组织结构支架的制作方法

本发明涉及一种用于制造能够用于组织工程应用的胶原支架，特别是但并不仅仅是组织结构支架，尤其是三维(3d)多孔交联胶原或胶原-壳聚糖(collagen-chitosan)支架的方法。本发明还涉及由该方法制成的组织支架并且涉及插入该支架的设备。

背景技术：

组织支架应用于组织工程，用于改善生物学功能的组织和器官的修复和置换。组织工程的关键成分是提供类似于天然存在的细胞外基质(ecm)的界面的生物材料。这样可以使细胞在该材料上生长，而不被看作该体的异物。生物材料基于生物聚合物，尤其基于由ecm衍生的生物聚合物。

胶原是天然生物聚合物，其在生物医学行业中用于诸如包封、微球和植入物的基质以及组织工程的应用。壳多糖也用于生物医学应用和临床应用，因为其具有高生物相容性、可生物降解性和无抗原性。通过冷冻干燥制备壳聚糖-胶原杂化聚合物网络支架，并且利用水牛干细胞对肝脏组织的生长评估该壳聚糖-胶原杂化聚合物网络支架。

利用电纺丝技术制备纳米纤维胶原(nf胶原)垫片。(koc-l，tieny-c，wangj-c，chenw-c.characterizationofcontrolledhighlyporoushyaluronan//collagencross-linkingspongesfortissueengineering.jmechbehavbiomedmater2012；14：227-38)。电纺丝技术通常形成二维胶原片，而且不能制造具有良好限定微孔尺寸的3dnf胶原支架。为了促进有效组织工程，我们认为开发3d多孔结构对生物组织功能、氧和营养物的转运是关键的。

技术实现要素：

根据本发明的第一方案，一种用于形成支架的方法包括步骤：

制备高内相乳液(hipe)，该高内相乳液(hipe)包括如下的水溶液：

蛋白质，该蛋白质选自由胶原和胶原与壳聚糖的混合物组成的组中；以及

交联剂；

通过对该溶液添加不混合溶剂来形成hipe；

降低hipe的温度，以固化hipe；

通过以高于该溶剂的熔点的温度汽化，去除水和溶剂，以形成多孔结构；并且

在去除溶剂之前或之后，利用交联剂使蛋白质交联，以形成交联支架结构。

本发明的胶原结构可以与天然胶原具有基本上相同的化学成分，并且可以用于引导组织再生。特别有利的实施例具有的优点是其呈现纳米纤维架构，该纳米纤维架构有利于调节细胞粘附性及功能。

胶原凝胶通过单链到三螺旋的转移形成。然而，化学交联是一种更加一致的方法，以保证结构完整性并且提供在体内或者在生理条件下呈现最佳的可重复的性能的凝胶。

该方法可以用于由肝细胞、皮肤成纤维细胞、骨细胞、软骨细胞或皮肤细胞诱导组织形成。

根据本发明的第二方案，一种三维组织支架结构包括：蛋白质，该蛋白质选自由胶原和胶原与壳聚糖的混合物组成的组中，利用交联剂使该蛋白质交联。

本发明中使用的术语“支架”指一种带多孔微结构的三维结构，在组织生长时，该多孔微结构适于支承细胞。

根据本发明的优选支架具有适合用于组织工程的有益构造、形态和性质，包含：良好的生物相容性、机械性能、能够与组织的再生速率匹配的降解速率以及高度多孔互连结构。有助于使用以其他方法难以生长的细胞系。

支架可以具有胶原泡沫的结构，该胶原泡沫具有适合用作组织支架的多孔结构。

与以前公开的多孔聚合物相比，包括由交联胶原、壳聚糖或其混合物形成的支架的本发明实施例尤其适合使用例如基于聚苯乙烯的poly-hipe结构。

本发明的组织支架可以包括由徽孔互连的空隙。该支架可以包含在相邻微孔或空隙之间延伸的支撑，每个支撑都具有长度和厚度。

本发明的支架的结构的特征在于一个或者多个如下性质：

1.支架的结构-

(a)空隙的形状和构造-

本发明的实施例可以制造一种支架，其构造和性质接近模仿去细胞化的天然组织，例如，大鼠肝组织(uygunetal；naturemedicine2010，16，814-821.seefigure2gonpage816)。

