一种高乌头中总生物碱的提取方法与流程

本发明涉及一种植物中有效成分的提取方法，特别是一种高乌头中总生物碱的提取方法。

背景技术：

高乌头为毛茛科乌头属植物，产于我国西部、中部，中药常以其根入药，具有活血化瘀、止痛消肿等功效，可治疗风寒关节冷痛、风湿等疾病。近年来，对高乌头中生物碱的研究一直都比较活跃，从总生物碱中分离出各成分，再经过药理筛选出具有镇痛、麻醉作用，镇痛效果好，无成瘾性或具有活血化瘀、止痛消肿等其它药理作用的多种生物碱药物，将具有很好的市场应用及开发前景。

高乌头药材中主要活性成分是二萜类生物碱，迄今从高乌头根中共分离鉴定了28种化合物，其中27种为二萜生物碱，如高乌碱甲(sinaconifinea)、高乌碱乙(sinaconitineb)、冉乌碱(ranaconitine)，去乙酰冉乌碱(n-deacetylranaconitine)、高乌宁甲(sinomontaninea)、高乌宁乙(sinomontanineb)、高乌宁己(sinomontaninef)、高乌宁辛(sinomontanineh)、刺乌宁(1appaconine)、刺乌定(lappaconidine)、excelsine、8-o-acetylexcelsine、高乌宁庚(sinomontanineg)、高乌宁丁(sinomontanined)、高乌宁戊(sinomontaninee)、高乌宁丙(sinomontaninec)、高乌宁壬(sinomontaninei)、高乌亭甲(sinomontanitinea)、高乌亭乙(sinomontanitineb)、septatisine、牛扁酸单甲酯(lycaconiticacidmonomethylester)、去亚甲光飞燕草碱(demethylenedelcorin)、硬飞燕草碱(18-omethylgigactonine)、来本宁(lepenine)、ranaconidine和n-(chloromethyl)taspine等。

目前，生物碱的提取方法很多，考虑到方法简便和节约生产成本，现有技术中也公开了一种新型的提取方法：超声波法，超声提取可以极大的提高提取效率，节约溶剂，缩短提取时间，因此在天然产物提取方面有着巨大的潜力。超声波法利用超声波辐射产生的强烈的空化效应、机械振动等多种作用对细胞膜的破坏，导致细胞破碎，有助于生物碱的溶出，同时通过超声波的振荡效应，增加物质分子运动速度有助于溶质扩散，同时增加了溶剂的穿透力，超声波的热效应加热提取剂，同时提高了提取剂的利用率，简单高效地促进了有效成分的提取。专利文献cn102617468a公开的一种超声辅助提取高乌甲素的方法，但是目前的超声波法提取生物碱的提取时间较长，能耗较大，而且提取率也有待于进一步的提高。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的上述不足而提供一种高乌头总生物碱的提取方法，该方法操作简单快捷，提取率高，速度快，效率高，节约能源。

本发明的技术方案是：一种高乌头中总生物碱的提取方法，包括以下步骤：

1)原料预处理：将高乌头粉末原料进行烘干和粉碎，产物过筛，取细粉作为原料进行提取；

2)超声提取：选用有机溶剂作为提取溶剂，先向提取溶剂中加入占提取溶剂总体积0.2％-0.5％的浓盐酸制得混合溶剂，然后将步骤1)所得的高乌头粉末与混合溶剂进行充分混合，静置浸泡10-40min后，超声反应0.5-2.5h,滤去不溶物，得滤液；

3)重复步骤2)的提取过程0-3次：每次提取完后过滤，滤渣再重复步骤2)的操作进行重复提取，合并几次提取滤液得最终滤液。

本发明进一步的技术方案是：所述步骤2)中高乌头粉末与混合溶剂按料液比为1:5-1:20g/ml进行充分混合，使用加入混合溶剂体积0.2％-0.4％的浓盐酸与乙醇混合的混合溶剂，高乌头总生物碱在酸性溶液里成盐，从而更易溶解于我们的提取溶剂，高乌头总生物碱在混合溶剂中溶解更快，提取更快更彻底。

