乙二胺阳离子化白蛋白抗肿瘤纳米粒及其制备方法和用途与流程

本发明属于医药技术领域的药物制剂，涉及一种乙二胺阳离子化白蛋白抗肿瘤纳米粒及其制备方法和用途，特别是乙二胺阳离子化白蛋白作为全反式维甲酸的载体在制备纳米注射剂中的用途。

背景技术：

全反式维甲酸(all-trans-retinoicacid，atra)是维生素a的衍生物，是目前治疗急性早幼粒细胞白血病的首选药物，具有疗效好、完全缓解率高、不引起弥漫性血管内凝血等优点。近年研究发现，atra具有抑制肿瘤干细胞(csc)的作用。此外，文献报道，atra能够使乳腺癌干细胞肿瘤球数目和csc表面标记cd44表达明显减少，显著抑制乳腺癌细胞和乳腺癌干细胞的生长。但是由于atra稳定性差、体内清除快、生物利用度低，以及在体内对肿瘤组织无特异选择性等问题，大大限制了atra的临床应用。

为了减少atra的使用剂量和次数，增加atra在肿瘤组织中的靶向蓄积，增强其抗肿瘤疗效同时降低毒副作用，研究者们越来越多的将精力投入到开发atra新制剂、尤其是纳米制剂上来。soo-jeonglim等将atra包载到固体脂质纳米粒(sln)中，发现sln能够增加atra的稳定性，但是载药率较低，仅有2.4％。张敬如等通过逆相蒸发法制备了atra脂质体，各配方稳定性较好，但是包封率均低于70％。目前atra新型纳米制剂的研究均处于实验室阶段，尚未获得包封率好、载药率高、粒径及稳定性都符合临床要求的新型制剂。

白蛋白纳米粒作为一种药物载体，具有无免疫原性、生物相容性好等诸多优点，特别是以nabtm技术将药物与人血清白蛋白结合而制备的白蛋白纳米粒，利用了肿瘤生理学特征、白蛋白内源通路及epr效应(enhancedpermeabilityandretentioneffect)，具有双重靶向性，大大提高了药物的肿瘤分布；同时由于大大减少了基于溶剂传递的常规剂型中的过敏反应及毒性，可以避免预治疗，增加了患者的顺应性。

本发明对肿瘤药物的载体进行了探索，并获得了一种优秀的抗肿瘤纳米粒。

技术实现要素：

本发明首先提供一种阳离子化白蛋白抗肿瘤纳米粒，包括乙二胺阳离子化白蛋白和至少一种抗肿瘤活性物质，所述乙二胺阳离子化白蛋白作为所述抗肿瘤活性物质的载体。

白蛋白表面有丰富的羧基等功能团，便于我们对其进行修饰从而达到更多有助于药物传递的新功能。乙二胺(ethylenediamine)可以与羧基反应与白蛋白共价结合，同时不影响白蛋白的空间结合，从而保留了白蛋白生物功能。更有意义的是，由于处于无限增殖中的肿瘤细胞因表达丰富的功能蛋白及受体而表面带有更多的负电荷，利用经乙二胺修饰后的白蛋白制备成的纳米粒将带有一定的正电荷，这将有利于纳米粒与表面带负电荷的肿瘤细胞结合，提高纳米粒对抗肿瘤活性物质传递的肿瘤选择性和传递效率。因此，利用乙二胺修饰的白蛋白作为载体制备包载抗肿瘤活性物质的新型纳米制剂，能在有效提高抗肿瘤活性物质的稳定性和生物利用度的前提下，通过纳米粒特有的epr效应、白蛋白內源通路以及正负电荷吸引的共同作用，达到提高atra的抗肿瘤效果、降低毒副作用的目的。

在一个具体的实施方案中，所述抗肿瘤活性物质为脂溶性药物，选自全反式维甲酸、紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛、长春新碱、喜树碱和卡莫司汀中的一种或多种。

