用于治疗丙型病毒性肝炎的药物组合物的制作方法

本发明涉及医药
技术领域：
，具体地涉及一种用于治疗丙型病毒性肝炎的药物组合物，以及该药物组合物在制备用于治疗丙型病毒性肝炎药物和试剂盒中的应用。
背景技术：
：丙型病毒性肝炎，简称丙肝，是一种由丙型肝炎病毒(hcv)感染引起的病毒性肝炎，主要经输血、针刺、吸毒等途径传播。据世界卫生组织的统计，全球丙肝病毒的感染率约为3％，估计约1.8亿人感染了丙肝病毒，每年新发病例约3.5万例。丙型肝炎可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌(hcc)。丙肝对患者的健康和生命危害极大，已成为严重的社会和公共卫生问题。拉维达韦(ravidasvir，代号asc16)是歌礼生物科技有限公司研发的一种丙肝治疗药物，是一种强效的泛基因型hcvns5a抑制剂，可选择性抑制多功能的hcvns5a蛋白。临床试验已显示，拉维达韦是一种有效的丙肝治疗药物。由于病毒复制期间病毒rna复制酶容易发生错误，耐药变异体可能之前就已存在，和/或在存在抑制剂的情况下迅速出现。耐药病毒的出现是开发针对hcv感染的有效抗病毒治疗方案的主要挑战。拉维达韦耐药变异体的出现导致拉维达韦在抗hcv感染的治疗中出现了问题。技术实现要素：为了解决现有技术存在hcv耐药变异体的问题，本发明针对拉维达韦与其他抗丙型肝炎病毒的活性成分组成的药物组合物的抗病毒活性和抗病毒谱进行了深入和广泛的研究，从而提供了一种能够有效用于治疗丙型病毒性肝炎，特别是能够有效抑制拉维达韦耐药变异体的药物组合物。达诺瑞韦(danoprevir，dnv，代号asc08)是大环拟肽类化合物，属于第二代蛋白酶抑制剂，其竞争性抑制hcvns3/4a蛋白酶的活性；相比第一代蛋白酶抑制剂，达诺瑞韦具有多基因型抑制病毒，抗病毒活性更强，耐药屏障更高，安全性更好的特点。本发明提供的药物组合物包括：拉维达韦或其可药用盐和达诺瑞韦或其可药用盐。优选地，拉维达韦的可药用盐为盐酸拉维达韦，达诺瑞韦的可药用盐为达诺瑞韦钠。根据本发明所述的药物组合物，其中拉维达韦或其可药用盐与达诺瑞韦或其可药用盐的质量比为1∶1。优选地，本发明的药物组合物还包括利托那韦或其可药用盐；更优选地，拉维达韦或其可药用盐、达诺瑞韦或其可药用盐、利托那韦或其可药用盐三者的质量比是1∶1∶1。优选地，本发明的药物组合物还包含药学上可接受的辅料，例如，所述药学上可接受的辅料选自泊洛沙姆188、甘露醇160c、甘露醇200sd、微晶纤维素(ph101)、异麦芽、司盘20或聚乙烯吡咯烷酮(va64)中的一种或多种。优选地，本发明的药物组合物为薄膜包衣片。根据本发明的一个实施方案，在本发明的药物组合物中，拉维达韦或其可药用盐和达诺瑞韦或其可药用盐分开放置。更优选地，本发明的药物组合物还包括分开放置的利托那韦或其可药用盐。根据本发明的一个实施方案，达诺瑞韦或其可药用盐与拉维达韦或其可药用盐的给药剂量分别是：拉维达韦或其可药用盐每日一次，200mg；达诺瑞韦或其可药用盐每日两次，每次100mg。根据本发明的一个实施方案，达诺瑞韦或其可药用盐、拉维达韦或其可药用盐与利托那韦或其可药用盐的给药剂量分别是：拉维达韦或其可药用盐每日一次，200mg；达诺瑞韦或其可药用盐每日两次，每次100mg；利托那韦或其可药用盐每日两次，每次100mg。因此，本发明还提供了一种用于治疗丙型病毒性肝炎的试剂盒，其包括分开放置的一单位剂量的拉维达韦或其可药用盐、一单位剂量的达诺瑞韦或其可药用盐和另一单位剂量的达诺瑞韦或其可药用盐。优选地，所述一单位剂量的拉维达韦或其可药用盐为200mg的拉维达韦或其可药用盐，一单位剂量的达诺瑞韦或其可药用盐和另一单位剂量的达诺瑞韦或其可药用盐分别为100mg的达诺瑞韦或其可药用盐；更优选地，所述试剂盒还包括分开放置的一单位剂量的利托那韦或其可药用盐和另一单位剂量的利托那韦或其可药用盐。优选地，所述一单位剂量的利托那韦或其可药用盐和另一单位剂量的利托那韦或其可药用盐分别为100mg的利托那韦或其可药用盐。本发明的研究结果证实，asc16和asc08联合应用具有增强效应，显示asc16可与asc08组成有效的联合抗hcv治疗方案。