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：世界卫生组织将益生菌定义为“当以足够量施用时，给予宿主健康益处的活性微生物”；并且之后建立的联合国粮食及农业组织/世界卫生组织联合委员会(fao/who)使用这样的定义来建立用于食品中益生菌的评估的具体指导方针(1)。在“对食品和有效益生菌的基本要求是什么”上已经有很多讨论了，而通常可总结如下：-益生菌在施用时必须是活的，所以关键的必要条件是在生产过程中、即培养过程中，它们的耐受力(endurance)和存活能力尽可能多；-下一个必要条件是益生菌细胞耐受运输和储存时间的能力。运输和储存对于微生物而言均代表着应激期(stressfultimes)，微生物可能会因这些阶段而受到严重损害和削弱；显然，益生菌细胞越强，它们就越有活力；-即使在满足前两个必要条件时，下一个条件也是绝对必要的：你可以设法摄取仍然存活的益生菌培养物，但是除非它的益生菌细胞能够在通过人类胃肠道后幸存下来，否则那些益生菌将因受胃酸或受胆汁破坏而成为无用的；-最后，即使假设液体或粉末形式的益生菌培养物到达肠道，下一个必要条件是它的有效地与诸如大肠杆菌或白色念珠菌的病原生物竞争而附着到肠壁并适当地定殖于小肠和/或结肠的能力。已经寻求了各种用于增加生长和存活率(viability)以及酸/胆汁耐受能力和抗微生物活性(anti-microbialactivity)的方法。益生菌主要属于作为平衡肠道微生物群的健康促进细菌的、乳酸杆菌属和双歧杆菌属(2,3)，并且能够通过产生有机酸、细菌素、过氧化氢来抑制多种病原体的生长(4)。除了益生菌的评估和识别新益生菌微生物的方法的发展之外，益生元的概念已经变得重要。益生元被定义为不易消化的食物成分，其通过选择性地刺激结肠中的一个或有限数量的细菌的生长和/或活性来有益地影响宿主(5)。主要的益生元是不易消化的食物碳水化合物，例如纤维、包括低聚果糖(fos)和低聚半乳糖(gos)的低聚糖、抗性淀粉、以及由人类消化而产生并由微生物作为能量的来源利用的蛋白质或多肽(6)。此外，有证据表明益生元能够帮助调节肠道微生物群的生长并刺激益生菌菌株(例如乳酸菌，lacticacidbacteria,lab)产生细菌素(bacteriocin)(7,8,9)。益生元能够影响益生菌的代谢活动；它们的组合，称为“共生”，有利于肠道益生菌的定殖并改善人类生活的质量(10)。事实上，共生菌(symbiotics)已经被证明在溃疡性结肠炎患者(11)中、在结直肠癌预防(12)或微生物群的一般正调节(13)中，比单独的益生菌或益生元更为有效。在新的共生菌产品的开发期间，评估益生元和益生菌相互作用以及益生元对益生菌生长和抗菌活性的影响是非常重要的。最近的研究集中于由益生元菌株与低聚糖(14,15)或其他天然化合物(16)联合所构成的共生菌。旨在获得协同效应的共生菌组合的新方法可以考虑蓝绿藻(blue-greenalgae)中含有的物质，该物质富含类胡萝卜素、叶绿素、藻蓝蛋白(phycocyanin)和许多其他生物活性成分。实际上，本发明的核心在于藻蓝蛋白的用途，尤其是来自、但不限于微藻类水华束丝藻(aphaizomenonflosaquae)菌株的特定菌株。我们将证明，事实上藻蓝蛋白单独、或与整个蓝藻(wholecyanobacteria)水华束丝藻组合在向乳酸杆菌的生长和活性提供所需支持上，比任何其他整个微藻均表现得更好。已经对作为益生菌培养物的添加物的螺旋藻或小球藻的使用进行了研究(17)。在添加和不添加3mg干燥的螺旋藻(s.platensis)/毫升生物质的情况下，它们生长出了嗜热链球菌(s.thermopiles)th4、l乳酸菌(l.lactic)c2和德氏乳杆菌(l.delbrueckii)yl1。四小时后，与对照相比，在ph6.8下，螺旋藻的乳酸菌生长促进对c2为13.42％、对yl1为9.29％、对th4为8.22％。八小时后，对于c2、yl1和th4，增加量分别为3.46％、9.73％和7.76％，且这可能是由于刺激因子的量的减少所致。用螺旋藻处理的三种菌株在10小时时达到稳定期，并且菌数在长达20小时内保持相同，而没有螺旋藻添加的相同菌株生长更为缓慢并在长达20小时内持续生长，达到与补充的菌株相同的值，这意味着螺旋藻向生长培养基中的添加不会真正显著地影响益生菌菌株的生长和存活率。