在一个优选的实施方案中，所述抗肿瘤活性物质为全反式维甲酸。

在一个具体的实施方案中，所述阳离子化白蛋白为水溶性白蛋白，优选自人血清白蛋白和牛血清白蛋白中的一种或多种。

在一个优选的实施方案中，所述阳离子化白蛋白抗肿瘤纳米粒的制剂形式为冻干粉针剂。

在一个更优选的实施方案中，所述阳离子化白蛋白抗肿瘤纳米粒的平均粒径小于220nm。

本发明还提供所述阳离子化白蛋白抗肿瘤纳米粒在制备抗肿瘤药物中的用途。

在一个具体的实施方案转中，所述阳离子化白蛋白抗肿瘤纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

a、将乙二胺阳离子化白蛋白溶解于水中，得到a液；

b、将抗肿瘤活性物质溶解于有机溶剂中，得到b液；

c、将a液和b液混合，经过超声破碎、高压均质和旋转蒸发，即得阳离子化白蛋白抗肿瘤纳米粒的分散液。

在更具体的实施方案中，所述有机溶剂为能够溶解抗肿瘤活性物质且易于被蒸发除去的溶剂，优选自无水乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮中的一种或多种。

本发明还提供一种阳离子化白蛋白抗肿瘤纳米粒的冻干粉针剂的制备方法，其特征在于，在上述制备方法的基础上，还包括将所述阳离子化白蛋白抗肿瘤纳米粒的分散液进行冷冻干燥的步骤。

本发明还提供乙二胺阳离子化白蛋白作为抗肿瘤活性物质的载体的用途。更具体地，本发明还提供乙二胺阳离子化白蛋白作为抗肿瘤活性物质的载体在制备抗肿瘤纳米粒制剂中的用途，特别是作为全反式维甲酸的载体在制备抗肿瘤纳米注射剂中的用途。

本发明以乙二胺阳离子化白蛋白为载体材料与atra结合，可制备一种使用方便、安全性高及肿瘤靶向性好的纳米药物制剂，它可用生理溶液重组成可注射的混合物。

其中，乙二胺阳离子化白蛋白为载体材料与atra形成一种表面带正电荷的载药纳米粒，纳米粒的平均粒径小于0.22微米。这种载药纳米粒不仅可以作为各种水不容性药物的递送工具，且药物载体本身生物相容性好、可生物降解、无毒副作用。通过利用纳米载药系统，增加了atra的溶解度和稳定性，提高atra的生物利用度和肿瘤治疗疗效，降低atra的不良反应。为临床肿瘤治疗提供一种制备简单，且稳定高，安全有效的atra纳米注射制剂。

本发明所述的基于乙二胺阳离子化白蛋白的纳米药物载体，主要通过溶剂注入-超声破碎-高压均质-旋转蒸发的方法制备。

本发明的另一目的是制备稳定的、高包封率的，同时具有良好靶向抗肿瘤作用的atra-乙二胺阳离子化白蛋白纳米粒(atra-ebsa-nps)，解决目前临床所用atra注射制剂存在的不稳定，使用不方便，不良反应多，生物利用度低的问题。

在一个实施方案中，atra-ebsa-nps的制备包括以下步骤：

(1)将atra溶解于无水乙醇(和/或三氯甲烷)中，再注入到一定量的乙二胺阳离子化白蛋白水溶液中；

(2)将所得溶液置于细胞超声破碎仪下超声；再置于纳米高压均质机下高压均质；再减压旋转蒸发，除去有机溶剂，即得到白蛋白纳米粒的分散液。

进一步，作为一种优选的新型多功能纳米药物载体的制备方法，包括以下步骤：

a、称取处方量的atra；

b、将atra溶解于1体积无水乙醇中，再注入到5～100体积的0～50℃的乙二胺阳离子化白蛋白水溶液中；

c、将步骤b所得溶液立即置于细胞超声破碎仪下0～50℃水浴超声5-30min；

d、将步骤c所得溶液置于纳米高压均质机下高压均质，压力为9000-18000psi，至少进行5个循环；

e、将步骤d所得溶液进行减压旋转蒸发，除去有机溶剂，旋蒸温度为25～50℃，即得到atra-ebsa-nps。

本发明益处

本发明所制备的新型阳离子化白蛋白载药纳米粒，既可作难溶性药物的传递平台，提高所载难溶性药物的溶解度、稳定性和生物利用度，降低不良反应；也可提高药物对肿瘤组织的选择性和亲和力，增强药物的肿瘤靶向能力。具体地，本发明制备的atra-ebsa-nps，粒径在150-300nm之间，大部分粒子集中于180nm左右，平均zeta电位为47mv，相对比较稳定，能在4℃环境下稳定存在4周以上。

