一种多层融合静电纺丝人工硬脑膜及其制备方法与流程

本发明涉及一种多层融合静电纺丝人工硬脑膜及其制备方法，属于生物静电纺丝技术领域。

背景技术：

硬脑膜缺损在神经外科临床工作中常见，开放性颅脑损伤(工业、交通、战争等)、肿瘤的侵蚀、先天性脑膜缺损及其它颅脑疾患原因均可引发硬脑膜缺损。硬脑膜缺损需及时修补以防脑脊液外溢，防止脑的膨出和大气压的压迫，否则将危及人体生命。硬脑膜缺损还能引发颅内感染、脑粘连、皮下积液等并发症，经常会引起如头痛、脑功能障碍等疾病。

目前己有多种材料制成的人工硬脑膜正在临床使用，主要可分为两大类:生物衍生材料和人工合成高分子材料。生物衍生材料主要有同种异体的人体硬脑膜及异种的猪/牛源心包膜、真皮基质以及利用牛肌键i型胶原制备的生物膜等。人工合成高分子材料主要包括聚酯类可降解高分子，如聚乳酸、聚乙醇酸、聚己内酯以及聚氨酯等。此外还包括聚四氟乙烯等不可降解高分子材料。

目前脑膜损伤修复效果比较理想的是多层人工硬脑膜。这种多层人工硬脑膜通过分层来达到模拟脑膜生理功能的目的。这类人工硬脑膜一般有内层和外层两层组成。其中内层由疏水材料制成，外层由亲水材料制成。由于两层材料疏水亲水性质不同，导致外层与内层的联接可靠性不高，有剥离的现象发生，严重威胁的病人的生命健康。

2014年，ibm研究院发明了一款微观（microscopic）3d打印机，可以在柔软的聚合物雕刻上纳米级分辨率图案，随后扩展在硅，iii-v(砷化镓)，或是石墨烯基板等材料进行雕刻。它可以像纳米级分辨率的铣床一样运作，在有机化合物上雕刻出纳米级的沟槽。利用这种3d打印机可以制造出超精密模具。

脑膜主要分布成纤维细胞及其分泌的胶原纤维。一般成纤维细胞直径在20-30μm之间。文献报道，当静电纺丝纤维径在50-1000nm之间时,平均孔径可达到2μm。平均孔径在3μm以下，可以有效的防止细胞的进入静电纺丝纤维薄膜中，有效脑粘连的产生。当纤维直径在5-200μm之间,平均孔径达到20-100μm。这样有利于成纤维细胞的迁入、粘附、增殖和生长分化。

中国发明专利cn103480042a，发明名称为:“一种人工硬脊膜及其制备方法和使用方法”，公开了一种具有双层结构的人工硬脊膜，由取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物纤维膜内层，和无取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物-壳聚糖纤维膜外层组成。该人工硬脊膜虽然可实现硬膜再生及预防疤痕及粘连的目的，但存在如下缺点：在临床使用过程中需要将外层和内层纤维分开放置在脑膜缺损位置，同时还需要在两层之间涂覆粘结剂，极大增加了临床使用过程中的不便。

中国发明专利cn101507661a，发明名称为：“一种具备多个功能层的纳米人工硬脑膜及其制备方法”，公开了一种具有双层结构的人工硬脑膜。该人工硬脑膜虽然可实现硬膜再生目的，但存在如下缺点:由亲水材料制备的外层直接在由疏水材料制备的内层上静电纺丝，由于两层材料疏水和亲水性质不同，所以外层与内层的联接不牢固，容易剥离，直接威胁到脑膜修复手术病人的生命安全。

因此，目前临床上迫切需要一种内层与外层联接可靠，使用方便，产业化前景广阔的人工硬脑膜。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明目的是提供一种多层融合静电纺丝人工硬脑膜，该人工硬脑膜与传统人工硬脑膜的区别是：在人工硬脑膜的内层和外层中间增加融合层，融合层采用疏水材料和亲水材料混合电纺丝制备，根据“相似相容”原理,融合层既可以和人工硬脑膜内层（疏水材料电纺丝制备）可靠结合，又可以和人工硬脑膜外层（亲水材料电纺丝制备）可靠结合。为了进一步提高层与层之间的结合效果，将融合层细分为三层：第一层疏水材料比例较高，易与内层结合；第二层疏水材料和亲水材料比例相等，与相邻的第一层和第三层结合可靠；第三层亲水材料比例较高，易与外层结合。总之，这种结构的人工硬脑膜，提高了层与层之间的结合力，不易在外力的作用下发生层与层之间的剥离。

