本发明涉及一种生物源性小口径组织工程血管的制备方法，属于组织工程和生物材料领域。
背景技术：
心血管疾病已成为威胁人类健康的首要原因，在动脉硬化疾病的治疗中，旁路移植手术一直是最有效的治疗方式，长期以来，自体血管一直作为治疗小口径血管疾病的金标准，而超过1/3的患者因为血管疾病或者曾行血管手术等原因，无法找到合适的自体血管。在小口径血管疾病的治疗中，如冠状动脉和膝下血管的治疗，人工血管由于无生物活性，易感染，顺应性差，缺乏再生能力等原因，容易引起移植物腔内堵塞，远期通畅率并不理想。
将动物血管经脱细胞处理后，去除血管组织中引起免疫排斥反应的细胞组分，仅保留种属间保守性好的细胞外基质成分，再将自体细胞种植到脱细胞基质构建的支架上，并在体外进行培养，可以构建组织工程血管。
由于脱细胞基质来源于天然血管，能够最大程度地“复制”正常血管的超微结构和生物学特性，从而可以拥有类似正常血管的力学特性，并能充分模拟脱细胞基质支架在体内与细胞之间的相互作用，从而达到构建完美的组织工程血管移植物的要求。
脱细胞方法主要分为物理方法和化学方法，单纯的化学方法由于需要将血管基质长时间浸入高浓度的去垢剂或者酶液中，高浓度的化学制剂长期作用于血管易引起细胞外基质成分的破坏和细胞毒性的不断积累，严重影响脱细胞基质的体外力学强度，基质内残留的毒性物质阻碍体内外细胞存活，植入体内后易引起毒性反应。
冻融法是指采用反复冷冻与融化，致使细胞中形成冰晶及剩余液体中盐溶液浓度增高可以引起细胞破裂。这种方法简单有效，能够高效裂解血管壁表面的内皮细胞和壁内的平滑肌细胞，且不会对细胞外基质成分造成明显影响。同时，冻融法可以有效破坏具有胞膜结构的细菌等微生物，达到灭菌的效果。冻融处理后的血管材料更加多孔，使得后续的脱细胞化学试剂有效地渗透入深层血管壁，提高化学脱细胞效率。
胰蛋白酶可以有效破坏细胞-细胞、细胞-基质之间的连接，可单独作为脱细胞试剂使用，是最为高效的脱细胞试剂，但胰蛋白酶作用缺乏特异性，会直接破坏细胞外胶原、弹性纤维以及多种细胞外成分，影响细胞外基质的稳定性和力学强度，本研究组曾试图单独使用胰蛋白酶进行脱细胞，得到的脱细胞基质力学强度受到显著影响，因此，本研究组认为脱细胞方案中应尽可能不使用胰蛋白酶或者使用低浓度的胰蛋白酶。
Triton X-100作为一种相对温和的去垢剂，虽然对细胞外成分破坏较小，但单独使用难以获得满意的脱细胞效果。SDS作为常用的去垢剂能够完全去除血管壁内的细胞成分和核物质，但是SDS会破坏蛋白-蛋白之间的连接，高浓度(1％)的SDS会对基质内胶原成分造成明显破坏，因此本实验组采用低浓度的SDS进行脱细胞处理，以尽可能降低对基质的破坏。
尽管脱细胞后的基质可以通过交联的方法提升其力学强度，但是交联后的血管基质其生物学特性受到破坏，在体内不利于细胞的粘附、侵润和生长，交联法同样会影响血管基质的顺应性，易引起支架两端缝合部位内膜增生和官腔闭塞，影响脱细胞基质在体内的长期存活。除此之外，交联后的血管基质更易引起免疫反应，从而产生严重的纤维化。
综上，制定合理的脱细胞方案在脱细胞血管的制备中仍是亟待解决的问题，既要保证彻底脱除血管内的细胞成分，同时尽可能降低对细胞外基质成分的破坏，保留足够的力学强度和生物活性，同时应具备一定的孔径从而利于细胞在基质内的生长和营养物质的交换。因此，选择合适的脱细胞方法，探索合理的脱细胞条件，是解决以上问题的关键所在。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是：提供一种能够脱除血管组织内的细胞成分，并最大程度保护脱细胞基质的结构完整性的脱细胞方法，该方法能彻底去除细胞、得到孔径合适、利于细胞体外粘附和生长的小口径组织工程血管。