进一步的，所述步骤2)中的超声反应在40-80℃下进行，在我们采用的较高提取温度下，较高温度可以提高高乌头总生物碱在采用的混合溶剂中的溶解度和提取速度。

进一步的，所述步骤2)中静置浸泡过程在20-35℃的温度下进行，在该温度下浸泡，使混合提取溶剂能充分渗透到药材颗粒中，溶剂进入药材颗粒内部后，进入的盐酸使高乌头中总生物碱成盐而更易溶于混合提取溶剂，有利于高乌头中总生物碱的提取。

进一步的，所述步骤2)中的有机溶剂为40-95％的乙醇。

高乌头中总生物碱的传统提取方法存在提取时间长，能耗高，提取率低等缺点，为了改善这些缺点，我们采用超声波提取法加独有工艺提取高乌头中的总生物碱，虽然现有技术中有超声波提取法的报道，但本发明对现有的提取工艺进行了改进，提取效果更好。

首先我们对高乌头药材进行烘干和粉碎，过200目筛，取200目细粉进行提取，由于高乌甲素等生物碱易溶于酸性溶液，提取前各提取溶剂中分别均加入0.2％-0.5％的盐酸，准确称取高乌头粉末5.0g于烧杯中，按料液比为1:10，分别加入甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷，在常温下(30℃左右)先浸泡20分钟，在50℃下分别进行超声提取1.0h，滤去不溶物，取滤液0.5ml定容至50ml容量瓶中，测量吸光度，得出最佳提取溶剂。根据回归方程c＝52.574a-0.9863计算测定液中的生物碱含量，再根据下式计算生物碱提取率：总生物碱提取率(％)＝c×50×10-4(g)/所用原料重量(g)×100％(式中：c表示计算出的高乌甲素浓度)，实验结果如下表1及附图1所示。

表1提取溶剂的选择

从表1及附图1可以看出：甲醇的提取效果比乙醇的效果好，乙醇的提取率为1.629％但由于甲醇毒性较高，故选择乙醇作为提取溶剂。在确定提取溶剂基础上再进行下述实施例的实验。

进一步的，所述步骤2)中的超声反应在超声反应仪中进行，超声功率为170-190w。

进一步的，所述步骤1)中的筛为150-250目筛，保证提取溶剂在高乌头药材颗粒中扩散较快。

上述步骤3)所得滤液中总生物碱提取率的测定方法为：取滤液0.5ml定容至50ml容量瓶中，采用紫外分光光度法测定滤液的吸光度a，根据回归方程c＝52.574a-0.9863计算测定滤液中总生物碱浓度c，再根据总生物碱提取率＝c×50×10^-4/所用原料重量×100％，计算得出步骤2)所得滤液中生物碱提取率；滤液吸光度a的测定过程在200-600nm波长范围内以2nm/s的扫描速度进行。

本发明与现有技术相比具有如下特点：本发明先提取溶剂中加入酸性试剂调节提取溶剂的ph值为酸性，然后加入原料进行浸泡一定时间，酸性混合提取溶剂能充分渗透到药材颗粒中，溶剂进入药材颗粒内部后，进入的盐酸使高乌头总生物碱成盐而更易溶于混合提取溶剂，使高乌头总生物碱在混合溶剂中溶解更快，提取更快更彻底，有利于后续高乌头总生物碱的提取，浸泡后再在40-80℃下进行超声提取，较高温度可以提高高乌头总生物碱在采用的混合溶剂中的溶解度和提取速度，通过这些优化的组合工艺，不仅总的制备时间较短(不超过4h)，而且最终得到的产物高乌头总生物碱的提取率较高。

以下结合附图和具体实施方式对本发明的详细工艺过程作进一步描述。

附图说明

图1为本发明中溶剂种类对总生物碱提取率影响的比较图；

图2为本发明实施例1中超声时间对总生物碱提取率影响的比较图；

图3为本发明实施例2中提取温度对总生物碱提取率影响的比较图；

图4为本发明实施例3中提取剂浓度对总生物碱提取率影响的比较图；

图5为本发明实施例4中料液比对总生物碱提取率影响的比较；

图6为本发明具体实施方式中高乌头中总生物碱浓度与吸光度之间关系的标准曲线图。

具体实施方式

实施例1：

准确称取上述处理的150目高乌头粉末5.0g于烧杯中，按料液比为1:10g/ml，分别加入上述选定的最佳提取溶剂，加入0.2％的盐酸，经20℃浸泡30min等预处理后，再在50℃下分别进行超声提取0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h，滤去不溶物，取滤液0.5ml定容至50ml容量瓶中，测量吸光度，得出最佳超声时间。根据公式c＝52.574a-0.9863计算总生物碱的提取率。实验结果如下表2及附图2所示：