而且，asc16与asc08联合用药方案还扩大了治疗药物的作用谱。更重要的是，二者的联用解决了拉维达韦耐药的问题。ii期临床试验显示，asc16和asc08联合用药方案的总体治愈率(svr12率)为100％(38/38例受试者)，且疗效不受基线ns5a耐药突变的影响。所有受试者接受治疗后普遍耐受良好，治疗期间不良事件绝大部分属于轻度或中度不良事件，无严重不良事件，并且没有受试者因不良事件而退出治疗。因此，本发明的拉维达韦和达诺瑞韦组合是一种有效的丙肝治疗方案，具有重大的临床和社会意义。附图说明以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：图1示出丙肝病毒(hcv)复制子细胞系。具体实施方式本发明结合实施例和附图作进一步说明，但这些实施例并不是对本发明的限制。实施例1非临床药效学研究1.1asc16对hcv的抗病毒效能和作用谱野生型hcv病毒分成7种主要的基因型。为了评估asc16对1a和1b之外的所有其他主要hcv基因型的抗病毒活性，通过分别使用基因型2a、5a或6a的氨基酸9-184，基因型3a的氨基酸9-433、基因型4a的氨基酸6-184或基因型7a的氨基酸1-184替换hcv1bns5a的编码区制作编码其他hcv基因型ns5a基因的关键片段的稳定hcv1b嵌合体复制子细胞系(见图1)。由于ns5a抑制剂的结合位点以及已知的针对该抑制剂的耐药碱基置换位于ns5a蛋白的前100个氨基酸，推断ns5a的n端的184个氨基酸足以代表各个基因型中全长ns5a的特点。所得到的嵌合体复制子可以稳定地转染至lunet细胞且均具有复制能力。表1asc16在hcv基因型几种复制子细胞中的抑制活性hcv基因型氨基酸插入较之hcv1b的氨基酸变化(％)2ans5a17658(33)3ans5a425112(26)4ans5a17938(21)5ans5a17643(24)6ans5a17643(24)7ans5a18460(33)使用标准的3天分析确定asc16在hcv基因型1a、1b、2ans5a、3ans5a、4ans5a、5ans5a、6ans5a和7ans5a复制子细胞中的抑制活性。将抑制剂进行连续稀释并在5％胎牛血清存在的情况下处理复制子细胞达3天的时间，结果见表1。在这些分析中，造成hcv1a和1b病毒复制降低50％(ec50)和90％(ec90)所需的asc16浓度均在皮摩尔(pm)范围内；同时，在这些分析中，asc16浓度在≤0.32nm(0.24ng/ml)下对基因1型病毒复制的抑制率均达到了90％。asc16针对其他hcv基因型的易感(ec50)浓度介于0.04与1.14nm之间，所有主要hcv基因型的ec90均≤3.35nm(<3ng/ml)。表2hcvns5a抑制剂asc16的抑制作用hcvec50(nm)ec50(ng/ml)ec90(nm)ec90(ng/ml)基因型均值±sd均值±sd1a0.12±0.010.090.32±0.020.241b0.02±0.0020.0150.03±0.0040.022ans5a0.14±0.030.120.45±0.10.383ans5a1.14±0.30.953.35±1.32.804ans5a0.05±0.010.040.13±0.0150.115ans5a0.04±0.010.030.12±0.020.106ans5a0.30±0.10.251.1±0.30.927ans5a0.07±0.020.060.2±0.050.17结果为至少3次独立分析的平均值。1.2蛋白结合的作用为了评估血清蛋白结合对asc16效能的相对影响，在存在1％和40％人血清蛋白的情况下重复进行了hcv1a和1b复制子分析。人血清蛋白结合对asc16效能的影响以存在1％人血清的情况下进行分析时的ec50和ec90浓度较之存在40％人血清时浓度的改变倍数来表示。使用hcv1a和1b复制子细胞系的结果均表明，相对于存在1％人血清时获取的结果，存在40％人血清时的效能平均降低了9-11倍。1.3asc16病毒特异性测定通过使用病毒细胞保护检测方法观察asc16对一组其他病毒的潜在抑制作用来明确hcv特异性。