附图说明

图1为本发明制备的atra-ebsa-nps的透射电镜(tem)图。

图2为本发明制备的atra-ebsa-nps的差示量热扫描分析(dsc)图。

图3为本发明制备的atra-ebsa-nps的体外释放图片。

图4为本发明制备的atra-ebsa-nps的制剂稳定性考察。

图5为本发明制备的atra-ebsa-nps的体外细胞摄取能力考察。

图6为本发明制备的atra-ebsa-nps的体外细胞毒性结果。

图7为本发明制备的atra-ebsa-nps抑制肿瘤细胞体内成瘤能力的直观结果。

图8为本发明制备的atra-ebsa-nps小鼠体内生物分布特征。

具体实施方式

以下实施例仅是对本发明的进一步阐述与说明，而不是对本发明范围的限制。本领域技术人员应当理解，本发明并不限于这些实施例以及使用的制备方法。而且，本领域技术人员根据本发明的描述可以对本发明进行等同替换、组合、改良或修饰，但这些都将包括在本发明的范围内。

实施例1

atra-ebsa-nps的制备：称取4.5mgatra置于1.5ml离心管中，加入0.9ml的无水乙醇，充分溶解，得到含药有机相(5mg/ml)；称取50mgebsa用10ml纯化水溶解置于玻璃西林瓶中，作为水相；将有机相注入到水相中，立即采用细胞超声破碎仪在冰浴条件下进行超声破碎，超声功率为50w，超5s停5s，共超声20min；然后将西林瓶中溶液转移至高压均质机，在18000psi压力下高压均质15个循环；然后将西林瓶中溶液转移至100ml圆底烧瓶中，35℃水浴避光减压旋蒸除去有机溶剂，即得到atra-ebsa-nps溶液。该溶液外观为淡黄色、透明且泛有乳光，激光照射有丁达尔现象。平均粒径为180nm，平均zeta电位为47.1mv，hplc检测atra的包封率为94.93％。

将分散液冷冻干燥48小时，不加任何防冻剂。所得饼块加入无菌水或生理盐水后很易再构成原来的分散液，再构成颗粒的大小与冷冻干燥前相同。

实施例2

atra-ebsa-nps的制备：称取10mgatra置于5ml离心管中，加入2ml的无水乙醇，充分溶解，得到含药有机相(5mg/ml)；称取100mgebsa用10ml纯化水溶解置于玻璃西林瓶中，作为水相；将有机相注入到水相中，立即采用细胞超声破碎仪在冰浴条件下进行超声破碎，超声功率为50w，超5s停5s，共超声20min；然后将西林瓶中溶液转移至高压均质机，在18000psi压力下高压均质15个循环；然后将西林瓶中溶液转移至100ml圆底烧瓶中，35℃水浴避光减压旋蒸除去有机溶剂，即得到atra-ebsa-nps溶液。该溶液外观为淡黄色、透明且泛有乳光，激光照射有丁达尔现象。平均粒径为200nm，平均zeta电位为45.2mv，hplc检测atra的包封率为92.56％。

将分散液冷冻干燥48小时，不加任何防冻剂。所得饼块加入无菌水或生理盐水后很易再构成原来的分散液，再构成颗粒的大小与冷冻干燥前相同。

实施例3

atra-ebsa-nps的制备：称取50mgatra置于10ml离心管中，加入10ml的无水乙醇，充分溶解，得到含药有机相(5mg/ml)；称取500mgebsa用50ml纯化水溶解置于玻璃西林瓶中，作为水相；将有机相注入到水相中，立即采用细胞超声破碎仪在冰浴条件下进行超声破碎，超声功率为50w，超5s停5s，共超声20min；然后将西林瓶中溶液转移至高压均质机，在18000psi压力下高压均质15个循环；然后将西林瓶中溶液转移至100ml圆底烧瓶中，35℃水浴避光减压旋蒸除去有机溶剂，即得到atra-ebsa-nps溶液。该溶液外观为淡黄色、透明且泛有乳光，激光照射有丁达尔现象。平均粒径为210nm，平均zeta电位为44.3mv，hplc检测atra的包封率为92.15％。