表2超声时间的影响

从表2及附图2可以看出：提取时间为2小时得到的总生物碱提取率2.167％是最高的，远超过0.5小时但对比1小时和1.5小时的提取率略高。随着振动时间的延长，细胞破壁完全，所以提取率也随之提高。从节约时间和燃料、人力等方面综合考虑，选择1小时为最佳提取时间。

实施例2：

准确称取述处理的200目高乌头粉末5.0g于烧杯中，按料液比为1:10g/ml，分别加入选定的最佳提取溶剂，加入0.3％的盐酸，经30℃浸泡20min等预处理后，再分别在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃下分别进行超声提取1.0h，滤去不溶物，取滤液0.5ml定容至50ml容量瓶中，测量吸光度，得出最佳超声温度。根据公式c＝52.574a-0.9863计算总生物碱的提取率。实验结果如下表3及附图3所示：

表3提取温度的影响

从表3及附图3可以看出：提取温度为70℃得到的总生物碱提取率是最高的，较高温度下生物碱溶解能力增强，选择70℃为最佳提取时间。

实施例3：

准确称取述处理的220目高乌头粉末5.0g于烧杯中，按料液比为1:10g/ml，分别按上述最佳提取条件，分别选择40％、60％、80％、90％、95％浓度的乙醇溶液，加入0.5％的盐酸，经25℃浸泡35min等预处理后，再分别进行超声提取1.0h，滤去不溶物，取滤液0.5ml定容至50ml容量瓶中，测量吸光度，得出最佳提取剂浓度。根据公式c＝52.574a-0.9863计算总生物碱的提取率。实验结果如下表4及附图4所示：

表4提取剂浓度的影响

从表4及附图4可以看出：随着乙醇浓度的增高，得到的总生物碱提取率也逐渐增加，在乙醇浓度为80％时达到峰值；其后总生物碱提取率反而随乙醇浓度增大而下降。适宜浓度的乙醇对生物碱的提取有促进作用，根据相似相溶原理，乙醇浓度为80％时其极性与可能溶质极性较为相似而达到最大溶出度，故选择80％为最佳提取浓度。

实施例4：

准确称取述处理的180目高乌头粉末5.0g于烧杯中，按料液比为1:5g/ml、1:10g/ml、1:15g/ml、1:20g/ml，分别加入上述最佳提取溶剂(即80％乙醇)即80％乙醇，加入0.4％的盐酸，经28℃浸泡40min等预处理后，再70℃超声提取60min，滤去不溶物，取滤液0.5ml定容至50ml容量瓶中，为研究料液比的影响故稀释滤液，测量吸光度，得出最佳料液比。根据公式c＝52.574a-0.9863计算总生物碱提取率。实验结果如下表5及附图5所示：

表5料液比的影响

从表5及附图5可以看出：在提取前期，随着料液比增大，总生物碱提取率升高，提取溶剂对药材的渗透作用越充分，当料液比1:10g/ml时，总生物碱提取率最高，由于料液比太大，会导致提取液体积过大给后续分离纯化工作带来困难，故选择1:10g/ml为最佳料液比。

实施例5：

准确称取述处理的200目高乌头粉末5.0g于烧杯中，按料液比为1:10g/ml，加入80％乙醇，加入0.3％的盐酸，经35℃浸泡10min等预处理后，再70℃超声提取1.0h，滤去不溶物，取滤液0.5ml定容至50ml容量瓶中，测量吸光度，计算总生物碱提取率，确定最佳提取次数。

表6提取次数的确定

从表6中可以看出，随着提取次数的增加，总生物碱提取率也呈上升趋势，当提取第三次时达到最高提取率，而后提取四次、五次时总生物碱提取率有所下降，考虑到生产成本，因此我们选择连续提取次数为三次。

正交实验：

超声波辅助提取高乌头总生物碱是由多种因素相互作的一个复杂过程，为了更好的探讨各个因素对生物碱提取量的影响，明确超声波辅助法提取高乌头生物碱最佳工艺，采用正交试验的方法来建立相关的萃取模型，考察各个影响因素的交互作用。根据单因素试验结果，确定超声波辅助提取高乌头总生物碱正交试验因素水平范围如下表所示：