本发明要解决的另一个技术问题是：提供上述方法制备的组织工程血管。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种生物源性小口径组织工程血管的制备方法，包括如下步骤：
(1)冻融：将新鲜动物血管放在含有0.02％～0.2％EDTA的PBS缓冲液中，置于-80℃速冻1～3小时，取出后立刻放置于37℃条件下10～30分钟解冻；重复上述操作2～5次，得到血管材料；
(2)去除冻融后脱落的细胞碎片：将步骤(1)得到的血管材料置于蒸馏水中充分冲洗，除去脱落的细胞残渣；
(3)脱细胞：将步骤(2)得到的血管材料浸泡在含有0.02％～0.2％EDTA和1％TritonX-100的Tris-HCl缓冲液中在室温(20℃～25℃)下摇振12～48小时，之后用蒸馏水充分清洗去除残留的TritonX-100；然后将得到的血管组织置于含有0.05％～0.5％的十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate，SDS)的Tris-HCl缓冲液中，在室温(20℃～25℃)摇振60～80小时，得到脱细胞血管基质；
(4)清除去垢剂：将步骤(3)得到的脱细胞血管基质在蒸馏水中充分摇晃洗涤，彻底清除残留的脱细胞试剂，后用PBS缓冲液摇振清洗12～36小时，得到脱细胞组织工程血管，消毒后浸于含1％青霉素/链霉素的无菌PBS缓冲液中，置于-20℃冰箱保存。
所述步骤(1)冻融：是指将新鲜动物血管放在含有0.1％EDTA的PBS缓冲液中，置于-80℃速冻2小时，取出后立刻放置于37℃条件下水浴20分钟解冻；重复上述操作3次，得到血管材料。
所述步骤(1)中的动物血管为猪颈动脉或猪髂动脉。
所述步骤(3)脱细胞，是指将步骤(2)得到的血管材料浸泡在含有0.1％EDTA和1％TritonX-100的Tris-Hcl缓冲液中室温下摇振24小时，之后用蒸馏水充分清洗去除残留的TritonX-100；然后将得到的血管组织置于含有0.1％的十二烷基硫酸钠溶液的Tris-Hcl缓冲液中，室温下摇振72小时，每24小时更换一次液体，得到脱细胞血管基质；
所述步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)中的用蒸馏水冲洗或洗涤的温度为4℃。
本发明人经反复摸索，获得了合适的对动物血管进行脱细胞条件，尤其是采用了物理冻融的方法结合低浓度的SDS尽可能降低对基质成分的破坏，同时能够有效去除细胞，获得了满意的结果。
本发明采用了物理联合化学的方法，首先通过冻融有效裂解血管内细胞，同时保留完整的细胞外结构，再通过温和的非离子型去垢剂(Triton X-100)和低浓度的离子型去垢剂(SDS)的脱细胞方案来去除组织内的细胞和核酸成分。胰蛋白酶作为一种高效的脱细胞试剂，可单独用于脱细胞并起到良好的脱细胞效果，但其会直接作用于胶原等细胞外基质成分，严重破坏细胞基质结构导致力学性能明显受损。其次，单独使用TritonX-100脱细胞效果并不理想，但其对基质成分破坏较小。再次，SDS可有效破坏细胞内组分和核酸物质，高浓度SDS更容易破坏基质，低浓度SDS不仅能彻底去除血管内细胞成分，而且能完好保留其他基质成分。此外，低浓度化学试剂更易从血管基质内洗去，从而避免基质支架内有毒物质的残留。因此，本发明中采用冻融、Triton X-100和低浓度SDS的方案在彻底脱去细胞的同时保留完整的细胞外结构。