molanar等人(18,19)研究了螺旋藻生物质对嗜温乳酸菌(mesophiliclacticacidbacteria)的单菌株的影响。以3g/dm3的比率使用的螺旋藻显著增加了(p<0.05)嗜温乳酸菌的各种菌株的酸产量。在4±2℃冷藏的前两周期间，螺旋藻生物质显著增加了(p<0.05)产品中嗜温起子乳酸菌的存活率。然而，此后存活率的百分比下降。在另一项研究(20)中，当用嗜热链球菌和双歧杆菌(b.bifidum)或动物双歧杆菌(b.animalis)的混合培养物接种牛奶时，螺旋藻生物质对双歧杆菌或动物双歧杆菌的发酵活性或生长均没有表现出影响。关于保加利亚乳杆菌(l.bulgaricus)的活细胞数的数据通常显示出一些波动，并且在通常结果中，尽管对存活率是积极的，但也有些是矛盾的(21)。最后，由于只有部分积极和矛盾的结果，所以已经证明添加整个螺旋藻或小球藻以促进益生菌菌株的生长和存活率的有用性是值得怀疑的，特别是考虑到“…该添加会对最终产品的感官属性产生不利影响”。对于微藻作为共生药剂的影响，并没有更多的研究，并且“…微藻的添加对益生菌的体内存活率(而不是产品内评估)以及对益生菌活性(不仅评估活菌数)的影响是可以考虑的、重要的且几乎没有被研究的课题”(22)。发明描述本发明依赖以下发现：向生长有益生菌菌株的培养基添加单独的或与整个水华束丝藻微藻一起的从任何蓝藻微藻(无论蓝藻的来源是什么，藻蓝蛋白是十分相似的)纯化或浓缩的特定蓝藻色素藻蓝蛋白，增加了益生菌菌株的生长能力和存活率、以及它们的健康增强特性。蓝藻水华束丝藻(afa)是一种淡水单细胞蓝绿藻，其作为营养密集的食物来源并因其健康增强特性而被消耗(23、24、25)。诸如收获于上克拉马斯湖(俄勒冈州，美国)的水华束丝藻(afa)含有大量营养物质(维生素、矿物质、氨基酸、efa)，这些营养物质可以为活的益生菌提供更好的营养。此外，afa还含有特定分子，例如特定类型的藻蓝蛋白，其特征还在于藻红蓝蛋白(phycoerythrocyanin)(26)以及存在于所有藻类中的诸如类菌胞素氨基酸(mycosporine-likeaminoacids,maas)的其他抗氧化分子的存在，藻红蓝蛋白与所有藻蓝蛋白一样，具有显著的抗氧化(27)和抗炎(28)特性。这些抗氧化特性可有助于在生长、储存和胃肠道通过阶段中保护细菌。此外，相对于其他微藻，afa具有很大的优势：其ph非常中性(约6.4)，且其一般的风味和味道也非常中性，使其成为益生菌饮料、酸乳和其他食品的添加剂的更好的候选物。afa提取物和纯化的afa-pcs的制备为了测试整个afa藻类、afa提取物及其藻蓝蛋白(phycocyanin)的促进益生菌的生长和健康增强特性的能力，我们设定了一系列的特定实验。我们从干粉形式的整个水华束丝藻(afa微藻)开始，然后我们继续生产两种不同的物质：a)蓝色提取物(blueextract)，通过以下方法生产：将整个afa悬浮在水中，使其在水中停留12小时，从而使蓝色液体从绿褐色沉积物分离；然后通过移液管收集蓝色上清液；然后继续将液体储存在2℃至4℃的冷藏条件下。蓝色上清液的分光光度分析显示了pc在620nm处的特征峰(24)。该提取物具有约25％藻蓝蛋白的浓度；b)通过标准纯化方法生产的纯化的afa-藻蓝蛋白：我们取部分先前生产的蓝色提取物，我们首先将其溶解在ph7.4的磷酸盐缓冲液(pbs)中(浓度10mg/ml)，并在4℃、2500×g下离心10分钟，从而去除任何不溶材料。随后，将如此获得的提取物干燥，然后通过如前所述的使用羟基磷灰石柱的一步色谱法(bio-radlaboratories，ca，usa)(24、25)来纯化蓝pc。最后将纯afa-pc(pureafa-pc)(a620/a280比例为4.78)储存在-20℃下。对于该特定的益生元测试，将整个afa重新悬浮在无菌蒸馏水中，并使用不同孔径的过滤器过滤，首先是200微米、随后是0.45微米和0.22微米(millipore，milan，italy)，具有用于所有实验中的最终浓度6％(w/v)。类似地，将总的蓝色提取物和纯afa-pc重新悬浮在无菌蒸馏水中，用0.22微米膜孔径(millipore)过滤，并以2％(w/v)的最终浓度用于所有实验中。细菌菌株和培养条件总共使用了四种不同的乳酸菌(lab)：被最广泛测试的菌株嗜酸乳杆菌dds-1(29,30)、鼠李糖乳杆菌atcc53103、双歧杆菌atcc29521和嗜酸乳杆菌atcc4356。