白芨提取物的应用的制作方法

本发明涉及日化及植物提取物领域，具体涉及白芨提取物的应用。

背景技术：

皮肤被覆盖于整个人体表面，与外界环境直接接触，除了保护机体免受外界各种因素的伤害外，又是反应全身健康状态的一面镜子。皮肤由表皮、真皮、皮下组织构成，并含有皮肤附属器、丰富的神经、血管、淋巴管及肌肉。在真皮和表皮的连接区域又称为基底膜带，不仅是一层结构模型，而且具有多方面的功能，基底膜是上皮细胞的支撑垫，在上皮细胞组织与结缔组织之间起结构连接作用，同时，还具有其他方面的作用。比如，基底膜作为细胞的选择性通过屏障，通常可以阻止结缔组织细胞与基底膜上的上皮细胞接触，但允许淋巴细胞、巨噬细胞和神经元突触穿越通过；此外，细胞的形态、细胞的极性、细胞代谢、质膜上蛋白质的分布、细胞存活、细胞的增殖分化、细胞迁移等许多生命现象，均与基底膜有着非常密切的关系。

硫酸乙酰肝素糖蛋白hspg2(heparansulfateproteoglycan)基因编码基底膜聚糖蛋白(perlecan)，其是基底膜的一个主要组分，由三个长链的糖胺聚糖连接的核心蛋白组成。perlecan蛋白是一个多结构域的蛋白聚糖，其结合并交联许多细胞外基质组分和细胞表面分子。现有研究已经表明，该蛋白质与层粘连蛋白，脱脂蛋白，iv型胶原等相互作用，在多种生物活性中起重要作用。perlecan还可以促进生长因子活性，从而刺激内皮生长和再生成。hspg2基因表达上调能够促进perlecan蛋白的表达，进而促进基底膜结构的稳固性，强化真表皮的紧密连接。

肝素结合表皮生长因子hbegf(heparinbindingegflikegrowthfactor)是结合并激活egf受体生长因子的egf家族的成员。hbegf在病理生理过程中起关键作用，包括癌症。在人体皮肤的部分厚度损伤后，会产生表皮生长因子，促进细胞增殖，对皮肤伤口愈合有益。集落刺激因子csf2(colonystimulatingfactor2)基因编码的蛋白质是控制粒细胞和巨噬细胞的产生、分化和功能的细胞因子，在皮肤中可以促进干细胞的分化和增殖。

表皮生长因子受体egfr(epidermalgrowthfactorreceptor)基因编码的蛋白质是跨膜糖蛋白，是蛋白激酶超家族的成员，该蛋白质是表皮生长因子家族成员的受体，蛋白质与配体的结合诱导细胞增殖。因此，以上基因的表达上调均有助于细胞增殖，进而达到延缓皮肤衰老的功效。

因此，研究如何提高皮肤关键部位及功能相关的基因的表达，对于提高皮肤真表皮结构的稳定性，延缓皮肤衰老具有重要意义。

白芨为兰科白芨属多年生草本植物(学名bletillastriata(thunb.)rchb.f.)，又称白及，别名连及草、紫兰等，具有较高的观赏和药用价值。植株高18-60厘米。假鳞茎扁球形，上面具荸荠似的环带，富粘性。茎粗壮，劲直。叶4-6枚，狭长圆形或披针形，长8-29厘米，宽1.5-4厘米，先端渐尖，基部收狭成鞘并抱茎。花序具3-10朵花，常不分枝或极罕分枝；花序轴或多或少呈“之”字状曲折；花苞片长圆状披针形，长2-2.5厘米，开花时常凋落；花大，紫红色或粉红色；花期4-5月。产陕西南部、甘肃东南部、江苏、安徽、浙江、江西、福建、湖北、湖南、广东、广西、四川和贵州。生于海拔100-3200米的常绿阔叶林下，栋树林或针叶林下、路边草丛或岩石缝中，朝鲜半岛和日本也有分布。