将分散液冷冻干燥48小时，不加任何防冻剂。所得饼块加入无菌水或生理盐水后很易再构成原来的分散液，再构成颗粒的大小与冷冻干燥前相同。

实施例4

atra-ebsa-nps的制备：称取5mgatra置于1.5ml离心管中，加入0.025ml的无水乙醇和0.225ml的三氯甲烷充分溶解，得到含药有机相(5mg/ml)；称取50mgebsa用10ml纯化水溶解置于玻璃西林瓶中，作为水相；将有机相注入到水相中，立即采用细胞超声破碎仪在冰浴条件下进行超声破碎，超声功率为50w，超5s停5s，共超声20min；然后将西林瓶中溶液转移至高压均质机，在18000psi压力下高压均质15个循环；然后将西林瓶中溶液转移至100ml圆底烧瓶中，35℃水浴避光减压旋蒸除去有机溶剂，即得到atra-ebsa-nps溶液。该溶液外观为淡黄色、透明且泛有乳光，激光照射有丁达尔现象。平均粒径为175nm，平均zeta电位为47.5mv，hplc检测atra的包封率为95.50％。

将分散液冷冻干燥48小时，不加任何防冻剂。所得饼块加入无菌水或生理盐水后很易再构成原来的分散液，再构成颗粒的大小与冷冻干燥前相同。

实施例5

atra-ebsa-nps的制备：称取10mgatra置于5ml离心管中，加入0.05ml的无水乙醇和0.45ml的三氯甲烷充分溶解，得到含药有机相(5mg/ml)；称取100mgebsa用10ml纯化水溶解置于玻璃西林瓶中，作为水相；将有机相注入到水相中，立即采用细胞超声破碎仪在冰浴条件下进行超声破碎，超声功率为50w，超5s停5s，共超声20min；然后将西林瓶中溶液转移至高压均质机，在18000psi压力下高压均质15个循环；然后将西林瓶中溶液转移至100ml圆底烧瓶中，35℃水浴避光减压旋蒸除去有机溶剂，即得到atra-ebsa-nps溶液。该溶液外观为淡黄色、透明且泛有乳光，激光照射有丁达尔现象。平均粒径为185nm，平均zeta电位为45.6mv，hplc检测atra的包封率为95.80％。

将分散液冷冻干燥48小时，不加任何防冻剂。所得饼块加入无菌水或生理盐水后很易再构成原来的分散液，再构成颗粒的大小与冷冻干燥前相同。

实施例6

载紫杉醇ebsa纳米粒(ptx-ebsa-nps)的制备：称取5mg紫杉醇(ptx)置于1.5ml离心管中，加入1ml的无水乙醇，充分溶解，得到含药有机相(5mg/ml)；称取50mgebsa用10ml纯化水溶解置于玻璃西林瓶中，作为水相；将有机相注入到水相中，立即采用细胞超声破碎仪在冰浴条件下进行超声破碎，超声功率为50w，超5s停5s，共超声20min；然后将西林瓶中溶液转移至高压均质机，在18000psi压力下高压均质15个循环；然后将西林瓶中溶液转移至100ml圆底烧瓶中，35℃水浴避光减压旋蒸除去有机溶剂，即得到ptx-ebsa-nps溶液。该溶液外观为淡黄色、透明且泛有乳光，激光照射有丁达尔现象。平均粒径为120nm，平均zeta电位为40.5mv，hplc检测ptx的包封率为95％。

将分散液冷冻干燥48小时，不加任何防冻剂。所得饼块加入无菌水或生理盐水后很易再构成原来的分散液，再构成颗粒的大小与冷冻干燥前相同。

实施例7

atra-ebsa-nps的制备：称取50mgatra置于5ml离心管中，加入0.25ml的无水乙醇和2.25ml的三氯甲烷充分溶解，得到含药有机相(5mg/ml)；称取500mgebsa用30ml纯化水溶解置于玻璃西林瓶中，作为水相；将有机相注入到水相中，立即采用细胞超声破碎仪在冰浴条件下进行超声破碎，超声功率为50w，超5s停5s，共超声20min；然后将西林瓶中溶液转移至高压均质机，在18000psi压力下高压均质15个循环；然后将西林瓶中溶液转移至100ml圆底烧瓶中，35℃水浴避光减压旋蒸除去有机溶剂，即得到atra-ebsa-nps溶液。该溶液外观为淡黄色、透明且泛有乳光，激光照射有丁达尔现象。平均粒径为190nm，平均zeta电位为46.6mv，hplc检测atra的包封率为93.50％。

将分散液冷冻干燥48小时，不加任何防冻剂。所得饼块加入无菌水或生理盐水后很易再构成原来的分散液，再构成颗粒的大小与冷冻干燥前相同。

表征和药效学实验

1、透射电镜表征

图1为实施例1制备的atra-ebsa-nps的透射电镜图。从图中可以看出，atra-ebsa-nps纳米粒子均为类球形结构，粒径较均一，粒径大致为180nm左右。