在微需氧条件(5％o2、10％co2、85％n2)下，菌株在37℃下在manrogosaandshape琼脂(mrs)(oxoid，milan，italy)中常规生长24-48小时。在该研究中使用了三种人类参考病原体：大肠杆菌o157：h7atcc35150、白色念珠菌atcc14053和金黄色葡萄球菌atcc43387。将菌株分别在37℃下常规维持在胰蛋白酶大豆琼脂(tsa，oxoid)和沙氏(sabouraud)葡萄糖琼脂(liofilchem，rosetodegliabruzzi，italy)中。将每种菌株的原种培养物(stockculture)在-80℃下保持在含有15％甘油的营养肉汤(oxoid)中。lab菌株在补充有afa或其提取物的液体培养基中的生长能力。测定了afa或其提取物对嗜酸乳杆菌dds-1、鼠李糖乳杆菌atcc53103、双歧杆菌atcc29521和嗜酸乳杆菌atcc4356的生长能力的影响。为此，将每种微生物的过夜指数培养物(106cfu/ml)在微需氧条件下、在37℃下在三个不同的具有整个afa、蓝色提取物或纯pc的mrs肉汤(oxoid)的200ml等分试样中各自温育24小时。用嗜酸乳杆菌dds-1、鼠李糖乳杆菌atcc53103、双歧杆菌atcc29521和嗜酸乳杆菌atcc4356接种的mrs肉汤被列为对照。在确定的时间点(0、3、6、9、14、24、30、48、54、57、72小时)，从各mrs肉汤培养物中无菌取出等分试样，稀释在生理盐水溶液中并涂布在mrs琼脂(oxoid)上。在微需氧条件下于37℃温育24小时后，观察平板用于菌落形成单位(cfu/ml)的计数。所有数据表示为一式两份进行的三次独立实验的平均值。嗜酸乳杆菌dds-1(la-dds1)在补充有afa或其提取物的液体培养基中对人工胃肠道疾病的抗性。在mrs肉汤(oxoid)中检测la-dds1的耐酸性，用盐酸(hcl)调节至最终ph2.5。简而言之，菌株在微需氧条件下于37℃在mrs肉汤中增殖24小时，通过离心(3500rpm、10分钟)收取，并在ph7.2的磷酸盐缓冲盐水(pbs)中洗涤两次。然后，将细菌悬浮液接种(10％)到三个不同的具有整个afa、蓝色提取物或纯pc的酸化mrs肉汤的等分试样中，并在37℃下温育1小时、2小时和3小时。酸化的mrs肉汤中的嗜酸乳杆菌dds-1被列为对照。在各时间点，无菌取出等分试样、稀释在生理盐水溶液中、涂布在mrs琼脂(oxoid)上并在微需氧条件下于37℃温育24小时用于随后的平板计数(cfu/ml)。执行相同的工序以测试胆汁耐受性，将la-dds1菌株接种到含有0.3％(w/v)胆汁盐(difco，bectondrive，usa)的mrs肉汤中，其中含有上述浓度的整个afa、蓝色提取物或纯pc。具有0.3％(w/v)胆汁盐的mrs肉汤中的嗜酸乳杆菌dds-1被列为对照。温育在37℃下进行1小时、2小时和3小时。如上所述计算活菌细胞的数量。所有数据表示为一式两份进行的三次独立实验的平均值。嗜酸乳杆菌dds-1(la-dds1)在补充有整个afa、蓝色提取物或纯pc的液体培养基中的无细胞培养上清液、以及鼠李糖乳杆菌atcc53103和双歧杆菌atcc29521在补充有纯pc的液体培养基中的无细胞培养上清液的制备。嗜酸乳杆菌dds-1在微需氧条件下于37℃在200ml的mrs肉汤(oxoid)或具有整个afa、蓝色提取物或纯pc的mrs肉汤中生长18小时。其他三种菌株遵循相同的工序，但它们生长在仅含有纯afa-pcs的mrs肉汤中。在细菌生长的确定的时间点(从24小时到120小时)，将来自各mrs肉汤培养物的细胞在4℃下以17000rpm沉积(pelleted)15分钟，用10nnaoh调节至ph6.5并过筛(0.22μm孔径)，以便去除任何残留细菌。将无细胞培养物上清液(cfcss)收集并如下命名：afa-cfcs(来自生长于具有6％afa的mrs肉汤中的嗜酸乳杆菌dds-1)、蓝色cfcs(来自生长于具有2％蓝色提取物的mrs肉汤中的嗜酸乳杆菌dds-1)。至于纯pcs-cfcs，我们有四种不同的组，四种菌株：嗜酸乳杆菌dds-1(la-dds1)、鼠李糖乳杆菌atcc53103(lr)、双歧杆菌atcc29521(bb)和嗜酸乳杆菌atcc4356(la)各自生长于具有2％纯pcs的mrs肉汤中，也包括从生长于mrs肉汤中的四种lab各自提取的cfcs，并将其标记为la-dds1-cfcs、lr-cfcs、bb-cfcs和la-cfcs。