这组病毒包括：a)牛病毒性腹泻病毒(bvdv)，另一个黄病毒科(flaviviridae)家族成员，最初在建立hcv复制子分析之前用作hcv的替代模型；hcv和bvdv均编码ns5a蛋白(有15％的氨基酸是相同的)，该蛋白很可能在病毒复制期间发挥类似的功能；b)人类鼻病毒16(hrv-16)，另一种正链rna病毒，该病毒编码一种多肽，后者随后由病毒蛋白酶裂解为病毒蛋白；c)b型流感病毒(flu-b)，一种分段式的负链rna病毒。为了控制这些研究中潜在的细胞毒作用，在无病毒感染的情况下将一组细胞与asc16共培养，同时计算导致50％细胞毒作用(cc50)所需的浓度。结果表明，asc16未能对任何所测试的病毒表现出任何显著的抑制活性(所有ec50均>3300nm)，在所测试的最高浓度(10000nm)下在helah1a和mdck细胞中出现了明显的细胞毒性(表3)。这些结果证实，asc16是hcv复制的特异性抑制剂。表3asc16对一组相关和不相关病毒的作用分析病毒细胞系ec50(nm)cc50(nm)bvdvbt>10,000>10,000hrv-16hela>3,300>3,300flu-bmdck>5,000>5,000本发明的药物组合物保留了asc16在多种hcv病毒基因型中的优势，其抗丙肝病毒效能大大提升，作用谱也更加宽广。实施例2联合给药测定hcv复制酶非常容易出错，因此在感染个体中每天都会产生多种不同的突变基因组rna。因此，之前存在的耐药变异体会很容易被选择用于使用hcv抑制剂作为单药治疗的临床研究。在解决耐药性问题方面，联合用药方案用于抗病毒领域已被证实是一种有效的策略，典型例子就是三药联合组成高效抗逆转录病毒疗法(haart)在hiv感染者中的成功应用。药物联合测试已被成功地用于评估asc16与asc08联用方案的能力，以明确这种联合用药是叠加、协同还是拮抗效应。使用hcv1b复制子细胞进行了联合用药研究，期间在一定浓度范围(ec50的0.0625倍至16倍)内将asc16与ns3蛋白酶抑制剂(asc08)联合用药。计算药物相互作用联合指数(ci)以及由chou提出的等效应图是loewe叠加模型的两个基本特点。ci是反映对于某个给定的作用指标终点而言在协同(ci<0.8)、叠加(ci＝1)和拮抗(ci>1.2)方面的药物相互作用程度的定量指标。由chou和talalay介绍的ci计算是基于来自质量作用定律的中效原则的多药作用方程。表4列出了针对配对抑制剂ec50、ec75和ec90计算的ci值。表4联合指数(ci)概要表a使用asc08的ec50除以asc16的ec50计算联合比。bci小于0.8提示协同活性，在0.8-1.2之间提示叠加活性，大于1.2提示拮抗活性。结果表明，在hcv1b复制子细胞中进行分析时，asc16与asc08联用呈叠加作用(ci为0.82-1.17)。虽然本发明的药物组合物(asc16+asc08)并未呈现协同的药物疗效，但是这两种药物的联用依旧获得了积极的效果。试验表明，这两种药物联合使用在治疗丙型病毒性肝炎方面是安全、可行的。实施例3耐药性研究由于病毒复制期间病毒rna复制酶容易发生错误，耐药变异体可能之前就已存在，和/或在存在抑制剂的情况下迅速出现。耐药病毒的出现是开发针对hcv感染的有效抗病毒治疗方案的主要挑战。因此，理解耐药的途径对于更好地预计接受治疗的患者出现耐药性可能以及制定治疗策略(例如联合治疗)至关重要，这将能够建立耐药屏障。发明人进行了一系列的耐药性研究，其目的是明确：1)hcv复制子细胞中为何容易出现耐药变异体；2)是否出现了氨基酸置换及其是否能够造成对asc16易感性的降低；3)不同病毒基因型的耐药途径是共用还是不同；4)出现的耐药变异体的复制能力；5)asc16耐药变异体是否保留了对其他不同的hcv抑制剂的易感性；6)asc16与ifn-a或其他小分子抗病毒药联用是否能够防止耐药变异体的出现。耐药变异体的选择由于既往同时使用细胞传代和集落形成分析的研究得出了类似的结果(即主要耐药碱基置换的甄别)，因此使用一组hcv复制子细胞系通过集落形成检测法来筛选asc16耐药变异体。