本发明属于细胞培养领域，特别涉及一种胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物的修复制剂及其制备方法。
背景技术：
干细胞培养液中含有大量的生物活性物质，现有技术中，有将干细胞培养液应用于美容行业，长期使用含有干细胞培养液的化妆品，具有美白、去皱纹、改善面色、紫外损伤修复等功能。但是为了促进细胞增值，大量分泌生物活性物质的培养基多数为血清培养基，其中的部分成分具有较高使用风险；而成分相对简单的无血清培养基不利于干细胞的增长和生物活性物质的释放，导致得到的培养液活性成分含量极低，美容效果差，使用量大导致副作用明显的问题。
另一方面，现有应用于美容行业的干细胞培养液制剂多为冻干制剂，由于干细胞培养液的成分及其复杂，冻干过程容易导致某些成分的质变，在复溶过程中产生大量不溶物，且对皮肤的刺激性增加，安全性降低。
技术实现要素：
本发明的特征在于在前人研究的基础上，提供了一种有效成分含量高，用量小的，风险低，对皮肤刺激性小的胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物的修复制剂及其制备方法，具体技术方案如下：
一种胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物的修复制剂，包括如下重量分的组分：胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物50-70和填充剂20-30；其中胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物的制备方法如下：
1)无菌采集胎盘组织，经过清洗、消化和分离步骤获得胎盘亚全能干细胞，表达cd151、cd73、oct4和hla-ⅰ，不表达cd43、cd184和hla-ⅱ；
2)无菌采集胎盘组织，经过清洗、消化和分离步骤获得间充质干细胞；
3)将胎盘亚全能干细胞按照2×104个/ml的密度、间充质干细胞按照8×104个/ml的密度，共同接种于原代无血清培养液中，每隔1-3天换液一次，培养7-10天，收获原代混合细胞，并将培养三天后的经过培养的培养液进行收集并合并，得到原代培养液；
4)将收获的原代混合细胞按照1×105个/ml的密度接种于传代无血清培养液中，传代至第五代，每代的经过培养的培养液均进行收集并合并，得到传代培养液；
5)将收集到的原代培养液和传代培养液进行混合，灭菌后，向培养液中加入浓度为8-12mg/ml的棉籽糖、浓度为0.05-0.1mg/ml的枯草杆菌和浓度为0.03-0.08ml/ml的磷酸二氢铵，混合均匀后，于15℃、35％o2的潮湿空气静置10-15天，得到混合培养预混物；
6)将得到的混合培养预混物进行离心操作，收集上清液，灭菌即得所述胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物。
进一步地，所述无血清培养液以opti-mem培养液为基础，还包括如下浓度的组分：15-20ug/mld-葡萄糖、13-20ug/ml大豆磷脂和8-12ug/ml苯丙氨酸。
将胎盘亚全能干细胞和间充质干细胞按照特定的比例进行共同培养，相互促进，共同生长，在成分相对简单的无血清培养基中，就可以大量繁殖，细胞增殖能力强，分泌的细胞因子量大，得到的混合培养液经过步骤5)的处理后得到培养提取物，成分安全，对皮肤的刺激性低，有效成分含量高，仅需要较小的用量即可产生优异的美白、抗衰和修复功能，对创伤性皮肤损伤的修复功能强；对皮肤具有较好的功能，同时对痤疮具有较好的治疗效果。
进一步地，所述步骤3)具体包括如下步骤：
3.1)将胎盘亚全能干细胞按照2×104个/ml的密度、间充质干细胞按照8×104个/ml的密度与培养液进行混合，得到混合细胞悬液，并接种于无血清培养液中；
3.2)在37℃、5％co2的潮湿空气中进行培养，第二天更换全部培养液，向培养液中加入18ug/ml的多聚尿氨酸，继续培养2天后，更换二分之一培养液，然后每隔3天更换二分之一培养液，同时在换液的同时缓慢送含有6％co2的气体，培养7-10天后，离心收集上清液；
3.3)将培养第4天及其后更换的培养液进行收集，然后与上清液进行合并。
进一步地，所述传代无血清培养液以opti-mem培养液为基础，还包括如下浓度的组分：10-13ug/ml二氨基乙烷聚丙烯酰胺、13-20ug/ml大豆磷脂、15-25ug/ml卵磷脂和8-12ug/ml苯丙氨酸。
更进一步地，所述修复制剂为冻干制剂，修复制剂还包括填充剂和稀释溶液；所述填充剂包括重量份数比为：2:1:5的金丝桃苷、枸缘酸钠和葡糖胺葡聚糖。
选择上述填充剂与所述胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物相混合，保证混合培养提取物的活性不受破坏。
更进一步地，所述修复制剂的制备方法包括如下步骤：