然后将各cfcs的等分试样保持在-20℃直至使用。通过琼脂扩散法的嗜酸乳杆菌dds-1的各种cfcs的抗微生物易感性。根据已知方法(31)以及几种修改，使用琼脂扩散方法(agarwelldiffusionmethod，awdm)测试la-dds1+afa-cfcs、la-dds1+blue-cfcs和la-dds1-afa-pcs-cfcs的抗微生物活性(antimicrobialactivities)。简而言之，从大肠杆菌o157：h7atcc35150和白色念珠菌atcc14053的各平板抽取几个菌落，加入到30ml的tsb(oxoid)并在37℃下温育24小时。此时，将500μl的各病原体培养物(107cfu/ml)加入到维持在50℃的20ml营养琼脂(oxoid)中，倒入培养皿中，并使其固化20分钟。在琼脂上用无菌不锈钢圆筒制备直径为6mm的孔板(well)，并将50μl的各cfcs滴入孔中；将整个afa、蓝色提取物或纯afa-pcs(各50μl)也滴入到几个孔中，从而排除它们的抗微生物活性；la-dds1-cfcs也被列为对照。在37℃下的24h温育后，测量各孔周围的抑制区的直径并将抗微生物活性表示为各cfcs产生的抑制直径的平均值。所有实验均一式两份地进行。通过灭杀研究的la-dds1的不同cfcs的抗微生物活性。通过时间灭杀研究检测不同的la-dds1-cfcs对大肠杆菌o157：h7atcc35150和白色念珠菌atcc14053的抗微生物活性。在两个实验的每一个中，从生长于mrs肉汤中的特定la-dds1提取的la-dds1-cfcs作为对照。在用或不用500μl的la-dds1-afa-cfcs、la-dds1-blue-cfcs和la-dds1-pure-afa-pcs-cfcs的情况下，在37℃下温育各细菌病原体(108cfu/ml、500μl)的指数培养物。在2小时、4小时和8小时的温育后，将等分试样无菌取出、稀释在生理盐水溶液中、涂布在tsa(oxoid)和沙氏葡萄糖琼脂(liofilchem)上并在37℃下温育24小时。温育期之后，观察平板并计数各病原体的每毫升菌落形成单位(cfu/ml)。所有数据表示为三次独立实验的平均值。该测试一式两份地进行。使用时间灭杀研究的三种其他lab的afa-pc-cfcs的抗微生物活性。这次通过时间灭杀研究检测lr-afa-pc-cfcs、bb-afa-pc-cfcs和la-afa-pc-cfcs对三种不同的致病菌株(pathogenicstrain)，即大肠杆菌o157：h7atcc35150、金黄色葡萄球菌atcc43387和白色念珠菌atcc14053的抗微生物活性。简而言之，在用或不用500μl的pure-pc-cfcss的情况下，在37℃下温育各细菌病原体(108cfu/ml、500μl)的指数培养物。在2小时、4小时和8小时的温育后，将等分试样无菌取出、稀释在生理盐水溶液中、涂布在tsa(oxoid)和沙氏葡萄糖琼脂(sda)(liofilchem)上并在37℃下温育24小时。温育期之后，观察平板并计数各病原体的每毫升菌落形成单位(cfu/ml)。统计分析使用prism5.0版(graphpadsoftware，inc.，lajolla，ca，usa)进行统计学分析。在进行分析之前检查参数测试的假设。当未考虑参数测试的假设时，应用mann-whitney或kruskall-wallis非参数测试和dunn多重比较测试。p值小于0.05被认为是统计学显著的。结果afa及其提取物对嗜酸乳杆菌dds-1的生长能力的影响。与整个afa(6％w/v)、afa蓝色提取物(2％w/v)和pure-pc(2％w/v)对嗜酸乳杆菌dds-1的生长能力的影响有关的数据如图1所示。结果显示，含有afa或其提取物的培养基刺激了嗜酸乳杆菌dds-1的生长；事实上，在mrs肉汤中，嗜酸乳杆菌dds-1在48小时的温育后停止生长，而在补充的mrs肉汤中，其生长能力延长至72小时。有趣的是，在含有2％pure-pc的mrs肉汤中观察到更高的生长刺激，72小时后cfu/ml值为5×107。afa及其提取物对其他三种lab的生长能力的影响。关于afa(6％w/v)、蓝色提取物(2％w/v)和pure-pc(2％w/v)对不同lab的生长能力的影响的数据如图2、3、4所示：图2中对鼠李糖乳杆菌atcc53103的影响、图3中对双歧杆菌atcc29521的影响、图4中对嗜酸乳杆菌atcc4356的影响。