更进一步，在内层上用专用模具，压出矩形阵列排布的圆柱型凹槽，在内层上制备融合层中的第一层时，材料可以嵌入圆柱形凹槽内，形成圆柱凹槽配合，可有效防止两层之间发生相对错动，同时由于圆柱凹槽结构增加了接触面积，可以加强两层之间的结合力，有效防止两层之间的剥离。

本发明的另一目的是提供一种多层融合静电纺丝人工硬脑膜的制备方法。

本发明解决上述问题所采用的技术方案是：

一种多层融合静电纺丝人工硬脑膜，包含三层，面向大脑的一层为疏水性内层，背向大脑的一层为亲水性外层；两层之间为融合层。任意两个相邻层之间的连接方式优选通过圆柱凹槽结构加强。

所述亲水性外层由静电纺丝制成，即外层为了有效诱导干细胞及成纤维细胞的迁入，该层则采用采用生物相容性好的亲水性材料，再者，通过静电纺丝参数调整，使平均孔径达到20-100μm，一般成纤维细胞直径在20-30μm之间。这样有利于成纤维细胞的迁入、粘附、增殖和生长分化。

所述内层是采用疏水性材料，防止细胞的迁入，从而达到防粘连的目的；对制备该层材料的静电纺丝参数进行调整，使其孔隙孔径在纳米以下，比细胞小一到二个数量级（一般成纤维细胞直径在20-30μm之间），从而阻止细胞进入，防止脑粘连产生。

所述融合层是采用疏水性材料和亲水材料混合后采用电纺丝混纺工艺制备。为了提高外层与内层之间的结合效果，融合层采用相同材料不同比例，先后依次，分多层电纺丝制备。结合生产效率和融合效果，融合层的优选层数为三层。

一种多层融合静电纺丝人工硬脑膜，包括内层、融合层、外层，其制备方法按以下步骤制备而成：

(1)内层的制备：内层材料成分为聚己内酯（深圳市博立生物材料有限公司），溶解于六氟异丙醇(苏州昊帆生物股份有限公司)中，纺丝液浓度7％（wt），搅拌4小时，电纺丝参数为流速为0.9ml/h、电压13kv、接收距离20cm，静电纺丝4h。

用专用模具在内层上表面压出，直径为φ80μm，深度为20μm，横向间距为5mm，纵向间距为5mm，呈矩形阵列排布的凹槽。

(2)融合层第一层材料为80％聚己内酯/20％聚乙醇酸（两者均购于深圳市博立生物材料有限公司），溶解于六氟异丙醇(苏州昊帆生物股份有限公司)中，纺丝液浓度4％（wt），搅拌8小时，电纺丝参数为：流速为0.9ml/h、电压13kv、接收距离14cm，静电纺丝1h。

融合层第二层材料为50％聚己内酯50％聚乙醇酸（两者均购于深圳市博立生物材料有限公司），溶解于六氟异丙醇(苏州昊帆生物股份有限公司)中，纺丝液浓度5％（wt），搅拌8小时，电纺丝参数为：流速为1.1ml/h、电压15kv、接收距离15cm，静电纺丝1h。

融合层第三层材料为20％聚己内酯80％聚乙醇酸（两者均购于深圳市博立生物材料有限公司），溶解于六氟异丙醇(苏州昊帆生物股份有限公司)中，纺丝液浓度6％（wt），搅拌1小时，电纺丝参数为：流速为1.2ml/h、电压13kv、接收距离15cm，静电纺丝1h。用专用模具在融合层第三次上表面压出，直径φ80μm，深20μm，横向间距5mm，纵向间距5mm，呈矩形阵列排布的凹槽。

(3)外层材料为聚乙醇酸（深圳市博立生物材料有限公司），溶解于六氟异丙醇(苏州昊帆生物股份有限公司)中，纺丝液浓度6％（wt），搅拌1小时，电纺参数为：流速1.4ml/h、电压12kv、接收距离10cm，静电纺丝4h。