1)溶液a获取步骤：在0℃条件下，无菌条件下，按照重量份数将枸缘酸钠溶于水中，至枸缘酸钠的质量浓度为1.5％，然后将金丝桃苷和葡糖胺葡聚糖加入到枸缘酸钠水溶液中进行混合，混合均匀后，加入胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物，搅拌混合10-15min，得到溶液a；
2)装罐步骤：将步骤1)得到的溶液a过滤除菌三次，分装至储罐，将储罐在摇晃状态下降温至-5～-7℃，保持10min；
3)预冻步骤：将隔板温度降至-7℃进箱，然后将步骤2)处理后的储罐放置于隔板上，进行分步预冻，在-15～-18℃条件下保温70-90min；然后在-25～-27℃条件下保温120-150min；最后在-45℃条件下保温50-60min；
4)一次干燥：调整冻干机的真空压力为25-30pa，温度为-25℃～-30℃，持续12-15h；
5)二次干燥：调整冻干机的真空压力为5-10pa，温度为30℃，持续6-12h。
优选地，3)预冻步骤的调节冻干机的降温流程如下：按照1-2℃/min的降温速率将冻干机降温至-15～-18℃，保温70-90min；然后按照0.5-0.8℃/min的降温速度将冻干机降温至-25～-27℃，保温120-150min；然后按照5-7℃/min的降温速度将冻干机降温至-45℃，保温50-60min。
优选地，在一次干燥步骤中，按照间隔3h一次的频率，向冻干机中通入惰性气体，并保证真空压力不超过30pa。
优选地，所述惰性气体为氩气。
上述制备方法制备的冻干制剂，保证胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物的成分均匀，质量均衡，复溶性好，无沉淀，性质稳定，对皮肤无刺激性。
另一方面，本发明还提供一种胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物的修复制剂的制备方法，包括如下步骤：
1)溶液a获取步骤：在0℃条件下，无菌条件下，按照重量份数将枸缘酸钠溶于水中，至质量浓度为1.5％，然后将金丝桃苷和葡糖胺葡聚糖加入到枸缘酸钠水溶液中进行混合，混合均匀后，加入胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物，搅拌混合10-15min，得到溶液a；
2)装罐步骤：将步骤1)得到的溶液a过滤除菌三次，分装至储罐，将储罐在摇晃状态下降温至-5～-7℃，保持10min；
3)预冻步骤：将隔板温度降至-7℃进箱，然后将步骤2)处理后的储罐放置于隔板上，调节冻干机的降温流程如下：按照1-2℃/min的降温速率将冻干机降温至-15～-18℃，保温70-90min；然后按照0.5-0.8℃/min的降温速度将冻干机降温至-25～-27℃，保温120-150min；然后按照5-7℃/min的降温速度将冻干机降温至-45℃，保温50-60min；
4)一次干燥：调整冻干机的真空压力为25-30pa，温度为-25℃～-30℃，持续12-15h；
5)二次干燥：调整冻干机的真空压力为5-10pa，温度为30℃，持续6-12h。
本发明岁提供的胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物的修复制剂，成分安全，对皮肤的刺激性低，且具有优异的修复功能，对创伤性皮肤损伤的修复功能强，用量小；对皮肤具有较好的美白、抗衰功能，同时对痤疮具有较好的治疗效果。制备的冻干制剂，保证胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物的成分均匀，质量均衡，复溶性好，无沉淀，性质稳定，对皮肤无刺激性。
具体实施方式
实施例1
一种胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物的修复制剂，包括如下重量分的组分：胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物50和填充剂20；其中，胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物的制备方法如下：
1)无菌采集胎盘组织，经过清洗、消化和分离步骤获得胎盘亚全能干细胞；
2)无菌采集胎盘组织，经过清洗、消化和分离步骤获得间充质干细胞；
3)将胎盘亚全能干细胞按照2×104个/ml的密度、间充质干细胞按照8×104个/ml的密度，共同接种于原代无血清培养液中，每隔3天换液一次，培养7天，收获原代混合细胞，并将培养三天后的经过培养的培养液进行收集并合并，得到原代培养液；
4)将收获的原代混合细胞按照1×105个/ml的密度接种于传代无血清培养液中，传代至第五代，每代的经过培养的培养液均进行收集并合并，得到传代培养液；
5)将收集到的原代培养液和传代培养液进行混合，灭菌后，向培养液中加入浓度为12mg/ml的棉籽糖、浓度为0.1mg/ml的枯草杆菌和浓度为0.08ml/ml的磷酸二氢铵，混合均匀后，于15℃、35％o2的潮湿空气静置10天，得到混合培养预混物；
6)将得到的混合培养预混物进行离心操作，收集上清液，灭菌即得所述胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物。