稳定的hcv基因型1a和1b复制子细胞系以及包含hcv基因型2a、3a、4a、5a和6a关键的ns5a基因片段的稳定hcv1b嵌合体复制子细胞系接受为期21天的分别相当于其各自野生型(wt)ec50值10、100和1,000倍浓度的asc16处理，最高浓度为1000nmasc16。hcv3ans5a复制子细胞和hcv6ans5a复制子细胞仅接受10倍和100倍wtec50浓度以及1,000nmasc16处理。由于各种复制子细胞系间在细胞生长速度上存在差异，因此将细胞接种密度调整如下：hcv1a，1b，2ans5a和3ans5a复制子细胞系为25,000个细胞/皿，hcv5ans5a复制子细胞系为50,000个细胞/皿，hcv4ans5a和6ans5a复制子细胞系为100,000个细胞/皿。未处理细胞所在的培养皿在第21天时呈融合状态并作为细胞生长对照。为了明确出现的集落是否真的对asc16耐药，从双重培养皿的细胞中分离复制子rna，使用rt-pcr进行扩增并进行群体测序。大部分接受asc16处理的培养皿都出现了耐药集落。正如预期的那样，集落出现的频率与所用的asc16浓度有较好的相关性(集落的数量随着asc16浓度的增加而降低)。选择1,000nm的asc16未能在hcv1b、3ans5a、5ans5a和6ans5a复制子细胞系中产生任何耐药集落。然而，在接受1,000nmasc16的hcv1a、2ans5a和4ans5a复制子细胞中的确出现了少量集落。对来自所恢复集落中的复制子的基因型分型证实了耐药碱基置换的存在。asc16耐药有多种途径，大部分都涉及ns5a蛋白结构域1内关键的氨基酸位点28、30、31和93上的一处或多处改变。在存在更低浓度的asc16时还会发生其他的一些置换，例如p58l(4ans5a)和t58a(6ans5a)，但是，当asc16的浓度增加至1,000nm时并不会出现这些置换，提示这些特定的置换不太可能属于主要的耐药碱基置换。使用hcv1a复制子细胞进行的集落形成分析发现了非常不同的途径，提示不会有单一的耐药途径占优势，而可能是多种置换以联合的形式存在。这与使用hcv2ans5a，3ans5a和6ans5a复制子细胞系所得到的结果相反，后者一致地发现了能够造成高度耐药的单一首选置换f28s(hcv2ans5a和6ans5a)和y93h(hcv3ans5a)。与在hcv1a复制子细胞中发现的连串置换相类似的是，需要联合置换l31f/v+y93h(hcv1b)，l30h+y93h(hcv4ans5a)和q30h+l31f(hcv5ans5a)才可以达到较高程度的耐药。表5总结使用一组代表所有主要hcv基因型的hcv复制子细胞系发现的耐药碱基置换。这些新出现的变异体与既往那些使用ns5a抑制剂daclatasvir和ledipasvir(gs-5885)确认的变异体是相似的，因此，耐药置换很可能是一种与类别而不是化合物相关的现象。考虑到这些分析中集落形成的性质，耐药集落很可能来自较少的亚群细胞(在最初接种的25,000至100,000个细胞中)，这些细胞带有之前即存在耐药碱基置换的复制子。表5使用asc16集落形成分析确认的置换nd＝未实施asc16耐药碱基置换的表型制作编码已确认耐药碱基置换的复制子，随后对所得到的hcv复制子rna进行转录，并用于瞬时分析以评估其对asc16的易感性。wt复制子在瞬时分析中的易感性程度与使用稳定hcv复制子细胞分析获取的数值相近。表6列出了在集落形成分析中出现的耐药变异体及其相应的asc16易感性和复制能力水平。使用克隆变异体获取的ec50结果与集落形成分析中所用的筛选浓度具有很好的相关性，原因是在较低ec50倍数时出现的耐药变异体在瞬时分析中也有较低的ec50值，而在更高浓度下选择的变异体也对asc16具有更高的耐药性。除了对ns5a抑制剂的耐药性几乎仅出现在ns5a蛋白的氨基酸28-31和93定义的区域之外，还注意到在这些特定残基上可能存在氨基酸变化多样性，取决于选择过程中所用的ns5a抑制剂和hcv基因型。