专利名称：用于组织工程的细胞基质蛋白生物支架材料的制备方法
技术领域：
本发明属于生物材料制备技术领域，涉及一种用于组织工程的细胞基质蛋白生物材料的制备方法。
背景技术：
基质蛋白是结缔组织的主要蛋白成分，作为组织工程的支架材料具有优良的机械性能，其重要原因在于基质蛋白可天然交联，形成组织工程产品所需的三维结构。因此，基质蛋白能在广泛的范围内满足组织工程生物材料的要求。目前，基质蛋白成分(如胶原、硫酸软骨素、胞外基质)在医药学方面有广泛的应用，如可用于外科烧伤治疗剂、用作药物载体或修复材料(软膏、缝线)等。但在组织工程方面的应用对基质蛋白的要求较高，应尽可能地将其处理为酸溶性、非变性的、非变应的、无不良杂质的形式。1994年公开的专利申请“人胎盘胶原的提取及其制备方法”，该方法利用人胎盘经清洗、打碎、提取、混匀而成。其存在以下缺点①成分单一，仅为胶原成分；材料为人胎盘，来源有限，不适合作为组织工程的大规模使用；②获得的最终产品为液态，无法对产品含量进行检测；③产品无可塑性，无法用于组织工程产品的研制。而1999年公开的专利申请“医用胶原蛋白海绵及其制造工艺”最终产品也仅为胶原成分。其缺点是①材料利用蛋白酶处理，破坏了蛋白的天然构型；②对材料进行交联，破坏了蛋白的生物相容性。
发明内容
针对上述现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种具有酸溶性、非变性和非变应的可调控降解性的细胞基质蛋白生物支架材料的制备方法，所制备的材料可明显提高种子细胞对材料的粘附性，以及材料的生物相容性。
由于基质蛋白具有低免疫源性，与其它具有免疫性的蛋白质相比，具有优越的生物相容性和安全性，被认为是最有用的生物材料之一。因此，本发明所制备的用于组织工程的细胞基质蛋白生物材料为纯化的和非变性的蛋白，以I、IV胶原蛋白为主，并含有透明质酸、蛋白多糖及多种有助于细胞增殖的细胞因子。根据这些对生物材料性能的要求，本发明制备方法包括清洗、打碎、提取、混匀、纯化的步骤，其具体操作步骤为1.将胎牛真皮、肌腱、骨组织洗涤后破碎为颗粒；2.用三羟甲基氨基甲烷/乙二胺四乙酸溶液洗涤组织颗粒；3.用0.1～0.5M乙酸缓冲液从组织颗粒中提取基质蛋白；4.在提取液中加入无机盐，盐析沉淀粗制基质蛋白；5.将沉淀用0.1～0.5M乙酸缓冲液溶解；6.再用无机盐盐析沉淀，得到基质蛋白粗品；7.用三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH＝7.0)溶解基质蛋白粗品；8.用不同无机盐浓度梯度去除III型胶原，获得纯化的基质蛋白；9.用0.05～0.2M乙酸缓冲液溶解纯化基质蛋白；10.用氢氧化钠溶液透析该基质蛋白溶液，使其为中性；11.蒸馏水透析3～6次；12.用冻干方法得到基质蛋白产品，其为乳白色海绵状结构；13.产品灭菌后，4℃保存。
在上述方法中，用三羟甲基氨基甲烷/乙二胺四乙酸溶液既可去除原材料中与细胞基质蛋白无关的杂质如脂肪等，又可抑制细胞基质蛋白的溶解。通过碱性溶液透析基质蛋白溶液使其为中性的原因是由于现有技术获得的产品通常为弱酸性，无法直接与细胞复合，应用时必须进行水化，影响了种子细胞对材料的附着，从而影响了产品在组织工程的应用。
上述方法中细胞基质蛋白粗品中的胶原含量比纯化后的细胞基质蛋白要高，其可用于组织工程研究的动物实验，而纯化后的细胞基质蛋白的免疫源性较低，对人体无毒副作用，可大量提取用于组织工程产品的研发。
本发明制备的细胞基质蛋白具有可生物降解性和再生性，在体内能被绝大多数蛋白酶水解，这就是基质蛋白具有可生物降解性的原理。所制备的基质蛋白同时具有纤维的再形成性，经纯化的可溶性基质蛋白能在体外再次形成与天然胶原纤维相似的有序纤维状结构。本发明制备的基质蛋白具有良好的生物相容性，基质蛋白材料无论是在被吸收前作为形成新组织的骨架，还是被吸收同化进入宿主，成为宿主组织的一部分，都与细胞周围的基质有着良好的相互作用，表现出良好的生物相容性，能逐渐成为具有正常生理功能细胞和组织整体的一部分。同时，还可促进不同类型细胞的生长。
本发明的制备方法中未使用交联剂戊二醛或间苯二酚，扩大了因毒性而限制其适用范围，经一定时间后细胞基质蛋白可被机体吸收。还可利用其作为具有良好强度的免疫性低的成型医疗材料。本发明的细胞基质蛋白为海绵膜状，可直接用于组织工程产品的构建，也可溶解后用注入的方法制成型管、片材、网等，同时可与其它人工或天然材料组合形成凝胶状用于皮肤、血管、牙髓的组织工程和三维培养。