所述原代无血清培养液和传代无血清培养液成分相同，均为opti-mem培养液，所述填充剂20和稀释溶液10，为任意符合辅料要求，并可以与胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物相适配的辅料。
实施例2
一种胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物的修复制剂，包括如下重量分的组分：胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物70和填充剂30；其中，胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物的制备方法如下：
1)无菌采集胎盘组织，经过清洗、消化和分离步骤获得胎盘亚全能干细胞；
2)无菌采集胎盘组织，经过清洗、消化和分离步骤获得间充质干细胞；
3)将胎盘亚全能干细胞按照2×104个/ml的密度、间充质干细胞按照8×104个/ml的密度，与培养液进行混合，得到混合细胞悬液，并接种于无血清培养液中；在37℃、5％co2的潮湿空气中进行培养，第二天更换全部培养液，向培养液中加入18ug/ml的多聚尿氨酸，继续培养2天后，更换二分之一培养液，然后每隔3天更换二分之一培养液，同时在换液的同时缓慢送含有6％co2的气体，培养9天后，离心收集上清液；将培养第4天及其后更换的培养液进行收集，然后与上清液进行合并，得到收集的原代培养液；
4)将收获的原代混合细胞按照1×105个/ml的密度接种于传代无血清培养液中，传代至第五代，每代的经过培养的培养液均进行收集并合并，得到传代培养液；
5)将收集到的原代培养液和传代培养液进行混合，灭菌后，向培养液中加入浓度为8mg/ml的棉籽糖、浓度为0.05mg/ml的枯草杆菌和浓度为0.03ml/ml的磷酸二氢铵，混合均匀后，于15℃、35％o2的潮湿空气静置15天，得到混合培养预混物；
6)将得到的混合培养预混物进行离心操作，收集上清液，灭菌即得所述胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物。
所述原代无血清培养液和传代无血清培养液成分相同，均以opti-mem培养液为基础，还包括如下浓度的组分：17ug/mld-葡萄糖、15ug/ml大豆磷脂和10ug/ml苯丙氨酸。
实施例3
一种胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物的修复制剂，与实施例2的区别在于，所述原代无血清培养液以opti-mem培养液为基础，还包括如下浓度的组分：15ug/mld-葡萄糖、13ug/ml大豆磷脂和8ug/ml苯丙氨酸。
所述传代无血清培养液以opti-mem培养液为基础，还包括如下浓度的组分：10ug/ml二氨基乙烷聚丙烯酰胺、13ug/ml大豆磷脂、15ug/ml卵磷脂和8ug/ml苯丙氨酸。
实施例4
一种胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物的修复制剂，与实施例2的区别在于，所述原代无血清培养液以opti-mem培养液为基础，还包括如下浓度的组分：20ug/mld-葡萄糖、20ug/ml大豆磷脂和12ug/ml苯丙氨酸。
所述传代无血清培养液以opti-mem培养液为基础，还包括如下浓度的组分：13ug/ml二氨基乙烷聚丙烯酰胺、20ug/ml大豆磷脂、25ug/ml卵磷脂和12ug/ml苯丙氨酸。
实施例5冻干制剂
一种胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物的冻干制剂，包括如下组分：
其中，胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物的制备方法与实施例1相同。
实施例6冻干制剂
一种胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物的冻干制剂，包括如下组分：
制备方法：1)溶液a获取步骤：在0℃条件下，无菌条件下，，按照重量份数将枸缘酸钠溶于水中，至质量浓度为1.5％，然后将金丝桃苷和葡糖胺葡聚糖加入到枸缘酸钠水溶液中进行混合，混合均匀后，加入胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物，搅拌混合10min，得到溶液a；
2)装罐步骤：将步骤1)得到的溶液a过滤除菌三次，分装至储罐，将储罐在摇晃状态下降温至-5℃，保持10min；
3)预冻步骤：将隔板温度降至-7℃进箱，然后将步骤2)处理后的储罐放置于隔板上，进行分步预冻，调节冻干机的降温流程如下：按照1℃/min的降温速率将冻干机降温至-15℃，保温70min；然后按照0.5℃/min的降温速度将冻干机降温至-27℃，保温120min；然后按照7℃/min的降温速度将冻干机降温至-45℃，保温50min；