含有afa或其提取物的培养基显示出尤其刺激鼠李糖乳杆菌atcc5310和双歧杆菌atcc29521的生长。实际上，虽然鼠李糖乳杆菌atcc53103在mrs肉汤中温育96小时后降低了生长，但在补充的mrs肉汤中其生长能力延长至384小时，在含有2％pure-pc的mrs肉汤中观察到了最高的生长刺激(4.3×106cfu/ml)。类似地，在补充有afa或其提取物的mrs肉汤中，双歧杆菌atcc29521的生长延长至346小时，而在标准mrs肉汤中在120小时时降低了生长。在嗜酸乳杆菌atcc4356的情况下观察到较小的影响，在全部检查的生长期间，在含有afa或其提取物的mrs肉汤中和mrs肉汤中，cfu/ml值非常相似。afa及其提取物对la-dds1的酸和胆汁耐受性的影响。益生菌必须具有对低ph和胆汁盐的抗性，以便存活到胃中并发挥其促进健康的益处。这里，我们仅测试了所提及的浓度的整个afa、其蓝色提取物和pure-pc对嗜酸乳杆菌dds-1的胆汁和酸耐受性的影响。数据如下面的表1所示：在酸和胆汁培养基中的la1如所报道的，嗜酸乳杆菌dds-1对低ph和0.3％胆汁盐在直至3小时内具有抗性，其值分别为2.19×108和1.17×108cfu/ml。afa或其提取物在培养基中的存在确实对嗜酸乳杆菌dds-1对模拟胃病的存活有一定影响。虽然效果并不剧烈，但相对显著。关于酸性条件(ph2.5)，虽然保持在相同的指数级108中，但la-dds1通过自身在3小时后从5.01×108下降至2.19×108cfu/ml，用2％pure-pc生长3小时后实际上增加到6.61×108cfu/ml。关于胆汁盐，实际上整个afa藻类表现最佳：la-dds1通过自身从3.24×108cfu/ml减少到1.17×108cfu/ml，当用6％afa-藻类生长时，它实际上增加到8.32×108cfu/ml。嗜酸乳杆菌dds-1的cfcss的抗微生物活性通过在最后一种情况中使用两种不同实验设计的awdm和灭杀研究，测试afa-cfcs、blue-cfcs和pure-pc-cfcs对大肠杆菌o157：h7atcc35150和白色念珠菌atcc14053的抗微生物活性。关于awdm，对于针对大肠杆菌o157：h7atcc35150和白色念珠菌atcc14053的所有测试的cfcs，观察到了显著的抑制区。然而，afa或其提取物在嗜酸乳杆菌dds-1的培养基中的存在增强了相对提取的cfcs的抗微生物效果。在分别填充有afa、蓝色提取物或pure-afa-pc溶液的孔周围没有观察到抑制区，如下面表2所示：灭杀研究的第一次测试的结果如图5(a-b)所示。数据显示，如报道的、低于用对照la-cfcs获得的cfu/ml值所示，afa、蓝色提取物或pure-pc在培养基中的存在已经使嗜酸乳杆菌dds-1cfcss对大肠杆菌o157：h7atcc35150(图5a)的抗微生物效力最大化。特别地，在用pure-pc-cfcs温育8小时后，与用la-cfcs获得的2.50×107cfu/ml相比，cfu/ml达到了7.70×106的值。类似地(图5b)，当用afa-cfcs、blue-cfcs和pure-pc-cfcs温育白色念珠菌atcc14053时，观察到了对嗜酸乳杆菌dds-1的抗微生物特性的积极影响。具体地，与用la-cfcs获得的1.70×107cfu/ml相比，用pure-pc-cfcs的8小时温育后，被证明降低量多达4.97×106cfu/ml。灭杀研究的第二次实验设计的结果，表示为病原体生长的对数减少，如下面表3a-b所示：表3a表3b在这种情况下，由于在第一个实验中，pure-pc在刺激嗜酸乳杆菌dds-1的生长和抗微生物活性中表现出最令人关注的结果，因此，在2小时、4小时和8小时对大肠杆菌o157：h7atcc35150和白色念珠菌atcc14053的温育后，通过灭杀实验检测在不同时间点(0、4、6、8、12、24、28、30、48、54、57、72小时)提取的总共24个cfcs(12个提取自生长于mrs肉汤中的嗜酸乳杆菌dds-1、和12个在具有pure-pc的mrs肉汤中)。关于大肠杆菌0157：h7atcc35150(表3a)，在2小时的灭杀温育后，用24小时的时间点提取的pure-afa-pc-cfcs观察到对数减少2.56，而使用相应的对照la-cfcs，则证明了更小的减少(1.69)。