表7因数水平表

表8正交试验结果

由表7和表8可知，根据极差r的大小，进行因素影响的主次排序，r越大，该因素对实验的影响越大。c因素提取剂浓度对总生物碱提取率影响最大，其次是提取时间、料液比，提取温度对总生物碱提取率影响最小。最优水平为a因素即提取时间以1.0h为宜，b因素即提取温度以60℃为宜，c因素提取剂浓度以80％(加入0.2％-0.5％的盐酸)为宜，d因素即料液比以1:15g/ml为宜，提取前浸泡20分钟，提取3次，在此最优条件下，高乌头总生物碱提取率为2.367％。

验证实验：

根据上述正交实验结果得到的最佳工艺结果进行验证实验三次，称取上述处理的200目干燥的高乌头粉末5.0g，加入80％乙醇溶液(加入0.2％-0.5％的盐酸)，提取时间为1.0h，提取温度以60℃，料液比以1:15g/ml,提取前浸泡20分钟，每一实验提取3次，在此条件下，提取率平均为2.409％。

由上述实施例、正交实验和验证实验可以看出，本发明不仅工艺简单、更能高效地提取高乌头中总生物碱，为高乌头的工业生产奠定了基础，还具有生产周期短、成本低和提取率高的特点，可以大规模生产。

上述实施例均采用高乌头中总生物碱为对照品，用紫外分光光度法对高乌头提取液中总生物碱含量进行测定，为总生物碱提取过程中的跟踪监测提供简便可靠的检测，并对产品的实际品质检测提供精确高效的方法；而且上述实施例均包含下述过程：

(1)标准溶液的配制

精确称取高乌头中总生物碱标准品15mg于50ml的容量瓶中，加适量甲醇溶液溶解，完全溶解并定容制得贮备液(0.3mg/ml)。精密吸取该标准品1ml，置于10ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制得浓度为30μg/ml的高乌头中总生物碱标准溶液。

(2)最适波长的选择

取上述标准溶液2ml，以甲醇作空白对照，用紫外可见分光光度计在波长200～600范围内以2nm为间隔单位进行扫描，实验扫描结果可知，溶液在波长为252～254nm处有最大吸收峰，确定最大吸收波长为252nm。

(3)标准曲线的制作

精密称取高乌头中总生物碱标准品50.5mg，置50ml量瓶中，用甲醇溶解并定容制得贮备液，精密吸取该对照品溶液，置于50ml量瓶中，用甲醇定容至刻度。分别吸取此液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0ml置于10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，以甲醇为空白，在252nm波长处测定吸光度。

用浓度对吸光度进行线性回归，回归方程为：c＝52.574a-0.9863,r²＝0.9988，对照品溶液在4.37-39.86μg/ml范围内成线性关系，如图6所示。

取样品溶液在室温，避光放置0、20、24、41h，在252nm波长处测定吸光度，结果表示稳定性良好。

(4)高乌头提取液中总生物碱含量测定

准确高乌头粉末5g，加入适量的提取溶剂，用超声波辅助提取法进行提取，过滤后，吸取0.5ml滤液，加入提取溶剂定容到50ml的容量瓶中，在最适波长处测吸光度，将测得值代入标准曲线的回归方程，求出提取液中总生物碱的浓度c(μg/ml)，并按下式计算高乌头中总生物碱的提取率：

总生物碱提取率(％)＝c×50×10-4(g)/所用原料重量(g)×100％，上式中：c表示计算出的总生物碱浓度。

对比例1：

准确称取高乌头粉末5.0g于烧杯中，提取溶剂为50毫升的50-90％乙醇，也同时35℃浸泡30分钟，随后用加热回流提取三次，合并三次滤液并浓缩到5050ml，取滤液0.5ml定容至50ml容量瓶中，测量吸光度，计算提取率。重复三次实验，计算平均提取率为1.143％，比我们超声波提取的得率(2.367％)低51.71％，传统加热回流提取时间长，每次提取2小时，总共需要花费6小时提取，提取时加温到90℃左右，高乌头总生物碱因长时间加热破坏，因而提取率远低于我们超声波提取的提取率，同时能耗大于超声波提取(60℃)的能耗，超声波提取三次只要3小时，提取时间为传统加热回流提取的1/2，而且提取温度低(60℃)，因而微波提取具有高效节能、周期短、综合成本低、提取率高等明显优势。