4)一次干燥：调整冻干机的真空压力为25pa，温度为-25℃℃，持续12h；
5)二次干燥：调整冻干机的真空压力为5pa，温度为30℃，持续12h。
其中，胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物的制备方法与实施例1相同。
实施例7冻干制剂
一种胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物的冻干制剂，包括如下组分：
制备方法：1)溶液a获取步骤：在0℃条件下，无菌条件下，，按照重量份数将枸缘酸钠溶于水中，至质量浓度为1.5％，然后将金丝桃苷和葡糖胺葡聚糖加入到枸缘酸钠水溶液中进行混合，混合均匀后，加入胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物，搅拌混合15min，得到溶液a；
2)装罐步骤：将步骤1)得到的溶液a过滤除菌三次，分装至储罐，将储罐在摇晃状态下降温至-7℃，保持10min；
3)预冻步骤：将隔板温度降至-7℃进箱，然后将步骤2)处理后的储罐放置于隔板上，进行分步预冻，调节冻干机的降温流程如下：按照2℃/min的降温速率将冻干机降温至-18℃，保温90min；然后按照0.8℃/min的降温速度将冻干机降温至-25℃，保温150min；然后按照5℃/min的降温速度将冻干机降温至-45℃，保温60min；
4)一次干燥：调整冻干机的真空压力为30pa，温度为-30℃，持续15h；
5)二次干燥：调整冻干机的真空压力为10pa，温度为30℃，持续6h。
其中，胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物的制备方法与实施例1相同。
对照例1
一种修复制剂，包括如下重量分的组分：胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物50和填充剂20；其中，胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物的制备方法如下：
1)无菌采集胎盘组织，经过清洗、消化和分离步骤获得胎盘亚全能干细胞，表达cd151、cd73、oct4和hla-ⅰ，不表达cd43、cd184和hla-ⅱ；将胎盘亚全能干细胞按照2×104个/ml的密度、接种于原代无血清培养液中，每隔3天换液一次，培养7天，收获原代混合细胞，并将培养三天后的经过培养的培养液进行收集并合并，得到胎盘亚全能干细胞原代培养液；将收获的原代细胞按照1×105个/ml的密度接种于传代无血清培养液中，传代至第五代，每代的经过培养的培养液均进行收集并合并，得到胎盘亚全能干细胞传代培养液；
2)无菌采集胎盘组织，经过清洗、消化和分离步骤获得间充质干细胞；按照8×104个/ml的密度接种于原代无血清培养液中，每隔3天换液一次，培养7天，收获原代混合细胞，并将培养三天后的经过培养的培养液进行收集并合并，得到间充质干细胞原代培养液；将收获的原代细胞按照1×105个/ml的密度接种于传代无血清培养液中，传代至第五代，每代的经过培养的培养液均进行收集并合并，得到间充质干细胞传代培养液；
3)将收集到的胎盘亚全能干细胞原代培养液、胎盘亚全能干细胞传代培养液、间充质干细胞原代培养液和间充质干细胞传代培养液进行混合，灭菌后，向培养液中加入浓度为12mg/ml的棉籽糖、浓度为0.1mg/ml的枯草杆菌和浓度为0.08ml/ml的磷酸二氢铵，混合均匀后，于15℃、35％o2的潮湿空气静置10天，得到混合培养预混物；
4)将得到的混合培养预混物进行离心操作，收集上清液，灭菌即得所述胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物；
所述原代无血清培养液和传代无血清培养液成分相同，均为opti-mem培养液。
对照例2
一种胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物的修复制剂，包括如下重量分的组分：胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物50和填充剂20；其中，胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物的制备方法如下：
1)无菌采集胎盘组织，经过清洗、消化和分离步骤获得胎盘亚全能干细胞；
2)无菌采集胎盘组织，经过清洗、消化和分离步骤获得间充质干细胞；
3)将胎盘亚全能干细胞按照2×104个/ml的密度、间充质干细胞按照8×104个/ml的密度共同接种于原代无血清培养液中，每隔3天换液一次，培养7天，收获原代混合细胞，并将培养三天后的经过培养的培养液进行收集并合并，得到原代培养液；
4)将收获的原代混合细胞按照1×105个/ml的密度接种于传代无血清培养液中，传代至第五代，每代的经过培养的培养液均进行收集并合并，得到传代培养液；
5)将收集到的原代培养液和传代培养液进行混合，进行离心操作，收集上清液，灭菌即得所述胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物。