类似地，在用24小时时间点提取的pure-afa-pc-cfcs的4小时和8小时温育之后，证明了分别增大的对数减少3.8和4.43。在从26小时至57小时的时间点提取的pure-afa-pc-cfcss的抗微生物活性仍然明显，对数减少高于相应的la-cfcss。特别地，对比于相应的la-cfcs的1.77对数减少，用在57小时时间点提取的pure-afa-pc-cfcs的4小时温育后，观察到对数减少2.96。类似地，在8小时灭杀后，与用相应的la-cfcs观察到的1.39相比，用57小时时间点提取的pure-afa-pc-cfcs获得对数减少3.65。关于白色念珠菌atcc14053，相关数据总结在表3b中。如对大肠杆菌o157：h7atcc35150所观察到的，在用24小时时间点提取的pure-afa-pc-cfcs的2小时灭杀温育后，记录了对数减少3.74，高于用相应的la-cfcs所获得的1.60对数减少。类似地，在用48小时时间点提取的pure-pc-cfcs的4小时和8小时温育后，观察到生长减少分别为3.34和3.23。在较晚的时间点(从54到72小时)提取的pure-pc-cfcs显示出对数减少逐渐降低，与相应的la-cfcs相比，在任何情况下都保持更高。三种乳酸菌的pure-pc.cfcs的抗微生物活性通过时间灭杀研究，测试了不同pure-pc-cfcs对大肠杆菌o157：h7atcc35150、金黄色葡萄球菌atcc43387和白色念珠菌atcc14053的抗微生物活性。表示为病原体生长的对数减少的第二次时间灭杀研究实验设计的结果如表4a、b、c所示(pure-pc表示为“phyco”)。该研究中，通过pure-pc-cfcs增强了鼠李糖乳杆菌atcc53103、嗜酸乳杆菌atcc4356和双歧杆菌atcc29521对不同病原体的抗微生物活性。事实上，使用cfcss(在补充有pure-pc的mrs肉汤中的温育期间的不同时间点提取)进行的实验中，鼠李糖乳杆菌atcc53103和双歧杆菌atcc29521的抗微生物特性随时间被最大化。一个明显的例子是下表4a中pure-pc-cfcss对大肠杆菌0157：h7atcc35150的影响(“phyco”代表“pc”)：用在24小时时间点提取的鼠李糖乳杆菌atcc53103的pure-pc-cfcs的4小时温育后观察到对数减少2.53，而使用相应的cfcs对照则获得了更小的对数减少(2.28)。类似地，用在24小时时间点提取的鼠李糖乳杆菌atcc53103的pure-pc-cfcs的8小时温育后，观察到了增大的对数减少(4.5log)。在48小时和120小时时间点提取的pure-pc-cfcs的抗微生物活性仍然明显，具有比用相应的cfcs所获得的对数减少更高的对数减少。用双歧杆菌atcc29521的pure-pc-cfcss观察到了相同的趋势。此外，pure-pc-cfcs对金黄色葡萄球菌atcc43387的影响是明显的，如下面表4b所示(“phyco”代表“pc”)：与使用相应的cfcs对照所获得的1.97相比，用在48小时时间点提取的鼠李糖乳杆菌atcc53103的pure-pc-cfcs的4小时温育后，观察到了对数减少2.27。类似地，用在120小时时间点提取的鼠李糖乳杆菌atcc53103的pure-pc-cfcs的八小时温育后，观察到了对数减少2.75。用双歧杆菌atcc29521的pure-pc-cfcs证明了相同的趋势。白色念珠菌atcc14053的数据总结在下面表4c中(“phyco”代表“pc”)。革兰氏阴性loglog减少loglog减少白色念珠菌对照6,247,05白色念珠菌+cfcs鼠李糖乳杆菌t244,821,415,641,42白色念珠菌+cfcs鼠李糖乳杆菌t484,122,114,082,98白色念珠菌+cfcs鼠李糖乳杆菌t1203,522,724,003,05白色念珠菌+cfcs-phyco鼠李糖乳杆菌t243,672,573,853,21白色念珠菌+cfcs-phyco鼠李糖乳杆菌t483,432,813,433,63白色念珠菌+cfcs-phyco鼠李糖乳杆菌t1204,122,113,823,23白色念珠菌+cfcs嗜酸乳杆菌t244,122,115,081,98白色念珠菌+cfcs嗜酸乳杆菌t483,013,220,007,05白色念珠菌+cfcs嗜酸乳杆菌t1202,523,713,123,93白色念珠菌+cfcs-phyco嗜酸乳杆菌t243,702,544,902,15白色念珠菌+cfcs-phyco嗜酸乳杆菌t483,642,603,643,42白色念珠菌+cfcs-phyco嗜酸乳杆菌t1205,560,673,223,83白色念珠菌+cfcs双歧杆菌t244,122,114,372,69白色念珠菌+cfcs双歧杆菌t483,302,943,523,54白色念珠菌+cfcs双歧杆菌t1205,560,673,283,78白色念珠菌+cfcs-phyco双歧杆菌t243,372,873,004,05白色念珠菌+cfcs-phyco双歧杆菌t483,223,023,223,83白色念珠菌+cfcs-phyco双歧杆菌t1205,001,243,223,83如对大肠杆菌o157：h7atcc35150和金黄色葡萄球菌atcc43387所观察到的，用在24小时时间点提取的双歧杆菌atcc29521的pure-pc-cfcs的4小时温育后，记录了对数减少2.87，高于用相应的cfcs所获得的2.84log减少。类似地，用在24小时时间点提取的pure-pc-cfcs的八小时温育后，对比于相应的对照的2.69，观察到了对数减少4.05。讨论afa及其提取物对嗜酸乳杆菌dds-1的生长能力的影响。从图1中可以看出，la-dds1与afa或其提取物一起生长促进了明显更高的生长。这与通过在细菌培养物中添加螺旋藻所获得的结果相比尤其突出。如decaire等人(2000)所报道的，在生长培养基中具有添加的螺旋藻的两种乳杆菌菌株在10小时达到了生长平台，并保持生长长达20小时。然而，与没有螺旋藻的菌株的唯一区别仅在于生长速度，因为在20小时时，后者达到了与螺旋藻富集培养物相同的生长水平，这表明添加螺旋藻对培养基的影响确实不那么有用。相反，将afa克拉马斯藻类(klamathalgae)添加到培养基中则产生更深刻的结果。dds-1菌株实际上比decaire等人所测试的菌株更强，因为它保持生长长达超过30小时。然后在接下来的时间中非常迅速地减少，在48小时时达到零。但克拉马斯藻类富含dss-1菌株，保持高生长曲线长达72小时，甚至在72小时时，也没有减少的迹象。用纯afa的pc可以实现甚至更好的结果。如图2、3、4所示，用其他三种菌株：鼠李糖乳杆菌atcc53103、嗜酸乳杆菌atcc4356和双歧杆菌atcc29521已经获得了类似的结果。这里，鼠李糖乳杆菌和双歧杆菌的生长甚至在346小时后仍然继续进行(对嗜酸乳杆菌atcc4356的影响显著减弱)。afa及其提取物对嗜酸乳杆菌dds-1的酸和胆汁耐受性的影响。如表1所示，afa或其提取物的添加提高了嗜酸乳杆菌dds1在胃肠道的ph变化或胆汁的存在中存活的先天能力。该菌株本身对酸和胆汁条件具有很强的抗性，但在酸性条件下菌株自身的cfu数从5.01×108减少到2.19×108，而当用蓝藻蓝蛋白提取物生长时，它实际上将cfu数从5.25×108增加到6.61×108；并且当与胆汁盐接触时，菌株自身使其cfu数从3.24×108降低到1.17×108，而当用整个afa藻类生长时，它实际上使其cfu数从5.62×108增加到8.32×108。嗜酸乳杆菌dds-1cfcss以及其他三种lab菌株的抗微生物活性。这是益生菌最基本的活动之一，并且这里afa藻类和藻蓝蛋白都引起了嗜酸乳杆菌dds1对抗和灭杀诸如大肠杆菌和白色念珠菌的病原体的能力的显著增加。在第一个测试模块中，如示出琼脂扩散方法(awdm)的表2所示，相比于对照(嗜酸乳杆菌dds1本身)，通过全部三种物质：整个afa、蓝色提取物和纯afa-pcs，对大肠杆菌o157：h7atcc35150的抑制区加倍；而对于白色念珠菌atcc14053，通过在培养物中添加整个afa获得了最佳结果。这给出了第一个指示：就抗微生物活性而言，将整个afa添加到益生菌肉汤中可能是最佳选择。然而，在执行灭杀研究的第二个测试模型中，如图3a-b所示，虽然所有物质，包括嗜酸乳杆菌dds1本身，能够灭杀大量病原体，但通过将pure-afa-pcs添加到生长肉汤中所获得混合物，显然产生了最佳的对抗大肠杆菌和白色念珠菌的性能。通过显示于表3的病原体的对数减少数，进一步证实了pure-afa-pc的产生能够更好灭杀病原体的益生菌的更高的能力。