同时本发明为了降低冻融和化学脱细胞过程中由于细胞破裂释放出的金属蛋白酶对基质内蛋白等成分的不利影响，冻融液和裂解液中都添加了适宜浓度的EDTA来抑制该作用，起到保护基质支架的效果。
为了更加高效地达到脱细胞目的，本发明中使用的脱细胞溶液均由低渗的10mM Tris-Hcl配制，低渗作用可促使细胞胀溶，从而加快细胞裂解。
在本发明中，冻融温度选择-80℃，因为在较高温度(-20℃)条件下并不能保证细胞内冰晶形成，细胞膜破裂不完全，且在此条件下需要延长冷冻时间，影响脱细胞效率。虽然更低温度(液氮，-196℃)作用下细胞能够被彻底破坏，但是该条件下同样会导致细胞外成分的破坏，导致胶原纤维的断裂，影响血管基质的完整性。
本发明中，在室温条件下进行化学脱细胞处理，该温度下既不会因为高温导致细胞外生物活性成分的流失，同时又保证了化学试剂的作用温度。虽然低温更有利于保护血管基质，但是会明显延长脱细胞试剂作用时间，血管长期侵泡在具有组织毒性的溶液中会引起血管内毒性残留，且化学试剂会长时间破坏细胞外成分，损害基质结构。
另一方面，本发明提供了一种生物源性小口径组织工程血管，以猪颈动脉或猪髂动脉为材料，采用上述方法制备得到。
本发明克服了现有技术方法的不足，探索出新的脱细胞方法，选择合适的脱细胞条件，构建一种较为理想可行的小口径组织工程血管。即在保证彻底去除细胞的同时，尽可能降低对细胞外基质结构成分和力学强度的影响，并具备合适的孔径，同时利于细胞在体外粘附和生长。
再一方面，本发明所述的方法用于制备组织工程血管支架的用途。
所述的组织工程血管支架是指去除细胞的动物来源的血管支架。通过该途径得到的小口径血管支架材料可以用于冠状动脉搭桥，下肢动脉旁路移植及血液透析过程中的动静脉造瘘等方面，具有广阔的应用前景。
再一方面，本发明提供了一种制备组织工程血管的试剂盒，由以下试剂组成：
冻融液：含有0.02％～0.2％EDTA的PBS缓冲液；
脱细胞液A：含有0.02％～0.2％EDTA和1％TritonX-100的Tris-HCl缓冲液；
脱细胞液B：含有0.05％～0.5％的十二烷基硫酸钠的Tris-HCl缓冲液；
洗涤液：PBS缓冲液；
保存液：含1％青霉素/链霉素的无菌PBS缓冲液。
优选的，所述的一种制备组织工程血管的试剂盒，由以下试剂组成：
冻融液：含有0.1％EDTA的PBS缓冲液；
脱细胞液A：含有0.1％EDTA和1％TritonX-100的Tris-HCl缓冲液；
脱细胞液B：含有0.1％的十二烷基硫酸钠的Tris-HCl缓冲液；
洗涤液：PBS缓冲液；
保存液：含1％青霉素/链霉素的无菌PBS缓冲液。
所述的试剂盒中的PBS溶液是实验室常用试剂，可以自行配制，因此本试剂盒也可以不含洗涤液。
本发明的优点是：提供了一种能够脱除血管组织内的细胞成分，并最大程度保护脱细胞基质的结构完整性的脱细胞方法和试剂组合。该方法操作简单，无需特殊仪器设备，脱细胞液室温下即可发挥作用。冻融液和脱细胞液中低浓度的EDTA一方面可以破坏细胞对于周围基质的粘附，同时能够很好地避免细胞裂解过程中释放的消化酶对材料的降解作用。该脱细胞试剂组合摒弃了以往常用的蛋白酶等酶类试剂，因为酶对胶原蛋白有强的消化作用，易导致脱细胞基质成分丢失和使力学性能受损。除此之外，低渗的Tris-HCl缓冲液在有效保护血管材料的同时可以引起细胞胀溶，从而进一步加强脱细胞作用。由于材料内残留的化学试剂会不同程度影响细胞的生长繁殖，因此低浓度的十二烷基硫酸钠进行脱细胞处理后更易被清除，避免了毒性物质残留。
