本发明属于药学技术领域，具体涉及DHA、EPA在制备治疗干眼症的口服药物的应用。
背景技术：
眼表面覆盖的泪膜对维持眼的生理活动有着重要的意义。泪膜由睑板腺、泪腺及副泪腺分泌，并通过瞬目分布于眼表面。干眼症(Dry eye disease，DED)是指由于泪液异常引起的泪膜不稳定，从而导致眼不适症状的一类疾病。干眼症导致的长期视物模糊伴随眼睛不适严重影响患者的生活质量及工作能力。目前的研究表明，眼表组织的炎症反应是干眼症中泪液分泌的减少的主要诱因。
目前，干眼症主要通过人工泪液补充，药物刺激泪液分泌及药物抗炎等方法进行治疗。然而，人工泪液如“泪然”等补充仅属于对因治疗，干眼症的成因没有得到改善；药物刺激泪液分泌如“新斯的明”，通过兴奋胆碱能神经刺激腺体，但对泪液分泌腺体的病理状况没有改善，使该方法依赖于药物的长期维持使用；药物抗炎如使用可的松滴眼液时，则必须忍受糖皮质激素较强的副作用以及停药后的症状反跳；而通过外用药物向眼外的眼泪中补充脂肪酸的做法，则由于脂肪酸难以透过角膜吸收进入眼内，无法在眼内发挥其药理作用在针对病因治疗干眼症，只能物理性地达到稳定泪膜的作用，泪液的产生并没有增加，眼部的异常病理状态没有解除，一旦停药，则必将复发。
多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFAs)是一种存在于鱼油、橄榄油、玉米油等食用油中的多烯类脂肪酸。二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)是ω-3类的PUFAs。DHA和EPA主要累积和分布在大脑和视网膜等神经系统中。动物研究表明，DHA和EPA在学习，记忆中起着重要的作用。由于哺乳动物无法自身合成DHA和EPA，必须经食物摄取DHA和EPA，当长期进食低DHA和EPA膳食时，相应功能就会受到影响。
在本领域目前的研究中，发现PUFAs及其体内衍生物可以抑制眼周炎症的发生。PUFAs的重要组成部分DHA(二十二碳六烯酸)在体内可以衍生化为神经保护素D1(Neuroprotectin D1)，神经保护素D1可保护视网膜色素上皮细胞(RPE)的凋亡。因此，可以测口服补充DHA对干眼症的预防和治疗起着重要的作用，但本领域目前尚没有口服二十二碳六烯酸(DHA)或二十碳五烯酸(EPA)对干眼症治疗及其相应机制的研究。
技术实现要素：
本发明的目的是提供DHA和EPA在制备治疗干眼症的口服药物的应用，解决了现有技术中存在的问题，为治疗抗干眼症和制备治疗干眼症的口服药物提供了新思路。
本发明所采用的技术方案是，二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸在制备治疗干眼症的口服药物的应用。
本发明的特征还在于，
二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸作为制备治疗干眼症的口服药物组合物时的活性组分。
二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸通过鱼油、橄榄油、玉米油中任一获取，作为制备治疗干眼症的口服药物组合物时的活性组分。
干眼症的口服药物衍生为神经保护素D1抑制视网膜色素上皮细胞的凋亡。
干眼症的口服药物还可包括药学上可接受的一种或者多种辅料。
本发明的有益效果是：本发明DHA和EPA在制备治疗干眼症的口服药物的应用通过使用兼作食品的天然、无毒化合物DHA、EPA实现了干眼症的治疗，避免了目前治疗干眼症所使用的激素类药物的副作用以及人工泪液、泪液分泌刺激药无法改善病因的问题，有很好的实用价值。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
二十碳五烯酸(EPA)，其化学结构为：
二十二碳六烯酸(DHA)，其化学结构为：
本发明DHA和EPA在制备治疗干眼症的口服药物的应用，具体实验过程如下：
1.实验动物
健康雄性BALB/c小鼠70只，8周龄，体质量(18±3)g。