以前公开的poly-hipe结构具有大比例的球形或接近球形的空隙和圆形或接近圆形的微孔。carnachan，r.j.；bokhari，m.；przyborski，s.a.andcameron，n.r.；softmatter2006，2，608-616描述了低互连微孔尺寸分布。请参见表1和图4。在这种现有技术的布置中，空隙通常是球形的。

本发明的支架可以基本上没有球形空隙。与carnachan等人公开的poly-hipe结构相比，相邻微孔之间的支撑可以具有宽范围的厚度和长度。少于10％的空隙可以是球体形的或接近球形的。优选地，不存在球体形的或者接近球形的空隙。

(b)使相邻空隙互连的微孔的形状和尺寸分布-

本发明的实施例可以制造一种支架，其构造和性质接近模仿去细胞化的天然组织，例如，大鼠肝组织(uygunetal；naturemedicine2010，16，814-821.seefigure2gonpage816)。

以前公开的poly-hipe结构具有大比例的球形或接近球形的空隙和圆形或接近圆形的微孔。观察到低互连微孔尺寸分布，如carnachan等人所公开。

在这种现有技术的布置中，空隙通常是球形的，通常具有94μm的平均空隙尺寸和10至30μm的微孔尺寸范围以及19μm的平均微孔尺寸。这是窄微孔尺寸分布。

本发明的支架可以基本上没有球形或球体形的空隙。与poly-hipe结构相比，相邻微孔之间的支撑可以具有宽范围的厚度和长度。

本发明的实施例可以提供各种各样构造或形状的空隙和微孔。空隙的尺寸可以确定成使90％的空隙具有3.5μm至6.5μm范围内的平均尺寸。空隙可以具有4.5μm的平均尺寸和±1.8μm的标准偏差。大鼠肝组织的相应结构可以具有4.2μm±2.2μm的空隙尺寸。微孔尺寸可以在2.0μm至8.7μm的范围内，与大鼠肝的微孔尺寸类似，大鼠肝的微孔尺寸可以是1.0μm至12μm。

(c)空隙和微孔的构造的均匀性

在实施例中，空隙和微孔的尺度和构造的均匀性低。相邻空隙或微孔之间的边界可以是不规则的，基本上不存在球形空隙和圆形微孔。

(d)微孔尺度的宽高比-

微孔的宽高比可以由最小尺度(dmin)与最大尺度(dmax)的比值定义。这些可以在正交轴线上或成角轴线上测量。对于非圆形微孔，最小尺度和最大尺度不正交。在实施例中，50％的微孔的宽高比，即，dmin/dmax可以小于约0.7，作为另一种选择，50％小于约0.5，作为另一种选择，50％小于约0.4。

相反，现有技术的poly-hipe结构可以有50％的空隙具有大于0.7，常常大于0.8，通常大于0.9的宽高比。

2.支架上限定空隙的表面积：-

本发明的支架可以在相邻微孔之间具有网状形式的层式的区。该构造对支架的空隙提供较大的表面面积。特别是结合微孔使空隙之间高度互连，大表面面积对细胞生长有益。

3.支架的刚度

本发明的支架可以在相邻微孔之间包含网状形式的层式的区。该构造使支架有较大表面面积限定空隙。特别是结合微孔使空隙之间高度互连，大表面面积对细胞生长有益。

支架的柔软度或其相反的刚度可以由支架的应力应变特性的斜率确定。

在实施例中，支架的刚度与诸如肝的柔软组织类似，例如，在肝组织的刚度值的30％内，作为另一种选择在20％内，作为另一种进一步选择在10％内。可以利用手动检查来确定该刚度，也可以利用仪器测量该刚度。

重要性质是：支架可以选择与天然胶原的刚度类似的刚度，从而有助于例如肝细胞的细胞表达。根据要求，该刚度或柔软度可以被控制成具有接近替换组织类型的刚度值或柔软值的值。