2、差示量热扫描表征

图2为bsa、atra和实施例1制备的atra-ebsa-nps的差示量热扫描分析图。其中负吸收峰代表吸热峰。atra在约190℃时出现一个吸热峰，紧接着在460℃时出现一个放热峰；bsa在220、320和450℃处各有一吸热峰；而atra-ebsa-nps的热分析图谱中，仅在110和450℃附近各出现一个放热峰，atra吸收峰完全消失，说明atra基本完全被包裹进纳米粒中形成了新的物相，以分子形式高度分散于

atra-ebsa-nps中。

3、体外释放测试

atra-ebsa-nps在含20％乙醇的磷酸盐缓冲溶液中进行累积释放率的检测。配制20％乙醇的磷酸盐缓冲溶液200ml分成二等份，作为透析介质。分别取2ml按实施例1制备的atra-ebsa-nps溶液(含0.9mgatra)和atra乙醇溶液(0.45mg/ml)注入到透析袋中并封口，然后浸入到透析介质中进行释放。释放环境为:37c的气浴恒温振荡器中，以50转/分的速度避光震摇。于固定时间点，各取1ml透析介质进行hplc检测，然后每组补充1ml新鲜透析介质。累积计算每个时间点的药物释放量。图3为药物的释放曲线图，由该图可知，游离atra在16h时释放了91.39％，而atra-ebsa-nps在释放后的48h时，只释放了80.08％的atra。说明atra-ebsa-nps能显著控制atra的释放，延长药物在体内的作用时间，可增加药物的生物利用度。

4、atra-ebsa-nps纳米粒的制剂稳定性考察。

将按实施例1制备的atra-ebsa-nps置于4℃冰箱，观察四周(28天)后的粒径变化。由atra-ebsa-nps的粒径分布图(图4)可知，在4℃环境下，该纳米粒四周内稳定存在，粒径及表面电位无显著变化，说明atra-ebsa-nps的制剂稳定性良好。

5、激光共聚焦显微镜观察纳米粒在细胞内的分布

消化收集处于对数生长期的b16f10细胞，加入适量的rpmi1640完全培养基制成单细胞悬液。将细胞接种于预先放入无菌盖玻片的6孔板内，使细胞接种量皆为2×10⁵个/孔，置于37℃，5％co²培养箱培养至细胞贴壁。细胞分为两组，分别加入香豆素6(coumarin-6)标记的atra-bsa-nps和atra-ebsa-nps(atra-ebsa-nps按实施例1制备，atra-bsa-nps参照实施例1制备，但将其中的ebsa换为bsa)，剂量atra5μm与细胞共同孵育4h。中止培养后，弃去孔内药液，用预冷的pbs缓冲液轻轻洗涤细胞1-2次，4％多聚甲醛固定10min。再用冷pbs缓冲液洗涤1次，加入适量的dapi染色液，室温避光放置5min。捞取细胞爬片后抗荧光淬灭封片液封片。激光共聚焦显微镜下观察结果如图5所示，

atra-bsa-nps和atra-ebsa-nps均能被肿瘤细胞摄入，然而后者绿色荧光显著强于前者，且可见呈分散分布的高亮度绿色荧光点，说明阳离子化修饰后纳米粒的摄取效率大大提高。

6、atra-ebsa-nps纳米粒的体外抗肿瘤能力考察。

以b16f10细胞为模型，采用mtt法检测atra-ebsa-nps(按实施例1制备)及游离药atra对b16f10细胞的增殖毒性。取对数生长期的b16f10细胞以1×10⁵个/孔的密度均匀接种于96孔板，二氧化碳培养箱培养过夜。吸掉孔中的培养基，然后分别加入100μl系列浓度梯度的atra-ebsa-nps、atra，每个浓度设5个复孔，并设5个给予新鲜培养基的孔作为阴性对照组。继续培养48h后，吸出96孔板中的药液，用pbs清洗3遍，然后每孔加入100μl无血清培养基和10μl预先配置好的mtt溶液(5mg/ml)，继续放于二氧化碳孵箱培养。4h后，取出96孔板，小心吸弃培养液，然后每孔加入150μldmso，置于摇床上低速震摇10min，用酶标仪测定492nm处各孔的吸光度(od值)，并按下列公式计算细胞生长抑制率(inhibitionrate，ir)。

ir＝(1-od实验组/od对照组)×100％

由图6可知，atra-ebsa-nps在低浓度时对肿瘤细胞的作用与游离药物相比无显著性差别，但在高浓下的atra-ebsa-nps的抗肿瘤能力显著高于相同浓度的游离atra，说明atra-ebsa-nps能显著提高atra的抗肿瘤疗效。

