于导管，扎紧后一并放入超声仪，进行频率为70kmz超声，并往肺内通入质量浓度0.9％，温度5℃的nacl溶液，直至肺部充满灌洗液，停止加液，轻拍动物肺20次，抽出灌洗液，重复以上操作4次，关闭超声，合并灌洗液；
2)提取：将步骤1)中的灌洗液过滤，所述的过滤为使用26层医用纱布，除去肺灌洗液中的组织残渣和细胞碎片，然后将滤液离心，所述的离心为在2℃下进行转速为8500r/min，时间为10min的离心，弃去上层清液，收集沉淀，即得粗品ps；
3)纯化：将步骤2)得到的粗品ps用氯仿溶解，静止分层，收集下层乳白色氯仿溶液，离心，所述的离心为在2℃下进行转速为8000r/min，时间30min的离心，得ps氯仿清液，将ps氯仿清液浓缩至有固体析出，所述的浓缩为在35℃下进行浓缩，浓缩方法为减压蒸馏，然后把浓缩液转入盛有0℃乙酸乙酯的容器中进行反析，密封，静止分层，抽滤，用0℃乙酸乙酯冲洗滤饼，收集固体，冷冻干燥后即得纯品ps。
实施例4所得的纯品ps提取周期短，短短数小时内即可获取产品，而且可以处理步骤2或者步骤3的同时再次开始步骤1的操作；生产效率高，提取率是传统方便的2倍以上，提取的ps活性组分种类齐全、纯度高。
实施例5
1)灌洗：取新鲜无病的动物肺，所述的动物肺为鼠肺，纯水冲去其表面血液及组织，将动物肺的支气管连接于导管，扎紧后一并放入超声仪，进行频率为80kmz超声，并往肺内通入质量浓度0.7％，温度8℃的nacl溶液，直至肺部充满灌洗液，停止加液，轻拍动物肺25次，抽出灌洗液，重复以上操作5次，关闭超声，合并灌洗液；
2)提取：将步骤1)中的灌洗液过滤，所述的过滤为使用80目滤网进行过滤，除去肺灌洗液中的组织残渣和细胞碎片，然后将滤液离心，所述的离心为在0℃下进行转速为9500r/min，时间为12min的离心，弃去上层清液，收集沉淀，即得粗品ps；
3)纯化：将步骤2)得到的粗品ps用氯仿溶解，静止分层，收集下层乳白色氯仿溶液，离心，所述的离心为在4℃下进行转速为9000r/min，时间35min的离心，得ps氯仿清液，将ps氯仿清液浓缩至有固体析出，所述的浓缩为在36℃下进行浓缩，浓缩方法为减压蒸馏或氮吹，然后把浓缩液转入盛有15℃乙酸乙酯的容器中进行反析，密封，静止分层，抽滤，用15℃乙酸乙酯冲洗滤饼，收集固体，干燥后即得纯品ps。
实施例5所得的纯品ps提取周期短，短短数小时内即可获取产品，而且可以处理步骤2或者步骤3的同时再次开始步骤1的操作；生产效率高，提取率是传统方便的2倍以上，提取的ps活性组分种类齐全、纯度高。
实施例6
1)灌洗：取新鲜无病的动物肺，所述的动物肺为狗肺，纯水冲去其表面血液及组织，将动物肺的支气管连接于导管，扎紧后一并放入超声仪，进行频率为90kmz超声，并往肺内通入质量浓度0.95％，温度12℃的nacl溶液，直至肺部充满灌洗液，停止加液，轻拍动物肺18次，抽出灌洗液，重复以上操作3次，关闭超声，合并灌洗液；
2)提取：将步骤1)中的灌洗液过滤，所述的过滤为使用200目滤网进行过滤，除去肺灌洗液中的组织残渣和细胞碎片，然后将滤液离心，所述的离心为在4℃下进行转速为8000r/min，时间为14min的离心，弃去上层清液，收集沉淀，即得粗品ps；
3)纯化：将步骤2)得到的粗品ps用氯仿溶解，静止分层，收集下层乳白色氯仿溶液，离心，所述的离心为在0℃下进行转速为8500r/min，时间40min的离心，得ps氯仿清液，将ps氯仿清液浓缩至有固体析出，所述的浓缩为在38℃下进行浓缩，然后把浓缩液转入盛有25℃乙酸乙酯的容器中进行反析，密封，静止分层，抽滤，用25℃乙酸乙酯冲洗滤饼，收集固体，干燥后即得纯品ps。
实施例6所得的纯品ps提取周期短，短短数小时内即可获取产品，而且可以处理步骤2或者步骤3的同时再次开始步骤1的操作；生产效率高，提取率是传统方便的2倍以上，提取的ps活性组分种类齐全、纯度高。
实施例7
1)灌洗：取新鲜无病的动物肺，所述的动物肺为猪肺，纯水冲去其表面血液及组织，将动物肺的支气管连接于导管，扎紧后一并放入超声仪，进行频率为100kmz超声，并往肺内通入质量浓度1％，温度9℃的nacl溶液，直至肺部充满灌洗液，停止加液，轻拍动物肺30次，抽出灌洗液，重复以上操作2次，关闭超声，合并灌洗液；
2)提取：将步骤1)中的灌洗液过滤，所述的过滤为使用100目滤网进行过滤，除去肺灌洗液中的组织残渣和细胞碎片，然后将滤液离心，所述的离心为在0℃下进行转速为10000r/min，时间为6min的离心，弃去上层清液，收集沉淀，即得粗品ps；
3)纯化：将步骤2)得到的粗品ps用氯仿溶解，静止分层，收集下层乳白色氯仿溶液，离心，所述的离心为在2℃下进行转速为6000r/min，时间45min的离心，得ps氯仿清液，将ps氯仿清液浓缩至有固体析出，所述的浓缩为在30～40℃下进行浓缩，然后把浓缩液转入盛有20℃乙酸乙酯的容器中进行反析，密封，静止分层，抽滤，用20℃乙酸乙酯冲洗滤饼，收集固体，干燥后即得纯品ps。
实施例7所得的纯品ps提取周期短，短短数小时内即可获取产品，而且可以处理步骤2或者步骤3的同时再次开始步骤1的操作；生产效率高，提取率是传统方便的2倍以上，提取的ps活性组分种类齐全、纯度高。