在优选实施例中，本发明的支架可以呈现一个或者多个如下性质。该支架包括互连微孔。根据水银孔隙率测定法的测量，孔隙率可以大于70％，作为另一种选择大于80％，作为另一种选择大于90％，例如为91％。

本发明的支架可以应用于进行模仿天然组织的组织修复，而无需有例如取决于年龄、疾病、性别或环境因素的生物学历史。能够控制组织特征的一致性。

本发明的有利实施例具有微纤维结构，特别是具有薄互连支撑尺度。例如，该结构可以具有长度在0.5μm至6μm的范围内，优选地在0.6μm至5.5μm的范围内的支撑。该支撑可以具有1至3μm的，优选地1至2μm的平均厚度。微纤维结构特别是在调节粘附到支架的细胞方面有效。

交联步骤可以在完全地或部分地去除溶剂之前或之后进行。

可以在完全去除溶剂之前进行交联。作为另一种选择，可以在固化的无溶剂结构上进行交联。作为另一种选择，可以在初始部分交联步骤之后去除溶剂，然后，进一步执行交联步骤。

优选的交联剂是戊二醛(ga)。

可以采用的交联剂有：京尼平、碳化二亚胺、转谷氨酰胺酶、硫酸软骨素、葡萄糖二醛、双(乙烯基磺酰基)甲烷和六亚甲基二异氰酸酯。

优选地是戊二醛的交联剂在乳液中的浓度可以在1wt％至5wt％的范围内，优选地在2wt％至3wt％的范围内，更优选地为约2.5wt％。可以选择交联剂的浓度，以根据要求的组织支架的性质，提供要求的刚度或柔软度。

根据本发明将戊二醛用作交联剂就不要求使用胶原的乙烯衍生物，并且可以更快速地生产基于胶原的多孔材料，不需要纯化乙烯化衍生物。

高内相乳液(hipe)模板的聚合作用产生具有内部微孔结构的材料(被称为：polyhipe)，通过改变一个或者多个制造条件，诸如，乳液稳定性、搅拌速率和液滴相添加的速率，能够控制该内部微孔结构。对于聚合物泡沫，诸如，基于油包水苯乙烯/dvb的聚合物泡沫，hipe已经在聚合作用之前用作模板。当使用诸如胶原的水溶性聚合物时，可以形成相反的水包油hipe。或者通过冷却到胶凝温度以下，或者通过添加交联剂，产生该多孔结构。

胶原在该乳液中的浓度可以在约5wt％至约30wt％，优选地在约7.5wt％至约15wt％的范围内。已经发现较高浓度的胶原能够降低支架与水接触时的膨胀，提供更稳定的支架结构。

该水溶液还可以包括例如5wt％至10wt％，通常为约7wt％数量的表面活性剂。两性表面活性剂是优选的，例如，由例如solvay以miranolc2m-sfconc为商标制造的椰油酰两性基二丙酸二钠(disodiumcocoamphodipropionate)。替换的非离子表面活性剂是例如由dowchemicalcompany以tritonx-405为商标制造的辛基酚乙氧基化物(octylphenolethoxylate)。

hipe可以通过冷冻，例如，通过低温冷冻固化。在执行本发明的方法时不一定采用受控冷冻速率。为了去除水和有机溶剂，可以采用冷冻干燥。例如，如果溶剂是甲苯(熔点为-90℃)，则可以将该乳液冷冻到约-80℃的温度，使得能够通过汽化去除溶剂。

可以取决于要制备的样品的尺寸的速率，在2分钟的时段内添加有机溶剂。

根据本发明的第三方案，提供了一种根据本发明的第二方案的人工支架。该支架可以具有适合制造假体的三维结构。例如，可以利用管状结构制造神经假体。薄片结构可以用于制造眼假体。片结构或块结构可以用于制造肝组织。层结构或折叠结构可以用于制造骨假体。可以选择性地构造该三维结构，以符合病区的尺度，从而有助于病区修复。

