本发明涉及药物领域，尤其涉及一种过氧化氢酶-光敏分子复合物及其制备方法和应用。
背景技术：
癌症是危害人类健康的主要疾病之一，对肿瘤部位存在的氧含量相对较低的乏氧区域的研究也逐渐引起了人们的关注。一方面，由于肿瘤细胞增殖异常使得肿瘤细胞凋亡的速度明显降低，从而引起肿瘤细胞对氧及其他能量物质的需求异常增加，进而导致肿瘤组织内的血液供应则相对不足。另一个方面，肿瘤组织的高速膨胀导致血液供应的不足，进一步引起肿瘤组织乏氧。改善肿瘤部位乏氧主要包括采用乏氧敏感的药物如替拉扎明、下调乏氧诱导因子(hif-a)以及直接提高肿瘤氧含量等。
随着科学技术的发展，光动力疗法(photodynamictherapy,pdt)是一种新兴的肿瘤治疗方法，具有更安全、并发症少、对生物体损伤小的优点。光动力治疗通过特定波长的光激发在肿瘤部位富集的光敏分子，产生具有细胞毒性的活性氧，通过损坏肿瘤细胞基因结构引起肿瘤受损和死亡，达到治疗目的。
考虑到肿瘤细胞乏氧区域内存在着一定浓度的过氧化氢，通过对过氧化氢酶进行修饰，降低机体对过氧化氢酶的免疫排斥，在肿瘤组织部位富集后，一方面通过光照产生单线态氧进行光动力治疗，另一方面通过过氧化氢酶催化过氧化氢分解产生氧气进一步增强光动力治疗，达到联合治疗的效果。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种过氧化氢酶-光敏分子复合物及其制备方法和应用，本发明提供的过氧化氢酶-光敏分子复合物不仅可以作为光动力治疗，而且该复合物可催化肿瘤细胞内过氧化氢分解产生氧气，进而改善肿瘤部位乏氧情况，并增强光动力治疗，从而使得该复合物具有有更强的抑制肿瘤细胞增殖的能力。
本发明提供了一种过氧化氢酶-光敏分子复合物，由丙烯酸酯封端的聚乙二醇、n,n'-亚甲基双丙烯酰胺、式(i)结构的化合物和表面接有丙烯酸酯基团的过氧化氢酶通过自由基聚合得到；其中光敏分子卟啉经过反应生成可聚合的丙烯酸酯结构，丙烯酸酯封端的聚乙二醇经过聚合后可在复合物表面形成一层亲水性保护层，有效阻止复合物中过氧化氢酶与蛋白酶的直接接触从而引起的失活；n,n'-亚甲基双丙烯酰胺在聚合过程中可形成较稳定的交联网状结构，进一步稳定复合物，有利于复合物在循环过程中保持稳定性。
优选的，所述式(i)结构的化合物与丙烯酸酯封端的聚乙二醇的摩尔比为1：(100～200)。
优选的，所述式(i)结构的化合物与n,n'-亚甲基双丙烯酰胺的质量比为1：(1～20)。
优选的，所述式(i)结构的化合物与过氧化氢酶的质量比为1：(1～2)。
优选的，所述过硫酸铵与丙烯酸酯封端的聚乙二醇的质量比为(0.03～0.3)：1。
优选的，所述四甲基乙二胺与丙烯酸酯封端的聚乙二醇的质量比为(0.03～0.3)：1。
优选的，所述丙烯酸酯封端的聚乙二醇的分子量为500da～1000da。
优选的，所述的过氧化氢酶-光敏分子复合物，其特征在于，所述复合物的粒径为30～200纳米。
本发明还提供了一种蛋白-光敏分子复合物的制备方法，包括：由丙烯酸酯封端的聚乙二醇、n,n'-亚甲基双丙烯酰胺、式(i)结构的化合物和表面接有丙烯酸酯基团的蛋白通过自由基聚合得到；
本发明还提供了一种本发明所述的过氧化氢酶-光敏分子复合物在制备改善肿瘤部位乏氧情况以及增强光动力治疗的药物中的应用。
与现有技术相比，本发明提供的一种过氧化氢酶-光敏分子复合物，本发明所述的复合物由丙烯酸酯封端的聚乙二醇、n,n'-亚甲基双丙烯酰胺、式(i)结构的化合物和过氧化氢酶通过自由基聚合得到；该化合物通过对过氧化氢酶表面进行修饰和包裹，有效避免了生物体对外来蛋白的免疫排斥，并且在一定程度上保护了过氧化氢酶在体循环过程中的催化活性；在水和生理条件下均具有很好的分散性；得到的纳米颗粒在不仅激光照射下可产生单线态氧，而且可催化肿瘤细胞内过氧化氢产生氧气，有效改善肿瘤部位乏氧情况，在增强肿瘤的光动力治疗中具有一定的应用；实验结果表明，本发明提供的过氧化氢酶-光敏分子复合物(cat-thpp-peg)，通过对小鼠尾静脉注射，并由单光子发射计算机断层成像术对其进行监测；发现该复合物颗粒能够在肿瘤的部位具有很高的富集，且分布较好；然后用激光进行光动力治疗，对肿瘤细胞增殖具有明显的联合抑制能力，通过免疫荧光染色技术对肿瘤组织进行冷冻切片染色观察，该复合物可以有效改善肿瘤组织乏氧情况；而且该复合物颗粒在体内具有相对较长的循环时间；可见，本发明提供过氧化氢酶-光敏分子复合物不仅可以作为光动力治疗的纳米材料用于光动力治疗的药物，而且该复合物还可以作为改善肿瘤部位乏氧的纳米材料，进一步提高光动力治疗的疗效。