白芨药用历史悠久，是我国民间的传统中药。为《中国药典》(1995、2005年版)所收载，性温、味苦、甘、辛，具有补肺、止血、散风除湿、通窍止痛、消肿排脓、生肌、敛疮的功能，主要用于治疗感冒头痛、肺伤咳血、衄血、金疮出血、痈疽肿毒、溃疡疼痛、汤火灼伤、手足皱裂等。其药用部位主要为地下块茎，呈不规则菱形，黄白色，肉质肥厚，常数个相连，含有丰富的白芨胶质，主要成分为白芨多糖，文献记载为葡萄甘露聚糖，另外还含有联苄类、二氢菲类、菲类、黄酮类、多酚类等成分。

白芨提取物可作为保湿、抗干燥的活性成分用于化妆品，或者作为复方的成分，用于美白保湿功能的化妆品。但目前并没有白芨提取物具有提高基底膜相关基因和抗衰老相关基因表达的能力，稳固皮肤结构，适用于具有延缓衰老功效的化妆品的报道。

技术实现要素：

本发明旨在提供白芨提取物在制备提高具有延缓衰老功效皮肤外用剂方面的应用。

白芨提取物能够稳固皮肤结构，稳定真表皮连接，具有抗衰老的效果。因此，白芨提取物用于制备皮肤外用剂，可作为抗衰老、稳固皮肤结构或稳定真表皮连接的活性成分。

白芨提取物具有提高基底膜相关基因和抗衰老相关基因表达的能力。

优选的，所述抗衰老功效相关基因为hbegf、csf2及egfr基因。

优选的，所述基底膜稳定相关基因为hspg2基因。

上述的白芨提取物为白芨的水提取物、有机溶剂提取物、水与有机溶剂混合液的提取物，或者上述的任意混合物。

白芨提取物的制备方法包括煎煮、超声提取、浸提、回流、渗漉或者上述方法的组合。

优选的，白芨提取物可用水为溶剂进行提取，或者进行水提醇沉法提取；其中水提取的方法包括煎煮、超声提取、浸提、回流或渗漉。或者，先用有机溶剂浸取或煎煮去除色素等杂质，再用水进行提取或者水提醇沉提取。

或者，白芨提取物可以用水和多元醇的混合液为溶剂，通过煎煮、超声提取、浸提、回流或渗漉的方法进行提取。

本发明发现，白芨提取物具有稳固真表皮连接能力和延缓衰老的能力，可作为功效添加剂加入化妆品中使用。在含量为100μg/ml(约0.01wt％，以干物质计)时，可以有效提高抗衰老功效相关基因hbegf、csf2及egfr、基底膜稳定相关基因hspg2的表达。白芨提取物在皮肤外用剂中的含量为0.001wt％～10wt％，优选为0.008wt％～5wt％。所述的皮肤外用剂，例如化妆品，类型包括洁面霜、乳液、霜膏、精华液、化妆水(如柔肤水、爽肤水)、面膜、卸妆水等。

本发明提供了白芨提取物作为皮肤外用剂(化妆品、护肤品等)功效添加剂的新用途，可作为活性成分，用于制备具有稳定皮肤基底膜结构、稳定真表皮连接或抗衰老作用的皮肤外用剂。

附图说明

图1为白芨提取物促进基底膜稳定相关基因hspg2的表达

图2为白芨提取物促进抗衰老功效相关基因hbegf的表达

图3为白芨提取物促进抗衰老功效相关基因csf2的表达

图4为白芨提取物促进抗衰老功效相关基因egfr的表达

具体实施方式

实施例1白芨提取物的生产(1)

(1)取白芨药材，干燥至含水量低于5％，粉碎后取100g加入1.5l去离子水煎煮0.5～1h；离心过滤，收集滤液；

(2)滤渣中加入1.5l去离子水再次煎煮0.5h，合并滤液；

(3)浓缩后冷冻干燥或喷雾干燥。

实施例2白芨提取物的生产(2)

(1)取白芨药材，干燥至含水量低于5％，粉碎后取100g，先用0.5l70％乙醇浸泡12h或者煎煮5min，取滤渣；或者用1l丙酮浸泡12h，取滤渣去除丙酮；

(2)按照实施例1的方法用加入去离子水煎煮两次，合并滤液；

(3)浓缩后冷冻干燥或喷雾干燥。

实施例4白芨提取物的生产(4)