附图说明

将参考附图利用没有限制性意义的示例进一步描述本发明，其中：

图1示出非交联胶原polyhipes的内部结构；

图2示出风干polyhipe材料的空隙尺寸分布；

图3示出冷冻干燥戊二醛交联胶原polyhipes的内部结构；

图4示出与戊二醛交联的风干胶原polyhipes(10％ww)的内部结构；

图5示出胶原-壳聚糖polyhipe材料的内部结构的电子显微镜扫描图像；

图6示出基于胶原的polyhipes的人骨肉瘤细胞(soas-2)培养物的dna含量；

图7示出非交联胶原材料与和与戊二醛交联的胶原材料的膨胀比；

图8示出电子显微镜扫描(sem)图像，其示出具有标记的支撑(strut)尺寸的与戊二醛交联的风干胶原polyhipe(10wt％)的内部结构；

图9a是去细胞化肝的sem显微照片；

图9b示出根据本发明的天然胶原支架的sem显微照片；以及

图10是示出互连微孔尺寸分布的柱状图。

具体实施方式

2.材料与方法

采用下面的材料和方法。

2.1材料

从sigma-aldrich获得胶原、戊二醛(ga)(25％w/v水溶液)、地塞米松、β甘油硫酸二钠盐水合物和2-磷酸-l-抗坏血酸三钠盐。从lifetechnologies获得达尔贝科改良伊格尔培养基(dulbecccosmodifiedeaglesmedium)(dmem)、磷酸盐缓冲盐水(pbs)、青霉素/链霉素和胰蛋白酶/edta。

2.2胶原polyhipes的制备

用于制备高内相乳液(hipe)的设备由装有由顶置式搅拌机驱动的d形桨叶的三颈圆底烧瓶构成。胶原溶解于含有7％的miranolc2m-conc的去离子水中，作为表面活性剂。含有该胶原溶液的烧瓶仅部分地浸在维持在50℃的水浴中。这是适于将浓缩胶原溶液加工成hipe的温度。然后，逐滴地加入甲苯，以达到3∶1的比例(15：5ml或45∶15ml)。结束时，形成白色hipe。进一步将hipe搅拌5分钟，然后，将其传送到50ml的聚乙烯瓶或离心管中。然后，将戊二醛(ga)(25％w/v水溶液)加入hipe内并通过轻微摇晃混合。然后，在乙醇和去离子水中洗涤之前，使hipe凝胶化过夜，以分别去除甲苯和表面活性剂。然后，在液氮中冷冻清洗后的材料，并且冷冻干燥24至48小时。

然后，将胶原polyhipes(ga交联的)置于12孔培养板中，并且在0.1m甘氨酸中清洗过夜，以使空醛基失活。然后，利用70％的乙醇对该材料杀菌30分钟，然后，利用磷酸盐缓冲盐水清洗三次。最后，利用人骨肉瘤细胞培养基(2至3ml)清洗该材料，并且在37℃和5％的co2中维持，直到细胞接种。

对于非交联胶原材料，将样品置于12孔板中，并且在2ml的2.5％w/vga中后交联过夜。然后，在pbs中清洗交联样品(5次)，以去除残余ga，并且在2ml的0.1m甘氨酸溶液中浸渍4小时，以使空醛基失活。然后，在70％的乙醇中对该样品杀菌，并且利用pbs清洗其(3次)，并且然后，在细胞接种之前，在2至3ml的人骨肉瘤细胞培养基中清洗其。

2.3胶原-壳聚糖polyhipes的制备

下面的制备基本上已在2.2小节给出。对于胶原一壳聚糖复合材料，胶原(1.5g，10％w/w)和壳聚糖(0.3g，2％w/w)溶解于含miranolc2m-conc的2％乙酸中。该溶液维持在50℃，并且逐滴地对该溶液加入甲苯，直到形成hipe。然后，这些材料交联并且如上对胶原材料所述进行处理。