附图说明
图1为实施例1所述的cat-thpp-peg的紫外-可见吸收谱图；
图2为实施例1所述的cat-thpp-peg在660nm激光照射下sosg的相对荧光强度图；
图3为实施例1所述的cat-thpp-peg的动态激光粒径分布图；
图4为cat-thpp-peg纳米颗粒的透射电镜照片图；
图5为cat-thpp-peg的240分钟相对酶活性柱状图；
图6为不同浓度的cat-thpp-peg在不同浓度的过氧化氢溶液中的催化产生溶解氧含量的曲线图；
图7为标记有放射性锝元素的cat-thpp-peg在小鼠体内的单光子发射计算机断层成像(spect)照片；
图8为cat-thpp-peg在主要器官中分布的具体数值；
图9为cat-thpp-peg的血液循环数据；
图10为通过免疫荧光染色法评价cat-thpp-peg改善肿瘤部位乏氧性能；
图11为660nm激光照射下，cat-thpp-peg，不具有催化能力的bsa-thpp-peg两种纳米材料在氮气氛围下与小鼠乳腺癌细胞(4t1细胞)共培养的细胞存活率图。
具体实施方式
本发明提供了一种过氧化氢酶-光敏分子复合物，由丙烯酸酯封端的聚乙二醇、n,n'-亚甲基双丙烯酰胺、式(i)结构的化合物和表面接有丙烯酸酯基团的过氧化氢酶通过自由基聚合得到；
按照本发明，所述过氧化氢酶-光敏分子复合物中，所述式(i)结构的化合物与所述与丙烯酸酯封端的聚乙二醇的摩尔比为1：(100～200)，更优选为1：(180～185)；所述式(i)结构的化合物与n,n'-亚甲基双丙烯酰胺的质量比为1：(1～20)，更优选为1：(1.8～2.0)；所述式(i)结构的化合物与过氧化氢酶的质量比为1：(1～2)，更优选为1：(1.6～2.0)；所述丙烯酸酯封端的聚乙二醇为单丙烯酸酯封端的聚乙二醇的聚乙二醇，即
本发明还提供了一种蛋白-光敏分子复合物制备方法，包括：将丙烯酸酯封端的聚乙二醇、n,n'-亚甲基双丙烯酰胺、式(i)结构的化合物和表面接有丙烯酸酯基团的过氧化氢酶通过自由基聚合得到蛋白-光敏分子复合物；
按照本发明，本发明将丙烯酸酯封端的聚乙二醇、n,n'-亚甲基双丙烯酰胺、式(i)结构的化合物和表面接有丙烯酸酯基团的过氧化氢酶通过自由基聚合得到蛋白-光敏分子复合物；所述式(i)结构的化合物与所述与丙烯酸酯封端的聚乙二醇的摩尔比为1：(100～200)，更优选为1：(180～185)；所述式(i)结构的化合物与n,n'-亚甲基双丙烯酰胺的质量比为1：(1～20)，更优选为1：(1.8～2.0)；所述式(i)结构的化合物与过氧化氢酶的质量比为1：(1～2)，更优选为1：(1.6～2.0)；所述丙烯酸酯封端的聚乙二醇为单丙烯酸酯封端的聚乙二醇，即
本发明中，为了使反应能够更好的进行，本发明优选首先将过氧化氢酶与n-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺混合反应2～4h后，再加入丙烯酸酯封端的聚乙二醇、n,n'-亚甲基双丙烯酰胺、式(i)结构的化合物反应3～8h，得到过氧化氢酶-光敏分子复合物；其中，所述过氧化氢酶与n-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺混合反应的时间优选为2～3h；所述加入丙烯酸酯封端的聚乙二醇、n,n'-亚甲基双丙烯酰胺、式(i)结构的化合物后反应的时间优选为3～5h。
本发明还提供了一种本发明所述过氧化氢酶-光敏分子复合物在制备光动力治疗与改善肿瘤部位乏氧的药物中的应用。