实施例1或2的步骤(2)中，合并滤液后，浓缩至500ml，加入1.5～2l乙醇，静置6～24h；过滤取沉淀并干燥。

实施例5白芨提取物的生产(5)

取白芨药材，干燥至含水量低于5％，粉碎后取100g加入1l去离子水超声提取30min；过滤，取滤液浓缩干燥，或者滤液浓缩后加入3～4倍体积乙醇，静置醇沉6～24h，取沉淀并干燥。

实施例6白芨提取物的生产(6)

取白芨药材，干燥至含水量低于5％，粉碎后取100g加入15％甘油，超声提取30min，过滤，取滤液浓缩干燥。

实施例7白芨提取物促进基底膜稳定相关基因hspg2的表达

(一)皮肤模型的制备

从皮肤组织中分别提取人原代成纤维细胞(nhdf)及人原代角质细胞(nhek)。将人原代成纤维细胞复苏，培养消化后与胶原混合进行真皮阶段培养3～4天，然后将使用饲养层培养的人原代角质细胞，消化接种到真皮阶段的皮肤模型表面，依次经过表皮浸没培养及气液相培养阶段，培养至18天得到可用于检测的3d皮肤模型。

培养过程中，培养过程中，从在支架上接种成纤维细胞后的d3到最终d18，分别用普通培养基(对照组，nt)或者含有100μg/ml实施例1白芨提取物(以白芨提取物的干重计)的培养基对皮肤模型进行培养。白芨提取物由实施例1的方法制成。

(二)rna的提取

剪取组织约2*3mm，放入2mlep管中；加入1mltrizol，加入2颗钢珠，用组织破碎仪匀浆，50hz，5min；9000rpm，4℃1min，将上清液转移到新的1.5mlep管中；加入200ul氯仿，轻轻颠倒数次混匀，室温放置5分钟；9000rpm，4℃15min；转上层水相(约400ul)于新1.5mlep管中，加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置10min；9000rpm10min4℃；弃上清，沉淀用预冷的70％无水乙醇洗1次，8000rpm5min4℃；弃上清，空气干燥5-10分钟，溶于30uldepc水中；分光光度计测定rna浓度。

(三)基因表达分析

根据quantigener2.0plexassay试剂盒进行rna的纯化和基因定量分析，使用luminex平台对基因表达进行分析。

结果如图1所示。由图1可知,与对照组(nt)相比，添加白芨水提取物后,在皮肤模型中与基底膜稳定相关的hspg2基因表达上调1.68倍,说明该提取物能够提高基底膜稳定相关基因的表达，有促进基底膜结构稳定的作用。

用实施例2-6的产物代替实施例1白芨提取物，或者将取实施例1～5产物等量混合后的混合物代替实施例1的提取物，添加到培养基中，浓度为100μg/ml(约0.01wt％)时，hspg2基因表达上调1.6～1.75倍。

在测定基因表达的试验中，如果相对于未添加提取物的实验组，基因的表达量明显升高，可推断白芨提取物可以诱导基底膜稳定相关的及抗衰老相关的基因表达，提高皮肤的结构的稳定和延缓衰老的功效。

实施例8抗衰老相关的基因表达

3d细胞模型培养方法、rna组织提取方法以及基因表达分析方法同实施例6。检测对照组及添加白芨提取物的皮肤模型中，hbegf基因、csf2基因和egfr基因表达的变化，从而分析白芨提取物对上述基因表达结果的影响。

结果分别如图2、3、4所示，与对照组(nt)相比，添加白芨水提取物后，与抗衰老功效相关的基因如hbegf、csf2及egfr的表达均上调，说明白芨水提取物提高抗衰老相关基因的表达，具有抗衰老的功效。

用实施例2-6的产物代替实施例1白芨提取物，或者取实施例1～5产物等量混合后的混合物代替实施例1的提取物，添加到培养基中，浓度为100μg/ml时，hbegf、csf2及egfr基因表达上调分别1.6～1.7倍、2.25～2.5倍、1.4～1.5倍。