2.4人骨肉瘤细胞培养

关于标准的细胞培养，人骨肉瘤细胞维持于含10％fbs(gibco、lifetechnologies)和100u/ml青霉素/链霉素(gibco、lifetechnologies)的dmem(gibco、lifetechnologies)中。

2.53d细胞培养

i)在12孔板中，每个支架接种250,000saos-2细胞。人骨肉瘤细胞维持于成骨分化培养基、补充了10％fbs的dmem、10nm地塞米松、5mmol/lβ甘油磷酸盐和100μg/ml抗坏血酸中。在对孔注入3ml的分化培养基之前，在接种之后，使细胞沉降30分钟。

ii)在各50μl的孔接种100,000l929细胞(2x10⁶细胞/ml)，并且在细胞培养箱中使其在支架上沉降30分钟。然后，对孔加注3ml的培养基，并且将其置于培养箱中，并且维持于37℃的5％的co2中。l929细胞在天然胶原支架上培养10天。

iii)在根据本发明的描述制造的天然胶原支架(n型)上培养三种类型的原代人细胞(即，原代人肝细胞(phh)、人肝癌细胞系hepg2和原代人肝脏星形细胞)。此外，将其与较软的苯乙烯-eha(丙烯酸2-乙基己酯)3dpolyhipe合成支架(s型)和2d硬塑料标准组织培养板进行比较。所有细胞均被成功培养。与合成支架(s型)上的表型相比，天然胶原支架(n型)促进表型的改善。特别是，与培养于传统2d硬塑料上的原代人肝脏星形细胞相比，培养于胶原支架(n型)上的原代人肝脏星形细胞的活性已经降低(“更类似于体内”)。

2.6dna分析

将冻融技术用于细胞裂解(celllysis)。利用生物学级的水清洗培养物，并且将该培养物置于含1ml生物学级的水的1.5ml的法尔康管(falcontube)中。利用细胞刮棒去除2d中培养的细胞，并且再悬浮于1ml的生物学级的水中。在-20℃下储存细胞裂解产物。

利用quantitpicogreen检定法(lifetechnologies)分析dna含量。细胞裂解产物在37℃下融解，并且利用21g针头使其匀化(10至15次)，然后，通过将10μl的样品和90μl的te缓冲液置于黑底的96孔板中，用te缓冲液以1∶10稀释样品(1次)。然后，加入100μl的picogreen试剂，并且在室温下，在锡箔的包裹下混合5分钟。然后，分别以480和520nm的激发波长和发射波长测量荧光。

2.7碱性磷酸酶活性

将冻融技术用于细胞裂解。利用生物学级的水清洗培养物，并且将该培养物置于含1ml生物学级的水的1.5ml的法尔康管中。利用细胞刮棒去除2d中培养的细胞，并且再悬浮于0.5ml的生物学级的水中。在-20℃下储存细胞裂解产物。

碱性磷酸酶(alp)的水平与肝脏和骨骼中的各种疾病有关联。abcam的碱性磷酸酶试剂盒将磷酸对硝基苯酯(p-np)用作磷酸盐底物，当利用alp脱去磷酸时，其变成黄色(405nm)。

细胞裂解产物在37℃下融解。然后，将5μl的细胞裂解产物加到96孔板的每个孔中。然后，利用检定缓冲液使体积达到80μl。然后，将50μl的p-np(5mm)加到每个样品孔中。然后，将该板包裹在锡箔中，并且在室温下培育60分钟。然后，利用synergyh4板读取器在405nm下读取吸收度。然后，将样品读数应用于p-np标准曲线，并且如下计算测试样品的alp活性：

alp活性(u/ml)＝a/(v*t)(1)

其中：

a是样品产生的p-np的数量(μmol)。

v是加入检定孔中的样品的体积(以ml为单位)，t是反应时间(以分钟为单位)。

然后，对样品的dna含量将alp活性归一化，以给出每ngdna的单位活性。

2.8确定内部结构和微孔尺寸

利用水银孔率测定法(mercuryintrusionporosimetry)确定材料的微孔尺寸中值，利用micromeritics的autoporeiv执行水银孔率测定法。采用130度的压汞和挤汞接触角。透度计具有1.836ml的茎体积(stemvolume)和5ml的球体积(bulbvolume)。利用以15kv工作的扫描电子显微镜(sem、philipsxl30sem)探查空隙直径范围。在造影之前，对破裂样品涂敷金，并且利用碳垫固定于铝棒上。如上所述计算空隙直径尺寸。