本发明提供的一种过氧化氢酶-光敏分子复合物，本发明所述的过氧化氢酶-光敏分子复合物由丙烯酸酯封端的聚乙二醇、n,n'-亚甲基双丙烯酰胺、式(i)结构的化合物和表面接有丙烯酸酯基团的过氧化氢酶通过自由基聚合得到；该化合物通过对过氧化氢酶表面进行修饰和包裹，有效避免了生物体对外来蛋白的免疫排斥，并且在一定程度上保护了过氧化氢酶在体循环过程中的催化活性；在水和生理条件下均具有很好的分散性；得到的纳米颗粒在不仅激光照射下可产生单线态氧，而且可催化肿瘤细胞内过氧化氢产生氧气，有效改善肿瘤部位乏氧情况，在增强肿瘤的光动力治疗中具有一定的应用；实验结果表明，本发明提供的过氧化氢酶-光敏分子复合物(cat-thpp-peg)，通过对小鼠尾静脉注射，并由单光子发射计算机断层成像术对其进行监测，发现该复合物颗粒在肿瘤的部位具有很高的富集能力，且分布较均匀；然后用激光进行光动力治疗，对肿瘤细胞增殖具有明显的联合抑制能力，通过免疫荧光染色技术对肿瘤组织进行冷冻切片染色观察，该复合物可以有效改善肿瘤组织乏氧情况，而且该复合物颗粒在体内具有相对较长的循环时间。本发明提供一种过氧化氢酶-光敏分子复合物，在用于光动力治疗时，该复合物可同时改善肿瘤部位乏氧的情况，显著提高光动力治疗的效果。
下面将结合本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
制备过氧化氢酶-光敏分子复合物(cat-thpp-peg)，具体包括以下步骤：
将200μl质量浓度为10mg/ml的过氧化氢酶制剂(cat)、19.6mg的n-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(nas)溶解于7ml的ph值为8.5的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes)缓冲液中，在4℃条件下反应2小时后依次向体系中加入500μl质量浓度为2.4mg/ml的式(1)的5,10,15,20-四(4-羟苯基)卟啉衍生物的二甲基甲酰胺(dmf)溶液、2mgn,n'-亚甲基双丙烯酰胺、120mg的分子量为500da的丙烯酸酯封端的聚乙二醇，30mg过硫酸铵以及20μl四甲基乙二胺(temed)，超声30秒后，在4℃条件下反应3小时后，将反应体系用ph值为8.5的hepes缓冲液在4℃条件下透析3小时，将透析袋中的液体经过4000转离心后取上清液通过sephacryls-300hr丙烯葡聚糖凝胶柱，取流出液得到所述过氧化氢酶-光敏分子复合物低温保存。
为进一步验证所述复合物对肿瘤乏氧情况的改善以及增强光动力治疗的效果，以不具有催化过氧化氢能力的牛血清白蛋白(bsa)替换过氧化氢酶，采用相同的制备方法获得对照组复合物bsa-thpp-peg。即将2mg的牛血清白蛋白(bsa)、19.6mg的n-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(nas)溶解于7ml的ph值为8.5的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes)缓冲液中，在4℃条件下反应2小时后依次向体系中加入500μl质量浓度为2.4mg/ml的式(1)的5,10,15,20-四(4-羟苯基)卟啉衍生物的二甲基甲酰胺(dmf)溶液、2mgn,n'-亚甲基双丙烯酰胺、120mg的分子量为500da的丙烯酸酯封端的聚乙二醇，30mg过硫酸铵以及20μl四甲基乙二胺(temed)，超声30秒后，在4℃条件下反应3小时后，将反应体系用ph值为8.5的hepes缓冲液在4℃条件下透析3小时，将透析袋中的液体经过4000转离心后取上清液通过sephacryls-300hr丙烯葡聚糖凝胶柱，取流出液得到所述牛血清白蛋白-光敏分子复合物低温保存。
对实施例1得到的过氧化氢酶-光敏分子复合物进行表征(包括：紫外-可见吸收光谱、动态光散射、透射电镜、单线态氧产生能力)。
图1为实施例1所述的过氧化氢酶-光敏分子复合物(cat-thpp-peg)的紫外-可见吸收光谱，卟啉的特征吸收峰，表明材料的成功制备，并且在近红外区卟啉的吸收峰得到了保留，表明所制备的cat-thpp-peg具有进行光动力治疗的可能。
图2为实施例1所述的过氧化氢酶-光敏分子复合物(cat-thpp-peg)经660nm激光照射后，通过检测sosg的荧光强度来验证cat-thpp-peg产生单线态氧的能力，从图2中可以看出，与水相比，所制备的cat-thpp-peg具有良好的产生单线态氧的能力，进一步验证了cat-thpp-peg作为光动力治疗试剂的可能。