(4)将制得的人工脑膜从培养皿中取出，用蒸馏水漂洗3遍，经冻干后真空包装，经25kgy钴-60灭菌后-20℃低温保存。

制备得到的多层静电纺丝人工硬脑膜每层的厚度为：内层厚度为80μm±10μm，外层厚度为30μm±10μm，融合层厚度为100μm±10μm。融合层中的三层厚度分别为：从下到上的顺序，第一层厚度为：30μm±10μm，第二层厚度为：40μm±10μm，第三层厚度为：30μm±10μm。

内层制备时，静电纺丝纤维直径控制在50-1000nm之间,平均孔径为2μm；

外层制备时，静电纺丝纤维直径控制在5-200μm之间,平均孔径为20-100μm。

本发明的有益效果是：

(1)本发明人工硬脑膜采用三层结构，通过融合层加强内层和外层的结合强度，采用凸台凹槽结构，进一步提高层与层之间的结合强度；

(2)本发明人工硬脑膜的内层是采用疏水性材料，防止细胞的迁入，从而达到防粘连的目的；对制备该层材料的静电纺丝参数进行调整，使其孔隙孔径在纳米以下，比细胞小一到二个数量级（一般成纤维细胞直径在20-30μm之间），从而阻止细胞进入，防止脑粘连产生；

(3)亲水性外层由静电纺丝制成，即外层为了有效诱导干细胞及成纤维细胞的迁入，该层则采用采用生物相容性好的亲水性材料，再者，通过静电纺丝参数调整，使平均孔径达到20-100μm，一般成纤维细胞直径在20-30μm之间。这样有利于成纤维细胞的迁入、粘附、增殖和生长分化。

附图说明

图1为人工硬脑膜结构示意图，其中1为内层，2为融合层，3为外层。

图2为人工硬脑膜内层结构示意图，其中4为内层上的凹槽。

图3为人工硬脑膜内层和融合层结构示意图，其中5为内层上的凹槽。

图4为专用压槽模具。

图5为内层压槽后的效果图。

图6为融合层压槽后的效果图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法:下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

(1)内层的制备：内层材料成分为聚己内酯（深圳市博立生物材料有限公司），溶解于六氟异丙醇(苏州昊帆生物股份有限公司)中,纺丝液浓度5％（wt），搅拌1小时，电纺丝参数为流速为1.0ml/h、电压12kv、接收距离15cm，静电纺丝2h。

用专用模具在内层上表面压出，直径φ80μm，深20μm，横向间距5mm，纵向间距5mm，呈矩形阵列排布的凹槽。

(2)融合层第一层材料为80％聚己内酯/20％聚乙醇酸（两者均购于深圳市博立生物材料有限公司），溶解于六氟异丙醇(苏州昊帆生物股份有限公司)中，纺丝液浓度4％（wt），搅拌1小时，电纺丝参数为：流速为1.0ml/h、电压12kv、接收距离14cm，静电纺丝0.5h。

融合层第二层材料为50％聚己内酯50％聚乙醇酸（两者均购于深圳市博立生物材料有限公司），溶解于六氟异丙醇(苏州昊帆生物股份有限公司)中，纺丝液浓度5％（wt），搅拌1小时，电纺丝参数为：流速为1.2ml/h、电压15kv、接收距离15cm，静电纺丝1h。

融合层第三层材料为20％聚己内酯80％聚乙醇酸（两者均购于深圳市博立生物材料有限公司），溶解于六氟异丙醇(苏州昊帆生物股份有限公司)中，纺丝液浓度6％（wt），搅拌1小时，电纺丝参数为：流速为1.1ml/h、电压13kv、接收距离20cm，静电纺丝0.5h。用专用模具在融合层第三次上表面压出，直径φ80μm，深20μm，横向间距5mm，纵向间距5mm，呈矩形阵列排布的凹槽。

(3)外层材料为聚乙醇酸（深圳市博立生物材料有限公司），溶解于六氟异丙醇(苏州昊帆生物股份有限公司)中，纺丝液浓度6％（wt），搅拌1小时，电纺参数为：流速1.2ml/h、电压14kv、接收距离15cm，静电纺丝6h。

(4)将制得的人工脑膜从培养皿中取出，用蒸馏水漂洗3遍，经冻干后真空包装，经25kgy钴-60灭菌后-20℃低温保存。

实施例2

(1)内层的制备：内层材料成分为聚己内酯（深圳市博立生物材料有限公司），溶解于六氟异丙醇(苏州昊帆生物股份有限公司)中，纺丝液浓度7％wt，搅拌4小时，电纺丝参数为流速为0.9ml/h、电压13kv、接收距离20cm，静电纺丝4h。