2.9组织学分析和免疫组织化学分析

样品在pbs中清洗3次，并且然后，在4％的pfa中固定过夜。然后，通过一系列分级乙醇(40、60、80、90和95％的乙醇)1小时并且然后在100％的乙醇中1小时、在组织透明剂(histoclear)中15分钟、在50/50组织透明剂/蜡中30分钟以及在100％的蜡中60分钟，对样品脱水。然后，样品以横向装入成型盒中，并且搁置其，以冷却过夜。然后，通过一系列分级乙醇，对10μm的切片脱蜡和再水合。然后，利用透化溶液和封闭缓冲液(每个溶液中15分钟)培育该切片。关于抗体染色，在湿润室中，利用骨钙蛋白一抗培育该切片过夜。一抗培育后，然后，清洗该切片，并且在黑暗中利用适当二抗将其培育60分钟。然后，利用dapi/vectashield，将切片封固于盖玻片中。关于标准苏木精/曙红染色，将切片分别留置于苏木精和曙红中，以对细胞核造影并且对胶原材料结构染色。利用leicadm500和dmi300b显微镜对切片造影。

2.10膨胀研究

将干燥样品称重，并且将其置于含30ml水的离心管中。然后，经过30分钟后，提取该样品。利用干纸巾去除过多的水，并且然后，对膨胀的样品称重，并且将其放回30ml的水中。每隔30分钟重复一次该过程，最多120分钟。利用等式3计算材料的膨胀比(wsr)。

wsr＝(wt-w0)/w0(3)

wt表示湿支架的重量，而w0表示干支架的初始重量。

3.结果

3.1实验过程

首先，利用不同表面活性剂制备胶原hipe。然而，特别是在60ml乳液规模，利用tritonx-405制备的胶原hipe没有利用miranolcm-sfconc制备的胶原hipe稳定。下面仅涉及利用miranolcm-sfconc制备的胶原hipe。添加了交联剂戊二醛后，迅速发生凝胶化。凝胶化的hipe的颜色是橙黄色的，其中获得的冷冻干燥整块制品是稍浅的橙黄色。对于10％w/w胶原浓度用于以20ml的规模凝胶化的交联剂的比例示于表1中。为了改变胶原的浓度和对于60ml的产量，相应地调节数量。

表1.含10％w/w胶原的材料的交联比

3.2结构分析

利用扫描电子显微镜分析胶原材料的内部微孔结构。

所有的胶原风干polvhipe材料都呈现标准polvhipe乳液模板化结构。所有材料都呈现开放互连结构，其空隙尺寸随胶原浓度的升高而降低(图1)。hipe的粘度升高伴随着胶原粘度升高，这与乳液稳定性的升高相关。模板材料的空隙尺寸受乳液液滴大小的控制，并且其能够通过改变液滴相的温度和时间来影响乳液的稳定性来调节。互连的口/微孔也受乳液稳定性的控制，并且其在乳液液滴周围的连续相膜聚合反应时形成。在较高浓度的胶原下，其变得更难以观察到轮廓分明的空隙结构(图1e至f)。

根据对胶原php材料所做的图像分析，胶原浓度的升高导致材料具有更小范围的空隙尺寸并且材料的整体平均空隙尺寸较小(图1a至c)。在胶原浓度从10％升高到30％的胶原时，空隙尺寸从70μm降低到10μm。这是因为乳液粘度随着胶原浓度的升高而升高意味着hipe的稳定性随着胶原浓度升高而升高。升高的hipe稳定性导致多孔材料具有较小的平均空隙尺寸，如上所述。