下面结合附图和具体实施方式进一步详细说明，并非对本发明的限制。凡依照本发明内容进行的本领域等同替换，均属于本发明保护范围。
附图说明
图1为新鲜未处理的血管(a.b.c)和脱细胞血管基质(d.e.f)的组织形态学表现；图中分别为HE染色(a.d)、Masson染色(b.e)和EVG染色(c.f)。
图2为新鲜未处理的血管(a)和脱细胞血管基质(b)的DAPI染色结果。
图3为新鲜未处理的血管(a)和脱细胞血管基质支架(b.c)管腔面的扫描电镜结果。
图4为新鲜未处理的血管和脱细胞血管基质在单轴拉伸试验下的应力应变曲线。
图5为脱细胞血管基质支架种植骨髓间充质干细胞后的管腔面的扫描电镜图。
具体实施方式
实施例1：制备组织工程血管
一、材料
新鲜动物血管：新鲜猪颈动脉血管(也可以使用猪髂动脉血管)
二、方法
(1)冻融
将新鲜动物血管放在含有0.1％EDTA的PBS缓冲液中，置于-80℃深低温冰箱2小时，取出后立刻放置于37℃水浴锅中20分钟。重复上述操作2次，即共进行3次冻融循环；
(2)去除冻融后脱落的细胞碎片
将步骤(1)得到的血管材料置于蒸馏水中在4℃条件下充分冲洗，以除去脱落的细胞残渣；
(3)去垢剂脱细胞
将步骤(2)得到的血管材料浸泡在含有0.1％EDTA和1％TritonX-100的Tris-HCl缓冲液中室温下摇振24h，之后用蒸馏水充分清洗以去除残留的TritonX-100。然后将得到的血管组织置于含有0.1％SDS的Tris-HCl缓冲液中，室温下摇振72小时，每24小时更换一次液体。
(4)去除去垢剂
将步骤(3)得到的脱细胞血管基质在蒸馏水中充分摇晃洗涤以彻底清除残留的脱细胞试剂，后用PBS摇振清洗24小时来平衡组织内渗透压，最后将得到的脱细胞支架消毒后浸于含1％青霉素/链霉素的无菌PBS中，置于-20℃冰箱保存。
三、检测
(一)检测方法
1.形态学观察(该检测方法中均以新鲜未处理血管作为对照组)
1.1光学显微镜
将实施例1制备的脱细胞血管截取一段管状标本，用4％多聚甲醛固定后石蜡包埋，切取5μm进行HE、Masson染色、EVG染色和DAPI染色，光学显微镜下观察染色结果。
1.2电子显微镜
将上述方法得到的管型脱细胞血管样本经过戊二醛固定后再干燥，置于离子溅射仪中喷金，于扫描电镜下观察血管腔内表面结构。
2.力学性能检测(该检测方法中均以新鲜未处理血管作为对照组)
2.1断裂拉伸强度和断裂伸长率的检测：将实施例1得到的管状血管沿长轴切开，应用自制的模具得到哑铃型血管标本，室温下在DLL-5000万能材料实验机上进行单轴拉伸实验，牵拉速度为50mm/min，测试过程中保持样本湿润，记录拉伸力和断裂伸长率，拉伸强度＝拉伸力/材料横截面积，绘制应力应变曲线，检测组织工程血管的抗拉伸能力和变形能力。
2.2爆破强度测定：将实施例1制备的长约6cm的脱细胞血管连接于爆破压测试装置，游离端封闭，通过调节控制阀使空气以一定速率不断充盈官腔，压力测试表可记录血管破裂前承受的最高压力，表示血管对内部压力变化的耐受能力。