这里我们可以看到，与大肠杆菌0157：h7atcc35150相对，用纯afa-pc温育24小时的嗜酸乳杆菌dds1在已与病原体接触4小时后达到非常显著的减少，其远高于对照(嗜酸乳杆菌dds1)；而白色念珠菌的增加最显著，其中通过用pure-afa-pc的24小时温育后提取的肉汤，并且仅在与病原体接触2小时后再次获得最佳结果。至于其他三种菌株，考虑到具有pure-pc的la-dds1的cfcss的性能是最好的，我们也加入pure-pc的培养物测试它们，从而获得那个pure-pc-cfcs。如表4a、b、c所示，结果证实了相对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌，pure-pc的显著增加lab的灭杀能力的能力。参考文献1)foodandagricultureorganizationofunitednationsandworldhealthorganizationworkinggroup(fao/who)(2002).guidelinesfortheevaluationofprobioticsinfood；technicalreportforfao/who：london，uk.2)bergonzelli，g.e.，blum，s.，brussow，h.，&corthesy-theulaz，i.(2005).probioticsasatreatmentstrategyforgastrointestinaldigestion72，57-68.3)ventura，m.，o′flaherty，s.，claesson，m.j.，turroni，f.，klaenhammer，t.r.，vansinderen，d.，&o′toole，p.w.(2009).genome-scaleanalysesofhealth-promotingbacteria：pro-biogenomics.naturereviews.microbiology7，61-71.4)likotrafiti，e.，manderson，k.s.，fava，f.，tuohy，k.m.，gibson，g.r.，&rastall，r.a.(2004).molecularidentificationandanti-pathogenicactivitiesofputativeprobioticbacteriaisolatedfromfaecesofhealthyelderlyindividuals.microbialecologyinhealthanddisease16，105-112.5)teitelbaum，j.e.，&walker，w.a.(2002).nutritionalimpactofpre-andprobioticsasprotectivegastrointestinalorganisms.annualreviewofnutrition22，107-138.6)lupron，j.(2004).microbialdegradationproductsinfluencecoloncancerrisk：thebutyratecontroversy.journalofnutrition134，479-482.7)kunová，g.，rada，v.，lisová，i.，&vilková，e.(2011).invitrofermentabilityofprebioticoligosaccharidesbylactobacilli.czechjournaloffoodscience29(specialissue)，49-54.8)patel，s.，&goyal，a.(2012).thecurrenttrendsandfutureperspectivesofprebioticsresearch：areview.3biotech2，115-125.9)blaiotta，g.，lagatta，b.，dicapua，m.，diluccia，a.，coppola，r.，&aponte，m.(2013).effectofchestnutextractandchestnutfiberonviabilityofpotentialprobioticlactobacillusstrainsundergastrointestinaltractconditions.foodmicrobiology36，161-169.10)macfarlane，g.t.，steed，h.，&ma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