与对具有10％w/w胶原的材料观察到的纳米纤维结构相比，使胶原的浓度升高到20％w/w产生孔隙率较低而支撑尺寸较厚的php材料。

冷冻干燥胶原polyhipe材料(ga交联的)也呈现高互连多孔结构(图3)。在sem图像中没有观察到界限分明的球形空隙结构，并且水银孔隙率测定法计算出39μm的中等互连直径(图1d)，表明极开放的互连结构。与非交联材料相比，ga交联材料更呈现纳米纤维结构。利用两种不同的方法使材料交联；或者在hipe形成之后，直接将ga加入hipe中，或者加入干材料中，这样在ga溶液中后交联过夜。与冷冻干燥材料相比，风干ga交流材料呈现更均匀的互连结构(图4)。在图8所示的显微照片上，该结构的支撑尺寸(strutdimension)被标记为白条。

3.3胶原-壳聚糖polyhipe

与戊二醛交联的风干胶原-壳聚糖polyhipe的内部结构被证明是成功的细胞培养物。

3.4dna分析和碱性磷酸酶(alp)

dna分析用于研究人骨肉瘤细胞的2d和3d培养物上的细胞生长/细胞数。经过头12小时的培育后，与2d相比，在3d胶原支架中观察到dna的水平升高(图6)。8天之后，3d和2d培养物上的dna水平都最高。14天后，细胞的生长水平在2d和3d培养物中都降低，可能是因为细胞分化的原因。在21天和35天时，与标准2d培养物相比，在3d胶原培养物中观察到升高的dna水平(未示出数据)。

碱性磷酸酶(alp)对碱性缓冲液中的磷酸酯的水解起催化作用，并且产生有机自由基和无机磷酸盐。碱性磷酸酶水平和活性的变化与肝脏和骨骼中的各种疾病状态有关联。在分化时，在成骨细胞的成熟阶段涉及碱性磷酸酶。这种酶属于通过糖基一磷脂肌醇连接锚定于质膜的蛋白质家族。alp是定型成骨细胞的最早衰型标志物之一。通常，与其基质未矿化的诸如成纤维细胞的细胞相比，定型成骨细胞呈现较高的alp基础水平。成骨细胞开始矿化之前的alpmrna的表达和酶活性意味着在包外基质的制备中，碱性磷酸酶可以参与矿物的沉积和其他基因的共表达。在体内前成骨细胞和成骨细胞中并且在体外分化成骨细胞中都见到高alp水平。除了其在骨矿化中的作用，alp的生物学功能尚未知。能够在体外诱导表达高水平的alp的结缔组织细胞沉积矿物。alp可以涉及无机焦磷酸盐降质，从而将局部浓度足够高的磷酸盐或无机焦磷酸盐用于进行矿化。进行了研究以说明活alp如何用于骨形成。在alp缺乏症、.低磷酸酯酶症的人模型中，因为缺乏alp活性，骨骼变软，这意味着alp的生理功能是在出生后保持骨矿化。较近期，两种小鼠alp敲除模型表明当alp的基因被明确删除时，小鼠在出生后的短期内骨矿化发育有缺陷，而在胚胎发育时不一定有缺陷。未知的冗余机制或备用机制可能在胚胎期期间在alp缺乏敲除中提供矿化，使得alp在骨的初始矿化过程中仍起重要作用。这些结果意味着alp可能在维持骨矿化方面起重要作用。

对dna含量归一化后的alp活性表明14天和21天后，与标准2d培育相比，每个细胞在3d胶原材料上的alp水平升高。3d胶原多孔材料对于增强的骨细胞分化提供适当的仿生环境。(35天的数据未示出。)

3.5组织学分析

细胞核的苏木精染色表明在胶原基质顶部的三分之一内存在人骨肉瘤细胞(生长24小时)。然而，当曙红染色时，胶原支架还表现浓重的粉红色/红色，这使得当组合使用时细胞与支架之间的解密困难。

对细胞核进一步进行dapi染色表明进入胶原支架结构的人骨肉瘤细胞在进一步培养7天后呈现良好3d细胞生长。骨钙蛋白是骨分化的后期标志物。为了考虑到胶原的自由基的聚合反应，已由胶原的乙烯衍生物、硫酸软骨素和透明质酸制造本说明书中报告的基因胶原的polyhipe材料。