在20个于asc16选择后确认并检测的新出现变异体中，仅有6个存在造成ec50高于100nm的置换[y93n(hcv1a)、l31v+y93h(hcv1b)、f28s(hcv2ans5a)、y93h(hcv3ans5a)、l30h+y93h(hcv4ans5a)和f28s(hcv6ans5a)]。其中一些仅出现在较低asc16浓度的置换[f28v和l31m(hcv2ans5a)、l28p(hcv5ans5a)和l31m、p32l和t58a(hcv6ans5a)]并未在较高浓度下发现，而这些置换未在瞬时转染分析中进行检测，原因是这些置换不太可能造成对asc16更高程度的耐药。这些变化并未造成化合物特异性的耐药，原因是使用其他ns5a抑制剂的易感性研究发现了广泛的交叉耐药。因此，所有这些已确认的置换很有可能会造成对某一类别药物的耐药。使用范围更大的一组hcv复制子细胞系获取的耐药变异体复制能力占母体复制子细胞系的1.1％至304％不等。在产生的39个耐药复制子中，29个的复制能力占wt复制子的220％。hcv3ans5a变异体的复制能力出现了最大程度的降低，其耐药置换m28t造成的复制能力仅占wt的0.4％。同时，l31f或y9m置换在瞬时分析中根本不复制(数据未显示)。由于很可能需要未确认的代偿性置换，因此无法评估含m28t、l31f和y93h置换的hcv3ans5a耐药变异体。这与在集落形成分析中观察到的结果相关，在10倍wt3ans5aec50下耐药集落的数量显著低于所有测试的其他基因型，提示3ans5a时出现的变异体复制适合度相对较差。将y93h置换用于hcv3ans5a复制子细胞(获取自使用ns5a抑制剂ppi-461的细胞传代分析并被证实所有细胞均含有y93h置换)，造成asc16ec50改变了800倍(1.2nm-1,036nm)以上。耐药程度与复制活性和/或氨基酸位点之间没有关联。一般而言，hcv1a复制子中的各种置换造成的ec50浓度大幅高于hcv1b复制子中的单个氨基酸变化。hcv2ans5a和hcv6ans5a残基28的置换以及hcv3ans5a复制子细胞残基93的置换造成了更高程度的asc16耐药，各自基因型针对asc16的ec50从亚纳摩尔水平改变至微摩尔水平。这提示尽管所有基因型中造成耐药的置换一直出现在关键的ns5a残基28、30、31和93处，但是耐药程度各有不同，且最有可能是基因型所特有的，并取决于存在的骨架序列。表6asc16选择的hcv耐药变异体的易感性每个数据点代表≥3次独立分析的平均值。复制能力与各自的wt复制子细胞(被设定为100％)相关。*表示使用来自细胞传代分析的hcv3ans5a复制子细胞产生的ec50，结果表明所有细胞均含y93h置换。交叉耐药概况由于抗病毒药物单药治疗会造成较高的耐药变异体选择风险，成功的长期治疗将很有可能需要联合那些具有不同的且不重叠耐药特性的抑制剂。由于asc16是hcv的一种高度选择性抑制剂(很可能针对的是病毒ns5a蛋白的结构域1区域)，因此进行了一系列交叉耐药分析来评估其抑制对其他不同类别hcv抑制剂耐药的变异体的能力。既往的耐药性研究已经确认了可以造成耐药且在细胞培养传代和/或针对piasc08(ns3d168a)的临床试验期间出现的标记氨基酸置换。制作了编码这些耐药碱基置换的耐药hcv1b复制子并分析了其对asc16和asc08的易感性。表7中的数据表明，asc16保留了其抑制这些耐药变异体的能力，而且其ec50与在wthcv1b复制子细胞中观察到的结果相当。这些结果证实了预期的无交叉耐药情况以及asc08对使用asc16时出现的变异体具有抑制能力。表7耐药变异体对asc08抑制剂的易感性平均值代表了3次独立实验的平均值。为了评估asc16-耐药变异体是否保留了其对asc08的易感性，将含l31v+y93h置换的hcv1a耐药变异体瞬时转染至huh7-lunet细胞并计算asc08的ec50。正如所预期的那样，未观察到交叉耐药。同时，只有在hcv1al31v+y93h复制子中观察到对asc16易感性的降低(见表8)。表8asc16-耐药变异体对asc08的易感性平均值代表≥3次独立实验的平均值。这些结果提示，asc16-耐药变异体保留了其对asc08的易感性。因此，asc16可以与asc08抑制剂联用以协助防止耐药病毒株的出现。当前第1页12