一种磁性‑ROS双重智能靶向纳米粒及其制备方法与流程

本发明涉及烧伤基础研究和医药技术领域，具体地说，是一种磁性-ros双重智能靶向纳米粒及其制备方法。

背景技术：

近年来，随着纳米技术的发展，功能性纳米材料在生物工程和医学领域受到大家越来越广泛的关注。将基因药物或者蛋白质多肽类药物包裹在可生物降解的纳米微球材料中给药，不仅可以显著减少药物在体内的降解，还可通过控制纳米粒的粒径，给纳米粒连接抗体、配体、酶使其具有主动靶向和被动的靶向功能。

ros作为机体病理性存在的致病因子，主要包括羟自由基、过氧化氢、亚硝酸阴离子和超氧阴离子，在外伤、炎症、缺血、肿瘤等疾病部位ros浓度明显升高，是纳米粒携带药物靶向释放的重要靶点。2010年wilson等在naturematerials中介绍了利用硫醇缩酮聚合物ppadt为材料制备ros敏感纳米粒的方法(wilsonds,dalmassog,wangl,sitaramansv,merlind,murthyn.orallydeliveredthioketalnanoparticlesloadedwithtnf-αsirnatargetinflammationandinhibitgeneexpressionintheintestines.naturematerials.2010；9:923-8.)。磁敏感载药系统(magnetictargeteddrugdeliverysystem,mtdds)是指在外加磁场的作用下，药物被靶向释放到病变部位的载药系统。其中，磁性fe4o3作为磁核，具有灵敏的磁靶向性、高安全性、无免疫原性等特点，合成技术成熟，可随新陈代谢排除体外，是mtdds中最接近产业化、最具有发展前景的材料之一(moux,aliz,lis,hen.applicationsofmagneticnanoparticlesintargeteddrugdeliverysystem.jnanoscinanotechnol.2015jan；15(1):54-62.)。当fe4o3纳米粒子磁核粒径小于20nm时，磁性纳米粒即具有超顺磁性，当纳米粒处在磁场中时具有强磁性，磁场去除磁性随即消失，不会引起聚集堵塞血管等副作用。

2015年，第二军医大学王光毅等报道了一种单纯ros靶向的智能纳米粒(参见中国发明专利申请“一种对活性氧敏感的能促创面血管化的纳米粒及其制备方法”，公开号为cn104587449a)。该发明一定程度上使纳米粒实现了智能化，可以携带药物到目标创面。但该种纳米粒还存在不足：ros单靶向敏感纳米粒携带药物在体内存在“假阳性释放”现象，即ros敏感的纳米粒不仅会靶向到高ros的损伤组织，还会靶向到肝脏等高ros区域。2016年，王秀瑜报道了fe3o4磁性纳米粒子在制备抗衰老剂中的应用(参见中国发明专利申请“fe3o4磁性纳米粒子在制备抗衰老剂中的应用”，公开号为cn106176809a)。其所述的fe3o4磁性纳米粒子主要在外部覆盖可食用营养物质，以后通过将fe3o4磁性纳米粒子作为治疗药物经口给药到体内，起到抗衰老的作用。但本发明中fe3o4磁性纳米粒子是构建载药智能纳米粒的一个组成成分，主要作用是使纳米粒具有磁响应性，fe3o4纳米粒子本身并不起到治疗作用。

到目前为止，尚未有一种磁性-ros双重智能靶向纳米粒，可以安全、靶向、高效的将药物运载到体内目标区域，利于药物通过生物屏障并减少药物在体内的降解。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种结构相对简单、性能稳定、包裹性能好的磁性-ros双重敏感靶向纳米载药系统，具体为以硫醇缩酮聚合物(ppadt)为基本结构材料，包裹fe3o4超顺磁性纳米粒子，并介绍其制备方法。