动物自由摄食及饮水，分笼(3或4只/笼)饲养于SPF级饲养环境，室温(20±2)℃，相对湿度40-70％，每日明暗室各12h。每周称量动物的体重。
2.泪液分泌物及泪膜破裂时间的测量
泪液分泌物采用酚红棉线浸渍法测定，即将酚红浸渍棉线置于小鼠下睑内30s，棉线接触泪液润湿后颜色变红，测量红色棉线的长度(以毫米为单位)作为泪液分泌量的测量结果。
泪膜破裂时间采用荧光法测定，小鼠结膜囊0.125％荧光素钠染色1μl，手动瞬目3次后以钴蓝光照射，裂隙灯显微镜观察。以瞬目完毕到小鼠泪膜出现黑色或线状缺损作为泪膜破裂时间(以秒为单位)。
3.干眼模型制备
健康雄性BALB/c小鼠60只，8周龄，体质量(18±3)g，经适应性喂养一周后，测量泪液分泌物的量及泪膜破裂时间。造模时，给予0.2％(w/w)苯扎氯铵水溶液5μl滴眼，每日给药2次。连续给药14天后再测量泪液分泌物的量及泪膜破裂时间，取最接近均数的60只小鼠即为干眼症模型小鼠，用于动物实验。
4.动物实验
将经干眼模型制备后的小鼠随机分为3组：对照组、DHA组、EPA组。3组小鼠记录泪液分泌物及泪膜破裂时间后，连续14天分别饲喂、以不含EPA、DHA的棕榈油作为油脂制备的试验膳食，DHA组、EPA组分别每日饲喂含有10mg DHA或EPA的鱼油。14天后，3组小鼠再次测量泪液分泌物及泪膜破裂时间。在随后的一天，处死小鼠，并采集其睑板腺，泪腺，于-80℃冻存。
5.眼周腺体中DHA及EPA的含量的测定
将小鼠眼部周围的腺体(睑板腺15mg、泪腺50mg)加入到20ml塑料离心管中，并加入内标溶液100μL(含20μg DHA甲酯及20μg EPA甲酯)，加入添加了50μg/ml BHT的甲醇-己烷(4：1；v/v)混合液2ml以，以免脂质在实验过程中被氧化。
样品移至冰浴下加入6％K2CO3溶液5ml中和，2200g下离心15min，以消除乳化液。待混合物分液后，以注射器吸取上层的己烷，经针式过滤器过滤后进样。
用气相色谱分析上述衍生化样品中的脂肪酸甲酯，色谱条件为：FID检测器，DB-FFAP型气相色谱柱(15m×0.10mm×0.10μm)，以氢气为载气；检测器和进样器温度250℃，升温程序为：150℃为初始温度，35℃/min升至200℃，8℃/min升至225℃，维持3.2min，最后以80℃/min升至248℃，维持14.7min。
以内标法定量样品中的DHA甲酯与EPA甲酯含量，并折算为眼周组织中DHA和EPA的含量。
6.结果
6.1.DHA及EPA对干眼症小鼠的泪液分泌影响及泪膜破裂时间的研究结果
小鼠在分组喂食鱼油前的泪液分泌量为5.11±0.62(mm)，显著少于同批小鼠造模前9.15±0.56mm(P<0.05)。说明干眼模型造模成功。
经分组饲喂小鼠后，DHA组的泪液分泌物为7.71±0.89mm，与对照组(5.67±0.97mm)相比显著增加(P<0.05)。EPA组的泪液分泌物为7.22±1.13mm，与对照组(5.67±0.97mm)相比显著增加(P<0.05)。对照组的泪液分泌请况与动物实验前基本未发生改善(P＞0.05)：泪膜破裂时间的情况具有相同的变化趋势，结果见表1所示。
表1小鼠泪液分泌及泪膜破裂时间的测定结果
6.2.高DHA膳食对干眼症小鼠的眼周腺体中DHA的含量的影响
用气相色谱分析3组小鼠经膳食饲喂14天后，取出的睑板腺及泪腺衍生化样品中的DHA甲酯含量，并折算为DHA的含量。对照组小鼠眼周腺体中DHA的含量为1.79±0.15μg/mg(湿重)，DHA组为10.06±0.61μg/mg(湿重)，两组之间存在显著性差异(P＜0.001)。
7.结论
采用苯扎氯氨诱导小鼠发生干眼症后，采用DHA饲喂的小鼠或采用EPA饲喂的小鼠相对于无不饱和脂肪酸膳食饲喂的小鼠，泪液分泌量显著增加、泪膜破裂时间明显延长(P＜0.05)；无不饱和脂肪酸膳食组组各指标变化不明显(P＞0.05)；而且，饲喂14天后，口服DHA组眼周腺体中DHA的含量水平显著性高于低DHA膳食组(P＜0.001)。因此，口服DHA及EPA可减轻苯扎氯铵诱导的干眼症小鼠的干眼症状，其机制与增加眼部腺体中DHA及EPA的供应有关。