2.3缝合强度测定：将实施例1制备的管状血管材料一端夹在DLL-5000万能材料实验机上，另一端以一根5-0prolene线缝合后固定于另一个夹具上，然后以50mm/min的速度匀速牵拉直至缝线脱出，记录缝线脱出前的最大力，检测血管移植物材料的可缝合性。
3.孔隙检测(该检测方法中均以新鲜未处理血管作为对照组)
将实施例1制备的管状血管材料经低压冻干后进行孔隙检测。孔隙测定采用Autopore IV 9500压贡仪，压力范围0.5Psia-44500Psia，高压测量最小孔径可达0.003μm，用于检测血管材料内部的孔径分布和孔隙率。
4.骨髓间充质干细胞种植试验
无菌条件下将脱细胞血管裁剪成大小约1×1cm的片状材料，置于24孔板底部，管腔面朝上，取第四代生长良好的骨髓间充质干细胞用胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，以1×104cm-2的密度将1ml细胞悬液接种于支架材料上，置37℃，5％CO2培养箱中培养，培养72h后将材料取出后于扫描电镜下观察细胞粘附和生长状况。
(二)检测结果
1.形态学观察
1.1光学显微镜
组织切片的HE染色结果表明，相比于未处理的血管(图1a)，经本发明的脱细胞方法处理后，猪髂动脉或颈动脉的细胞成分被完全清除，未发现细胞核残留(图1d)。DAPI染色结果同样证明了脱细胞材料中未见核酸物质(图2)。Masson三色法染色(图1b、e)和EVG染色(图1c、f)表明细胞外基质的胶原蛋白和弹性蛋白成分保存完整。
1.2电子显微镜
新鲜未处理的动脉血管管腔面可见内皮细胞呈波浪状形成平滑的内皮细胞层(图3a)。扫描电镜结果表明脱细胞基质管腔面没有内皮细胞及其残余成分(图3b)，高倍镜下可见脱细胞血管内表面为疏松的多孔性结构，蛋白纤维有序排列，无断裂现象(图3c)。
2.力学性能检测结果
新鲜未处理的血管和脱细胞血管的力学性能检测结果如下。图4为脱细胞前后血管材料在单轴拉伸实验下的应力应变曲线。表1为两种血管材料的力学结果。从表中数据和应力应变曲线变化趋势可见脱细胞血管的力学性能与新鲜未处理血管相比有较好的一致性。
表1
3.孔隙检测结果
表2所示为脱细胞前后血管材料的孔隙和孔径分布变化，可以看出脱细胞作用主要导致基质内孔径增大，主要表现为孔径大于10μm的总孔体积明显增大，而脱细胞前后的孔隙率无明显差别。相关报道指出细胞定植和营养物质交换所需的最小孔径为10μm，经本发明得到的脱细胞血管基质支架具有足够的孔径。
表2
4.细胞种植试验结果
图5所示为扫描电镜下脱细胞血管材料种植细胞后管腔面的形貌特征，图中可见梭形的骨髓间充质干细胞伸出伪足紧密贴附于脱细胞材料表面，细胞结构和形态完好，无不良生长。
实施例2：制备组织工程血管
一、材料
新鲜动物血管：猪颈动脉血管或猪髂动脉血管
二、方法
(1)冻融
将新鲜动物血管放在含有0.02％EDTA的PBS缓冲液中，置于-80℃深低温冰箱1小时，取出后立刻放置于37℃水浴锅中10min。重复上述操作1次，即共进行2次冻融循环；
(2)去除冻融后脱落的细胞碎片
将步骤(1)得到的血管材料置于蒸馏水中在4℃条件下充分冲洗，以除去脱落的细胞残渣；
(3)去垢剂脱细胞
将步骤(2)得到的血管材料浸泡在含有0.02％EDTA和1％TritonX-100的Tris-Hcl缓冲液中室温下摇振48小时，之后用蒸馏水充分清洗以去除残留的TritonX-100。然后将得到的血管组织置于含有0.05％SDS的Tris-Hcl缓冲液中，室温下摇振80小时，每24小时更换一次液体。