本发明的第一方面，提供一种磁性-ros双重智能靶向纳米粒，是以硫醇缩酮聚合物(ppadt)为载药纳米材料，包裹fe3o4超顺磁性纳米磁核。

本发明所述的载药纳米材料为硫醇缩酮聚合物(ppadt)，该硫醇缩酮聚合物具有对ros敏感的特性，其化学结构式如式i所示：

本发明所述的fe3o4超顺磁性纳米粒子，其合成是以化学方程式2fe³⁺+fe²⁺+8oh^-→fe3o4+4h2o为依据。

优选的，所述fe3o4纳米磁核采用共沉淀法制备。

优选的，所述fe3o4纳米磁核直径小于20nm，具有超顺磁性。

优选的，所述的磁性-ros双重智能靶向纳米粒的粒径范围为70nm～130nm。

本发明的第二方面，提供一种上述的磁性-ros双重智能靶向纳米粒的制备方法，所述的制备方法为复乳溶媒蒸发/萃取法。

所述的制备方法包括以下步骤：

a、硫醇缩酮聚合物ppadt的合成；

b、超顺磁性fe3o4纳米粒子的构建：将新鲜溶液fecl2与fecl3按1:2的摩尔比投放，并向混合液中加入nh4oh液体和表面活性剂(油酸或柠檬酸)，摩尔比分别为fecl2：fecl3：nh4oh：表面活性剂＝1:2:8:0.6。反应过程中持续向反应液体中通入氮气，充分机械搅拌至液体反应变色为黑亮，超声分散，去离子水洗涤，所得纳米粒子直径小于20nm，即为共沉淀法获得的超顺磁性fe3o4纳米粒子；

c、ppadt-fe3o4纳米粒的构建：采用复乳溶媒蒸发/萃取法，将10mgppadt溶于1ml二氯甲烷作为油相，2mgfe3o4纳米粒子溶解于100ulpbs溶液作为内水相，二者充分混合后进行超声乳化形成初乳液，再与1ml外水相1％胆酸盐溶液超声乳化，形成w/o/w复乳悬液；将w/o/w复乳悬液置于35ml0.5％胆酸盐溶液中充分混合，彻底挥发有机溶剂后低温干燥得到ppadt-fe3o4纳米粒。

所述的步骤a中，硫醇缩酮聚合物ppadt的合成方法：利用甲苯磺酸催化1,4-二甲硫醇苯酚与2,2-二甲氧基丙烷反应合成的硫醇缩酮聚合物(ppadt)，其反应式如下；

具体为：将苯酚、1,4-二甲硫醇苯酚、2,2-二甲氧基丙烷搅拌并加热至95℃，加入甲苯磺酸的甲醇溶液催化反应，107℃反应24h，得硫醇缩酮化合物ppadt，冻干保存。ppadt分子结构中的硫醇缩酮基团对氧自由基浓度敏感，仅在氧自由基浓度较高的环境中降解，具有ros敏感特性。具体如下：

本发明的第三方面，提供一种上述的磁性-ros双重智能靶向纳米粒在制备药物载体中的应用。

本发明所得的磁性-ros双重靶向载药纳米粒通过静脉注射，在体外磁场和体内高ros的双重作用下靶向作用到体内目标区域。

本发明优点在于：

本发明的产品的双重靶向效果好，药物包封率和稳定性较好，生物毒性低。

附图说明

图1为该磁性-ros双重智能靶向纳米粒构建及原理简图。

图2为该磁性-ros双重智能靶向纳米粒的电镜检测图。

图3为该磁性-ros双重智能靶向纳米粒粒径分析图。

图4为该磁性-ros双重智能靶向纳米粒的核磁谱，证实合成产物的分子结构与预期相同。

图5为注射后12h用小动物活体成像仪观察携带cy5荧光的磁性-ros双重智能靶向纳米粒在体分布情况。

图6为该磁性-ros双重智能靶向纳米粒体外安全性检测。

图7为该磁性-ros双重智能靶向纳米粒体内安全性检测。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1.磁性-ros双重智能靶向纳米粒的构建