所述原代无血清培养液和传代无血清培养液成分相同，均为opti-mem培养液。
对照例3-对照例7
一种胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物的修复制剂，与实施例1的区别在于，胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞的密度比见表1。
表1胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞的密度比
对照例8冻干制剂
一种胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物的冻干制剂，包括如下组分：
胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物70
金丝桃苷7.5
葡糖胺葡聚糖18.75
制备方法与实施例6相同。
对照例9冻干制剂
一种胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物的冻干制剂，包括如下组分：
制备方法与实施例6相同。
对照例10冻干制剂
一种胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物的冻干制剂，包括如下组分：
制备方法与实施例6相同。
对照例11冻干制剂
一种胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物的冻干制剂，包括如下组分：
制备方法：1)溶液a获取步骤：在0℃条件下，无菌条件下，，按照重量份数将枸缘酸钠溶于水中，至质量浓度为1.5％，然后将金丝桃苷和果乳糖加入到枸缘酸钠水溶液中进行混合，混合均匀后，加入胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物，搅拌混合10min，得到溶液a；
2)装罐步骤：将步骤1)得到的溶液a过滤除菌三次，分装至储罐；
3)预冻步骤：将隔板温度降至-7℃进箱，将冻干机的温度调制-45℃，然后将步骤2)处理后的储罐放置于隔板上保温240min；
4)一次干燥：调整冻干机的真空压力为25pa，温度为-25℃，持续12h；
5)二次干燥：调整冻干机的真空压力为5pa，温度为30℃，持续12h。
试验1治疗痤疮效果
1建模
采用kligman法建兔耳痤疮模型，在2周之后，见到局部皮肤粗糙、增厚、变硬，毛囊口有黑色角栓，毛囊口隆起，可见粉刺、丘疹，即为建模成功。
2分组
将建模成功的兔耳痤疮模型分为11组，每组5只，试验1组为实施例1制备的培养提取物，试验2组为实施例2所制备的培养提取物，试验3组为实施例3所制备的培养提取物、对照1-7组分别为对照例1-7所制备的培养提取物，空白组为橄榄油，上述组别用量为0.05g/cm2，连续涂抹3个月。
3试验结果
实验性痤疮的病理组织学判定标准如下：
a级、为漏斗部仅有松散的角化细胞，无粉刺生成，
b级、为漏斗部仅有少量的粘连在一起的角化细胞，漏斗部不扩张；
c级、为毛囊中中等量的角质栓塞，伸入皮脂腺导管，伴随皮脂腺导管的增生，漏斗扩张；、
d级、为毛囊中紧密的角质栓塞引起毛囊重度扩张，皮脂腺导管上皮明显增生，部分皮脂腺发生退变，各组的测定结果见表2。
表2各组对兔耳痤疮的治疗结果
由上述试验结果可知，实施例1、实施例2和实施例3所提供的培养提取物，可以有效治疗痤疮与对照组相比就有显著差异，其中实施例3的治疗效果最佳。对照组1-7相对于实施例1分别考察了细胞培养方法，细胞培养液的处理方法以及胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞的密度比对培养提取物的疗效的影响，由上述结果可知，将两种细胞分别单独培养，得到的培养液进行处理后得到的培养提取物对痤疮无治疗效果，两种细胞合并培养后获得的混合培养液对痤疮治疗效果不明显，本发明所提供的胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物，在治疗痤疮方面具有意想不到的技术效果。
试验2皮肤刺激性试验
1试验材料
试验动物：sd大鼠x只，雌雄各半，320-350g。
2试验方法
将sd大鼠背部脱毛处理9cm2，随机分为6组，试验1组、试验2组、对照1组、对照2组、对照3组和对照4组，试验1组涂覆实施例6的冻干制剂复溶液，试验2组涂覆实施例7的冻干制剂复溶液，对照1组涂覆对照例8的冻干制剂复溶液，对照2组涂覆对照例9的冻干制剂复溶液，对照3组涂覆对照例10的冻干制剂复溶液，对照4组涂覆对照例11的冻干制剂复溶液，每天涂覆2次，连续涂覆3天，于6、24、48、72h观察致敏结果，按照表3进行评分，结果见表4。
表3皮肤刺激反应评分标准
表4冻干制剂刺激性评分结果
3.结论
由试验组和对照组的对比可知，通过本发明提供的冻干制剂，可以保证活性成分质量均衡，性质稳定，在冻干复溶后，无变质，对皮肤无刺激性。