用专用模具在内层上表面压出，直径φ80μm，深20μm，横向间距5mm，纵向间距5mm，呈矩形阵列排布的凹槽。

(2)融合层第一层材料为80％聚己内酯/20％聚乙醇酸（两者均购于深圳市博立生物材料有限公司），溶解于六氟异丙醇(苏州昊帆生物股份有限公司)中，纺丝液浓度4％（wt），搅拌8小时，电纺丝参数为：流速为0.9ml/h、电压13kv、接收距离14cm，静电纺丝1h。

融合层第二层材料为50％聚己内酯50％聚乙醇酸（两者均购于深圳市博立生物材料有限公司），溶解于六氟异丙醇(苏州昊帆生物股份有限公司)中，纺丝液浓度5％（wt），搅拌8小时，电纺丝参数为：流速为1.1ml/h、电压15kv、接收距离15cm，静电纺丝1h。

融合层第三层材料为20％聚己内酯80％聚乙醇酸（两者均购于深圳市博立生物材料有限公司），溶解于六氟异丙醇(苏州昊帆生物股份有限公司)中，纺丝液浓度6％（wt），搅拌1小时，电纺丝参数为：流速为1.2ml/h、电压13kv、接收距离15cm，静电纺丝1h。用专用模具在融合层第三次上表面压出，直径φ80μm，深20μm，横向间距5mm，纵向间距5mm，呈矩形阵列排布的凹槽。

(3)外层材料为聚乙醇酸（深圳市博立生物材料有限公司），溶解于六氟异丙醇(苏州昊帆生物股份有限公司)中，纺丝液浓度6％（wt），搅拌1小时，电纺参数为：流速1.4ml/h、电压12kv、接收距离10cm，静电纺丝4h。

(4)将制得的人工脑膜从培养皿中取出，用蒸馏水漂洗3遍，经冻干后真空包装，经25kgy钴-60灭菌后-20℃低温保存。

实施例3

(1)内层的制备：内层材料成分为聚己内酯（深圳市博立生物材料有限公司），溶解于六氟异丙醇(苏州昊帆生物股份有限公司)中，纺丝液浓度5％wt，搅拌4小时，电纺丝参数为流速为1.0ml/h、电压15kv、接收距离25cm，静电纺丝5h。

用专用模具在内层上表面压出，直径φ80μm，深20μm，横向间距5mm，纵向间距5mm，呈矩形阵列排布的凹槽。

(2)融合层第一层材料为80％聚己内酯/20％聚乙醇酸（两者均购于深圳市博立生物材料有限公司），溶解于六氟异丙醇(苏州昊帆生物股份有限公司)中，纺丝液浓度4％（wt），搅拌1小时，电纺丝参数为：流速为1.0ml/h、电压12kv、接收距离14cm，静电纺丝1h。

融合层第二层材料为50％聚己内酯50％聚乙醇酸（两者均购于深圳市博立生物材料有限公司），溶解于六氟异丙醇(苏州昊帆生物股份有限公司)中，纺丝液浓度5％（wt），搅拌1小时，电纺丝参数为：流速为1.2ml/h、电压15kv、接收距离15cm，静电纺丝1h。

融合层第三层材料为20％聚己内酯80％聚乙醇酸（两者均购于深圳市博立生物材料有限公司），溶解于六氟异丙醇(苏州昊帆生物股份有限公司)中，纺丝液浓度6％（wt），搅拌1小时，电纺丝参数为：流速为1.1ml/h、电压13kv、接收距离20cm，静电纺丝1h。用专用模具在融合层第三次上表面压出，直径φ80μm，深20μm，横向间距5mm，纵向间距5mm，呈矩形阵列排布的凹槽。

(3)外层材料为聚乙醇酸（深圳市博立生物材料有限公司），溶解于六氟异丙醇(苏州昊帆生物股份有限公司)中，纺丝液浓度6％（wt），搅拌1小时，电纺参数为：流速1.2ml/h、电压14kv、接收距离10cm，静电纺丝4h。

(4)将制得的人工脑膜从培养皿中取出，用蒸馏水漂洗3遍，经冻干后真空包装，经25kgy钴-60灭菌后-20℃低温保存。