将苯酚、1,4-二甲硫醇苯酚、2,2-二甲氧基丙烷搅拌并加热至95℃，加入甲苯磺酸的甲醇溶液催化反应，107℃反应24h，得硫醇缩酮化合物ppadt，冻干保存。

将新鲜溶液fecl2与fecl3按比例投放，并向混合液中加入nh4oh液体和表面活性剂(油酸、柠檬酸)，反应过程中持续向反应液体中通入氮气，充分机械搅拌至液体反应变色为黑亮，超声分散，去离子水洗涤，所得纳米粒子直径小于20nm，即为共沉淀法获得的超顺磁性纳米流体。

采用复乳溶媒蒸发/萃取法构建磁性-ros双靶向纳米粒，具体为：将ppadt溶于二氯甲烷作为油相，fe3o4纳米粒子溶解于溶液pbs作为内水相，二者充分混合后进行超声乳化形成初乳液，再与外水相1％胆酸盐溶液超声乳化，形成w/o/w复乳悬液。将w/o/w复乳悬液置于35ml0.5％胆酸盐溶液中充分混合，彻底挥发有机溶剂后低温干燥得到ppadt-fe3o4纳米粒。

本发明的磁性-ros双重智能靶向纳米粒构建及原理简图见图1。

实施例2.磁性-ros双重智能靶向纳米粒表征性状的鉴定

利用扫描电子显微镜(sem)和高分辨透射电子显微镜(hrtem)检测fe3o4磁性纳米粒子的分散程度、几何形状和粒径等微观表征，利用超导量子干涉仪检测fe3o4纳米粒的居里温度、磁滞回线、磁性强度等磁学性质，x线光电子光谱表征分析其化学结构，激光粒度仪测定材料的粒度分布和zeta电位，利用超导量子干涉仪检测该纳米粒磁性的强弱及其是否具有超顺磁性特性。结果如图2和图3所示所合成的磁性-ros双重智能靶向纳米粒直径在100nm左右，图4所示核磁谱证实合成产物的分子结构与预期相同。

实施例3.磁性-ros双重智能靶向纳米粒体内示踪

以荧光染料cy5标记携带sdf-1的双重敏感纳米粒。裸鼠10只，随机分为2组，每组5只，两组大鼠均持续电击2s。12h后分别尾静脉注射：a组，10mgsdf-1蛋白+cy5；b组，10mg携带sdf-1的双重敏感纳米粒+cy5。注射后12h用小动物活体成像仪(ivislaminqii，caliperlifesciences，usa)在649nm激发波长下，观察动物体内cy5荧光的分布情况。结果如图5，双重智能纳米粒注射组荧光集中在创面处，证明该纳米粒的智能靶向性很理想。

实施例4.磁性-ros双重智能靶向纳米粒安全性评估

体外药物毒性实验：将raw264.7细胞培养于96孔板中，加入dmem培养基和10％胎牛血清(fbs)，置于37℃、5％co2培养箱中培养。每孔加入不同浓度纳米粒和10ulcck8溶液+90ul(dmem+10％fbs)，12、24、48h显微镜下观察细胞贴壁和存活情况，并利用酶标仪测定在450nm处混合培养基的吸光度，计算细胞活力。结果如图6所示，证明不同浓度的纳米粒对raw264.7细胞增殖能力没有明显影响(p＞0.05)，证明该纳米粒对于体外细胞生长和增殖无显著毒性。

体内药物毒性实验：将雄性大鼠随机分为四组，尾静脉分别注射1mg/kg、10mg/kg、100mg/kg纳米粒溶液和0.9％生理盐水，12、24、48h分别通过眼眶静脉丛取血，检测血清肝酶变化，并计算大鼠生存率。结果如图7所示，不同浓度的纳米粒注射到大鼠体内，与生理盐水注射组相比，ck酶、alt酶和ast酶在各个组间没有统计学差异(p＞0.05)，证明该纳米粒体内注射给大鼠并无明显毒性。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。