与现有技术相比，本发明的优点在于所制备的细胞基质蛋白生物材料为非变性、纯度高，可根据不同的应用要求制备为不同形态，如凝胶状、海绵状、膜状、胶片状或液体状；能广泛应用于组织工程及三维培养。保持了蛋白的生物学活性、对细胞的黏附和增殖具有促进作用。该材料具有优良的机械性能、降解速度可调、生物相容性好、对机体无毒副作用；并可与其他生物材料(如壳聚糖、聚乳酸/聚乙醇酸、钙磷酸盐等)复合，根据需要制作成多孔海绵、凝胶、膜、微粒等广泛应用于皮肤、骨、软骨、牙髓、牙周的组织工程及三维培养。与目前用于组织工程生物材料的高分子聚合物相比，可明显提高种子细胞对材料的粘附特性，降低材料的细胞毒性并改善支架材料的制备工艺。此外，本发明的原料来源广泛，价格低廉，可大规模制备。
具体实施例方式
现通过下述实施例对本发明方法作进一步说明实施例11)将胎牛真皮、肌腱、骨组织洗涤后破碎为颗粒；2)用0.1M三羟甲基氨基甲烷/1mM乙二胺四乙酸1∶1混合液洗涤组织颗粒24小时，每6小时换液1次；3)用0.5M乙酸缓冲液从组织颗粒中提取基质蛋白72小时，每24小时换液1次；4)将提取液通过加入1M NaCl盐析沉淀；5)再用0.5M乙酸缓冲液溶解沉淀；6)再加入1M NaCl盐析沉淀，得到基质蛋白粗品；7)用蒸馏水透析4次，去除残留的乙酸缓冲液；8)冷冻干燥后得到基质蛋白粗品，灭菌后4℃保存。
实施例2将实施例1中6)得到的基质蛋白粗品再按如下处理1)用0.1M三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH 7.0)溶解粗制蛋白；2)用200目滤网过滤并纯化溶液；3)在溶液中加入不同梯度NaCl去除III型胶原，获得纯化的基质蛋白；4)用蒸馏水透析5次，去除残留的乙酸缓冲液；5)冷冻干燥后得到基质蛋白纯品(偏酸)，灭菌后4℃保存。
实施例3将实施例2中3)得到的基质蛋白纯品再按如下处理1)用0.05M乙酸缓冲液溶解纯化后的基质蛋白；2)通过氢氧化钠溶液透析该基质蛋白溶液，使其为中性；3)蒸馏水透析6次，去除残余的乙酸缓冲液；4)-30℃冷冻干燥得到基质蛋白产品，其为乳白色海绵状结构；5)产品灭菌后，4℃保存。
权利要求
1.一种用于组织工程的细胞基质蛋白生物材料的制备方法，包括清洗、打碎、提取。纯化步骤，其特征在于，操作步骤为(1)将胎牛真皮、肌腱、骨组织洗涤后破碎为颗粒；(2)用三羟甲基氨基甲烷/乙二胺四乙酸溶液洗涤组织颗粒；(3)用0.1-0.5M乙酸缓冲液从组织颗粒中提取基质蛋白；(4)在提取液中加入无机盐，盐析沉淀；(5)将沉淀用0.1-0.5M乙酸缓冲液溶解；(6)再用无机盐盐析沉淀，得到细胞基质蛋白粗品；(7)蒸馏水透析3-6次；(8)用冻干方法获得细胞基质蛋白产品，灭菌后，4℃保存。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述的步骤(6)和(7)之间还有(1)用三羟甲基氨基甲烷缓冲液溶解基质蛋白粗品；(2)用不同无机盐浓度梯度去除III型胶原，获得纯化的基质蛋白。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，将得到的纯化细胞基质蛋白做如下处理(1)用0.05-0.2M乙酸缓冲液溶解纯化后的基质蛋白；(2)通过氢氧化钠溶液透析该基质蛋白溶液，使其为中性。
全文摘要
本发明属于生物材料制备技术领域，涉及一种用于组织工程的细胞基质蛋白生物材料的制备方法。特征是用乙酸缓冲溶液提取基质蛋白；用无机盐沉淀；用不同梯度的无机盐去除基质蛋白中的III型胶原，得到纯化的基质蛋白。本发明的优点是所制备的产品具有非变性、纯度高、粘附性好、无毒副作用的特点，可根据要求制成不同形态的生物材料，广泛用于皮肤、骨、软骨、牙髓、牙周的组织工程及三维培养，价格低廉，并可大规模制备。
文档编号A61L27/60GK1493366SQ0313453
公开日2004年5月5日 申请日期2003年9月2日 优先权日2003年9月2日
发明者金岩, 聂鑫, 金 岩 申请人:中国人民解放军第四军医大学口腔医学院, 陕西艾尔肤生物工程有限责任公司, 中国人民解放军第四军医大学口腔医学