实施例1
步骤一：将制备干眼模型成功的30只8周龄健康雄性BALB/c小鼠随机分为2组：对照组及鱼油组。
步骤二：2组小鼠记录泪液分泌物后，连续14天分别饲喂专门制备的试验膳食：两组膳食的脂肪含量均是7％(w/w)，其中，对照组采用单一棕榈油充当油脂，鱼油组采用鱼油：棕榈油＝1:1(w/w)的调和油充当油脂。所采用的棕榈油不含DHA，鱼油含13％(w/w)的DHA。每日精确称量投喂及剩余饲料，观察摄食情况。经测定，两组小鼠日均采食量为3.01g，以此中位数计算可知，鱼油组日均摄取DHA约为13.2mg，对照组无法摄取到DHA。
步骤三：14天后，2组小鼠再次测量泪液分泌物。鱼油组的泪液分泌物为6.92±0.76mm，与对照组(4.55±0.88mm)相比显著增加(P<0.05)。对照组的泪液分泌请况(4.55±0.88mm)与动物实验前(4.33±1.09mm)基本未发生改善(P＞0.05)。因此，口服以DHA为主要成分的食物鱼油可减轻苯扎氯铵诱导的干眼症小鼠的干眼症状。
实施例2
步骤一，制备EPA及对照软胶囊药液：以20ml聚乙二醇400为分散介质，加入助悬剂0.8g蜂蜡和0.2g大豆卵磷脂，使之熔融后，等分分为两份，一份中加入0.6g EPA充分研磨混匀，制成实验组药液；另一份中加入0.6g硬脂酸充分研磨混匀，制成对照组药液。
步骤二：将制备干眼模型成功的30只8周龄健康雄性BALB/c小鼠随机分为2组：对照组及EPA软胶囊组。
步骤三：2组小鼠记录泪液分泌物后，连续14天分别灌胃步骤一中制作的软胶囊药液0.2ml，以此计算可知，EPA软胶囊组日均摄取EPA约为12mg，对照组无法摄取到DHA。
步骤四：14天后，2组小鼠再次测量泪液分泌物。EPA软胶囊组的泪液分泌物为6.71±0.47mm，与对照组(4.99±0.68mm)相比显著增加(P<0.05)。对照组的泪液分泌请况(4.99±0.68mm)与动物实验前(5.20±0.34mm)基本未发生改善(P＞0.05)。因此，口服以DHA为主要成分的食物鱼油可减轻苯扎氯铵诱导的干眼症小鼠的干眼症状。
实施例3
步骤一，向10％的黄原胶水溶液10ml中加入0.6g脂肪酸，使用高压均质机均质得到乳化液。向其中加入蒸馏水形成微胶囊，冷却固化2-3h后，离心分离出微胶囊，并加入甜味剂、防腐剂、增稠剂、香料等辅料及10ml蒸馏水，搅拌即得微囊口服液。上述脂肪酸使用DHA时，为DHA微胶囊口服液，使用硬脂酸时为硬脂酸微胶囊口服液。
步骤二：将制备干眼模型成功的30只8周龄健康雄性BALB/c小鼠随机分为2组：对照组及DHA微胶囊口服液组。
步骤三：2组小鼠记录泪膜破裂时间后，连续14天分别灌胃步骤一中制作的微胶囊口服液0.2ml，以此计算可知，DHA微胶囊口服液组日均摄取DHA约为12mg，对照组无法摄取到DHA。
步骤四：14天后，2组小鼠再次测量泪膜破裂时间。DHA微胶囊口服液组的泪膜破裂时间为4.04±0.97s，与对照组(2.12±0.41s)相比显著增加(P<0.05)。对照组的泪液分泌请况(2.12±0.41s)与动物实验前(1.94±0.21s)基本未发生改善(P＞0.05)。因此，口服以DHA为主要成分的食物鱼油可减轻苯扎氯铵诱导的干眼症小鼠的干眼症状。
本发明通过使用可以兼作食品的天然、无毒化合物DHA、EPA实现了干眼症的治疗，避免了目前治疗干眼症所使用的激素类药物的副作用以及人工泪液、泪液分泌刺激药无法改善病因的问题。
本发明DHA、EPA在制备治疗或缓解干眼症为目的的口服药物中的应用，而不产生该领域传统激素类药物，如可的松滴眼液或泪液补充剂、分泌刺激剂如泪然、新斯的明或将DHA、EPA单纯作为外用滴液剂控制泪液蒸发的内在副作用及对症治疗的局限性，从而将治疗干眼症的副作用降低并标本兼治。
本发明DHA、EPA的治疗有效量一般为足以获得所需作用并且以根据疾病情况的性质和严重程度以及化合物的功效的不同进行改变的用量。应理解可以将不同浓度用于预防而非治疗活动性疾病。