图9a是去细胞化肝组织的sem显微照片(uygunetal；naturemedicine2010，16，814-821)。利用附加的测量条确定互连微孔的尺寸，在该显微照片中，细线表示一些互连微孔。比例条代表20微米。

图9b示出天然胶原支架的sem显微照片(n1，本发明的实施例)。利用附加的测量条确定互连微孔的尺寸，在该显微照片中，细线表示一些互连微孔。比例条代表20微米。

carnahanetal，softmatter2006，2，608-616公开了poly-hipe结构的sem显微照片。该结构通常具有球形空隙和圆形微孔。空隙和微孔比图9a所示的肝组织具有小得多的尺寸范围和构造。

图10是示出去细胞化肝组织和本发明的天然胶原支架的互连微孔尺寸分布的柱状图。该图示出本发明的支架的微孔尺寸分布的轮廓接近再现肝组织的微孔尺寸分布。

3.6l929细胞生存力

天然胶原支架(n型)上培养的l929细胞在10天的培养期内呈现良好的细胞生存力/生长。mtt吸收值在10天的培养期内从0.05升高到0.3。进行mtt生存力测定。空白支架(无细胞)在每个时间点同时进行。

3.7原代人细胞的培养

在根据本发明的支架上进行三种类型的原代人细胞(即，原代人肝细胞(phh)、人肝癌细胞系hepg2和原代人肝脏星形细胞)的培养。所有细胞均被成功培养。与合成支架(s型)相比，本发明的天然胶原支架促进表型的改善。特别是，与培养于传统2d硬塑料上的星形细胞相比，培养于胶原支架(n型)上的星形细胞的活性已经降低(“更类似于体内”)。该结果清晰地说明利用在此公开的方法制造的天然胶原支架(n型)在维持要求的基因表达方面确定无疑地优越。该结果示于表1中。

表1-培养于3d支来上的原代人肝细胞中的基因表达变化。

原代人肝细胞在3d支架(s1、s4、n1和n4[s＝合成，n＝天然])上培养7天。从全部细胞提取总rna，并且利用qpcr对总rna做关于与肝细胞功能关联的基因表达的分析。所示的数据是与gapdh持家基因相比并且被表达为2∧-deltact的相对基因表达。为了实现最佳体外培养，要求维持这些基因的表达(与融解细胞相比)。天然(n)支架上培养细胞对于维持肝脏基因表达表现优异，然而，表达低于新鲜融解细胞中的表达。

表2-天然3d支架上培养的原代人肝细胞和hepg2细胞中的白蛋白基因表达。

原代人肝细胞和hepg2在本发明的支架(n1和n4，n＝天然)上培养7天。从全部细胞提取总rna，并且利用qpcr对总rna做关于白蛋白表达的分析。所示的数据是与gapdh持家基因相比并且被表达为2^-deltact的相对基因表达。为了实现最佳体外培养，要求维持白蛋白表达的表达(与融解细胞相比)。当在天然支架上培养时，两种类型的细胞具有可比的白蛋白表达，然而，这仍低于新鲜融解细胞中的表达。该结果示于表2中。

表3-3d支架上培养的原代人肝脏星形细胞中的基因表达的变化。

原代人肝脏星形细胞在标准塑料多孔板上或者在本发明的合成支架(s1、s4、n1和n4[s＝合成，n＝天然])上培养7天。从全部细胞提取总rna，并且利用taqmanqpcr对总rna做关于与星形细胞活性关联的基因表达的分析。所示的数据是与gapdh持家基因相比并且被表达为2^-deltact的相对基因表达。通过在“硬”2d塑料板上进行培养维持或促进这些基因的表达，但是这些基因的表达在天然(n)支架上培养的样品中减少。合成(s)支架上培养的细胞已经减少基因表达。这些基因表达的减少非常有利，因为其更好地反映了体内状况。该结果示于表3中。