(4)去除去垢剂
将步骤(3)得到的脱细胞血管基质在蒸馏水中充分摇晃洗涤以彻底清除残留的脱细胞试剂，后用PBS摇振清洗36小时来平衡组织内渗透压，最后将得到的脱细胞支架消毒后浸于含1％青霉素/链霉素的无菌PBS中，置于-20℃冰箱保存。
实施例3：制备组织工程血管
一、材料
新鲜动物血管：猪髂动脉血管或猪颈动脉血管
二、方法
(1)冻融
将新鲜动物血管放在含有0.2％EDTA的PBS缓冲液中，置于-80℃深低温冰箱3小时，取出后立刻放置于37℃水浴锅中30min。重复上述操作4次，即共进行5次冻融循环；
(2)去除冻融后脱落的细胞碎片
将步骤(1)得到的血管材料置于蒸馏水中在4℃条件下充分冲洗，以除去脱落的细胞残渣；
(3)去垢剂脱细胞
将步骤(2)得到的血管材料浸泡在含有0.2％EDTA和1％TritonX-100的Tris-Hcl缓冲液中室温下摇振12小时，之后用蒸馏水充分清洗以去除残留的TritonX-100。然后将得到的血管组织置于含有0.5％SDS的Tris-Hcl缓冲液中，室温下摇振60小时，每24小时更换一次液体。
(4)去除去垢剂
将步骤(3)得到的脱细胞血管基质在蒸馏水中充分摇晃洗涤以彻底清除残留的脱细胞试剂，后用PBS摇振清洗12小时来平衡组织内渗透压，最后将得到的脱细胞支架消毒后浸于含1％青霉素/链霉素的无菌PBS中，置于-20℃冰箱保存。
实施例4.一种制备组织工程血管的试剂盒
一.试剂盒组成
冻融液：含有0.1％EDTA的PBS缓冲液；
脱细胞液A：含有0.1％EDTA和1％TritonX-100的Tris-HCl缓冲液；
脱细胞液B：含有0.1％的十二烷基硫酸钠的Tris-HCl缓冲液；
洗涤液：PBS缓冲液；
保存液：含1％青霉素/链霉素的无菌PBS缓冲液。
二.试剂盒使用方法
(1)冻融
将新鲜动物血管放在冻融液中，置于-80℃深低温冰箱2小时，取出后立刻放置于37℃水浴锅中20分钟。重复上述操作2次，即共进行3次冻融循环；
(2)去除冻融后脱落的细胞碎片
将步骤(1)得到的血管材料置于蒸馏水中在4℃条件下充分冲洗，以除去脱落的细胞残渣；
(3)去垢剂脱细胞
将步骤(2)得到的血管材料浸泡在脱细胞液A中室温下摇振24h，之后用蒸馏水充分清洗以去除残留的脱细胞液A。然后将得到的血管组织置于脱细胞液B中，室温下摇振72小时，每24小时更换一次液体。
(4)去除去垢剂
将步骤(3)得到的脱细胞血管基质在蒸馏水中充分摇晃洗涤以彻底清除残留的脱细胞试剂，后用洗涤液摇振清洗24小时来平衡组织内渗透压，最后将得到的脱细胞支架消毒后浸于保存液中，置于-20℃冰箱保存。
实施例5.一种制备组织工程血管的试剂盒
一.试剂盒组成
冻融液：含有0.02％EDTA的PBS缓冲液；
脱细胞液A：含有0.02％EDTA和1％TritonX-100的Tris-HCl缓冲液；
脱细胞液B：含有0.05％的十二烷基硫酸钠的Tris-HCl缓冲液；
洗涤液：PBS缓冲液；
保存液：含1％青霉素/链霉素的无菌PBS缓冲液。
二.使用方法
同实施例4。
实施例6.一种制备组织工程血管的试剂盒
一.试剂盒组成
冻融液：含有0.2％EDTA的PBS缓冲液；
脱细胞液A：含有0.2％EDTA和1％TritonX-100的Tris-HCl缓冲液；
脱细胞液B：含有0.5％的十二烷基硫酸钠的Tris-HCl缓冲液；
洗涤液：PBS缓冲液；
保存液：含1％青霉素/链霉素的无菌PBS缓冲液。
二.使用方法
同实施例4。