7、atra-ebsa-nps纳米粒对b16f10细胞在动物体内成瘤性能的影响。

本发明采用c57bl/6雌鼠为动物模型，将经不同药物处理过b16f10细胞皮下注射到小鼠的不同部位，然后观查各处理组的成瘤情况。具体操作如下：将生长到对数期的b16f10细胞用0.25％胰蛋白酶消化后按2×10⁵个/孔的密度均匀接种于六孔板，置于二氧化碳培养箱培养过夜至融合率达80％以上。然后各孔分别加入1ml的游离atra(5μm)、atra-bsa-nps(atra:5μm)和atra-ebsa-nps(atra:5μm)溶液进行共培养，对照组加等体积无血清的培养基(atra-ebsa-nps按实施例1制备，atra-bsa-nps参照实施例1制备，但将其中的ebsa换为bsa)。48h后，消化收集细胞并用pbs(ph＝7.2)清洗2遍，然后分别重悬于无血清无双抗的培养基中，控制细胞密度为1×10⁴/ml。再将空白对照组和各给药组细胞分别皮下注射到同一小鼠四肢腋下，并做好标记，对照组细胞注射到另一只小鼠腋下(n＝5)。实时观察小鼠的成瘤情况，直到接种肿瘤细胞后第22天组小鼠成瘤情况有明显的趋势，然后颈椎脱臼法处死各组小鼠，游标卡尺测量肿瘤体积，最后选取一组对照组和一组实验组小鼠进行解剖，观察并拍照记录。结果，对照组和atra组中所有老鼠均长出肿瘤，atra-bsa-nps组5只老鼠中2只老鼠长出肿瘤，atra-ebsa-nps组中5只老鼠均未长出肿瘤，与对照组相比，各药物组均能明显抑制b16f10细胞在小鼠体内的成瘤能力。由图7可知，空白对照组、atra组、atra-bsa-nps组和atra-ebsa-nps组的瘤体积依次明显减小。对照组的肿瘤大小与其他各给药组均存在显著性差异(p<0.05)。与atra相比较，atra-ebsa-nps纳米粒能显著抑制b16f10细胞在小鼠体内的成瘤能力。

8、atra-ebsa-nps纳米粒对静脉注射atra小鼠体内生物分布特征的影响。

本发明采用b16f10细胞肺转移瘤c57bl/6雌鼠为动物模型(n＝5)，分两组分别尾静脉注射did荧光标记的atra-bsa-nps和atra-ebsa-nps纳米粒溶液(atra-ebsa-nps按实施例1制备，atra-bsa-nps参照实施例1制备，但将其中的ebsa换为bsa)，给药剂量为atra5mg/kg，于给药后8h用小动物活体成像观察纳米粒在小鼠体内的分布情况(图8)。由图8可知，与atra-bsa-nps组相比，atra-ebsa-nps组小鼠荷瘤肺部呈现较强的荧光信号，提示纳米粒富集于肺部组织，提示可以用于肺部肿瘤的治疗。将小鼠解剖对主要脏器进行荧光观察，进一步确证了这一结果。因此，我们认为atra-ebsa-nps纳米粒能有效将atra靶向递送至肺部，提高肿瘤部位的atra浓度，增强抑瘤效果，降低毒副作用。

实施例中使用的atra(全反式维甲酸)购自萨恩化学技术上海有限公司。bsa(牛血清白蛋白)购自国药集团化学试剂有限公司。ebsa(乙二胺阳离子化白蛋白)自制：将40ml1.4m的乙二胺水溶液用盐酸调节ph至4.75，缓慢逐滴加入5mlbsa水溶液(10％，v/v)中。随后，加入一定量的缩合剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edci，100mg)，继续于室温搅拌反应2h，用400μl4m醋酸盐缓冲液(ph＝4.75)终止反应。透析(截留分子量14000)除去未反应的乙二胺和杂质，冻干获得ebsa。

虽然说明书中对本发明的实施方式进行了说明，但这些实施方式只是作为提示，不应限定本发明的保护范围。在不脱离本发明宗旨的范围内进行各种省略、置换和变更均应包含在本发明的保护范围内。