图3为所述cat-thpp-peg的动态激光粒径分布图，从图中可以看出，cat-thpp-peg所形成的纳米颗粒直径约为35nm，并且呈现单分散；图4为所述cat-thpp-peg的透射电镜照片图，粒径大小相对均一。
实施例2：cat-thpp-peg在有蛋白酶k存在的条件下，保持相对酶活性的能力测试。
蛋白酶k作为一类高活性蛋白酶，可应用于生物样品中蛋白质的一般降解。由于表面含有peg作为保护层，cat-thpp-peg纳米颗粒可以有效减少蛋白酶k与纳米颗粒中活性酶的直接接触，从而使得纳米颗粒保持相对较高的酶活性，大大有利于纳米颗粒在体循环过程中保持活性。为了研究纳米颗粒保持相对酶活性的能力，我们分别测试了在相同酶含量的条件下，单纯过氧化氢酶(cat)与纳米颗粒cat-thpp-peg在含有蛋白酶k的溶液中的酶活性。图5是所述cat-thpp-peg以及cat在不同时间的相对酶活性柱形图，结果表明与cat相比，所述cat-thpp-peg可以有效保持所含过氧化氢酶的活性。
实施例3：cat-thpp-peg在不同浓度的条件下在不同浓度的过氧化氢溶液中的催化产生氧气的性能测试。
由于cat-thpp-peg结构中含有过氧化氢酶，可催化肿瘤细胞内一定浓度的过氧化氢产生氧气。为了研究cat-thpp-peg催化过氧化氢的能力，我们分别测试了不同比例cat-thpp-peg在不同浓度的过氧化氢水溶液中催化产生溶解氧的变化。图6为通过氧电极测试溶液中溶解氧含量增加的曲线图，结果表明所述cat-thpp-peg具有良好的催化过氧化氢产生氧气的能力。
实施例4：放射性锝元素标记的cat-thpp-peg在小鼠体内分布的实时跟踪成像以及在各器官中的分布实验。
由于cat-thpp-peg结构中含有卟啉结构，其共轭大环可复合放射性金属锝用于放射性元素追踪。图7为利用所述放射性锝(99tc)标记的cat-thpp-peg纳米颗粒通过尾静脉注射，采用单光子发射计算机断层成像术(single-photonemissioncomputedtomography，spect)进行体内分布追踪图，观察各个器官及肿瘤部位cat-thpp-peg纳米颗粒的富集量，从图中可以看出，24小时后，肿瘤部位具有较强的信号，表明纳米颗粒在肿瘤部位富集量较高，将小鼠各器官取出后测试各器官中99tc的信号值，结果见图8，从图中可以看出，纳米颗粒在小鼠体内的分布较好，满足治疗需求。
实施例5：放射性锝元素标记的cat-thpp-peg在小鼠体内分布的血液循环实验。
将cat-thpp-peg纳米颗粒通过尾静脉注射到小鼠体内，在预定的时间点从老鼠眼球取出15μl左右的血液，通过测试血液中99tc的信号强度来检验cat-thpp-peg纳米颗粒在小鼠体内的血液循环情况。结果见图9，图9为cat-thpp-peg的血液循环数据，从图中可以看出，cat-thpp-peg纳米颗粒具有相对较长的循环时间，具有良好的应用价值。
实施例6：cat-thpp-peg纳米颗粒改善肿瘤部位乏氧情况实验
将cat-thpp-peg纳米颗粒通过尾静脉注射到小鼠体内，24小时后，实验小鼠牺牲，取出肿瘤组织进行冷冻切片，利用免疫荧光染色法对肿瘤切片血管和乏氧区域进行染色，通过共聚焦显微镜观察纳米颗粒改善肿瘤部位乏氧情况的能力。从图10中第二列图片可以看出，与对照组以及注射有bsa-thpp-peg纳米颗粒的肿瘤切片相比，注射了cat-thpp-peg纳米颗粒的肿瘤区域中代表乏氧程度的灰白色荧光明显较弱，表明cat-thpp-peg纳米颗粒可以有效改善肿瘤部位的乏氧情况，这将有利于后续光动力治疗。
实施例7：实施例1制备的cat-thpp-peg对肿瘤细胞的杀伤能力实验
在氮气氛围下，选取bsa-thpp-peg纳米颗粒作为对照组，从图11可以看出，经660nm的led光照射，两种复合物都具有一定的杀伤肿瘤细胞的能力。由于在氮气氛围下，氧含量较低，而光动力治疗是一个对氧有需求的过程，因此在另加100μm的过氧化氢后，cat可催化过氧化氢产生氧气，与不能催化产生氧气的bsa-thpp-peg相比，cat-thpp-peg可更加有效地提高光动力治疗的效果，表现出较强的肿瘤细胞杀伤力。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。