本发明涉及生物材料与控释
技术领域：
，具体地指一种注射用具pH敏感性的魔芋葡甘聚糖-脂质体复合纳米药物载体及其制备和应用。
背景技术：
：目前全球的癌症的发病率和死亡率日益增长，已成为人类健康的最大威胁。化学治疗是目前最广泛使用的癌症的治疗方法，但是也存在着许多问题，如药物水溶性差，给药后在体内选择性差，具有多重耐药性，循环时间短，生物利用率低等(非专利文献1：Expertopinionondrugdelivery,2012,9:687-700)。为了解决这些问题，微米和纳米载体被广泛的研究。脂质体由于其具有生物相容性好、具双亲性而可同时包埋亲水物质和疏水物质、以及对淋巴和肝脏等组织具被动靶向性等优点，近年来已成为药物载体领域研究的重点对象之一。但是，脂质体在储存的过程存在着稳定性差、药物易提前泄露的现象，且其在体内易被网状内皮系统(RES)的巨噬细胞识别并迅速清除，从而导致生物利用度不高(非专利文献2：JournalofControlledRelease,2015,199(1):106-113)。为解决以上问题，研究者们对脂质体表面进行修饰，例如：Klibanov等用聚乙二醇(PEG)对脂质体表面改性修饰制得“隐形脂质体”，可逃避网状内皮系统的捕捉，从而显著提高其在体内的循环时间；Sunamoto将普鲁兰多糖修饰于脂质体表面形成自组装体系，可显著提高脂质体的物理化学及生物学稳定性；Cansell使用功能化右旋糖苷对脂质体包裹修饰，使其能与人内皮细胞发生特异性相互作用，可实现血管细胞靶向等。研究显示，使用多糖、PEG等亲水材料对脂质体表面进行修饰，可显著提高脂质体的物理化学稳定性、减少内容物的渗漏、逃避体内RES的识别及清除、并能改进脂质体的细胞摄取能力，特别是天然多糖的生物可降解性、低毒性、抗蛋白能力以及免疫调节活性，使其在脂质体修饰改进方面应用潜力较大。因此使用多糖类的大分子双亲物与脂类载体进行复合组装，能有效改善其物理化学性能，提高载体系统的稳定性(非专利文献3：Foodhydrocolloids,2013,30(1):249-257)。魔芋葡甘聚糖(KGM)是一种提取自天南星科魔芋属草本植物魔芋块茎中的天然多糖，具有如高吸水性与保水性、高溶胀性、强组织粘附性、生物可降解、增稠与乳化效果好等特点，作为载体或是者载体助剂具有稳定性好、生物相容性高的天然优势。KGM本身具有许多生理活性，如调节糖来代谢、降低血液中胆固醇、改善肠道环境以及抗肿瘤等，有可能与具有相应功能性的活性因子产生协同作用，增益其生理机能(非专利文献4：Journalofnutritionalscienceandvitaminology(tokyo),1998,44(3):423-436；非专利文献5：Appliedmicrobiologyandbiotechnology,2002,59(223):182-189)。然而，KGM对疏水性分子的包载能力较差，限制了其在载体材料方面的应用，将其与脂质体共同制备复合纳米载体的方法也尚未见报道。为了克服KGM难以包载疏水性分子的问题，实现将其作为功能性纳米载体材料，用以提高药物的稳定性以及改善其组织分布状况，申请号为201610920244.0的专利中公开了一种疏水改性魔芋葡甘聚糖载药纳米胶束的制备方法及其在纳米载体方面的应用，可显著提高疏水性药物的物理化学稳定性以及肿瘤靶向性。但该胶束仅能负载疏水性分子，难以同时负载亲疏水性不同的药物，在实际应用中无法实现协同给药。技术实现要素：本发明的第一目的在于针对上述现有
背景技术：
的不足，提供一种注射用具pH敏感性的魔芋葡甘聚糖-脂质体(KGM-LIPO)复合纳米药物载体，并将其应用于亲疏水性不同药物的共同包载与传递，以实现协同治疗。该复合纳米药物载体以KGM为亲水表层、脂质体为疏水内壳，对光、热、氧、酶、酸碱等环境敏感的药物分子具保护、促活和增溶作用，并能显著提高其物理、化学稳定性，避免其被RES系统识别和清除，从而延长其在体内的循环时间；同时其所特有的纳米尺寸可通过EPR效应富集于肿瘤组织，从而具有被动靶向性；另外，该复合纳米药物载体在中性环境中稳定，在弱酸性的肿瘤微环境中其多糖表壳可选择性脱落，裸露出具正电荷的氨基可与肿瘤细胞膜结合，并通过膜融合作用进入肿瘤细胞内并大量释放出药物，从而有效杀灭肿瘤细胞；该复合纳米药物载体还可实现对多种药物的共载与控制释放，并有效降低药物的毒副作用和多耐药性，提高药效。本发明的第二目的在于提供该KGM-LIPO复合纳米药物载体的制备方法。该方法基于疏水改性魔芋葡甘聚糖的大分子双亲物(KGM-g-AH)与脂质体进行复合组装，得到新型KGM-LIPO复合纳米药物载体，能有效改善其对不同亲疏水性药物的共同包载效率，提高载体系统的稳定性，并实现协同治疗作用。本发明的第三目的在于提供该KGM-LIPO复合纳米药物载体在药物体内递送方面的应用。本发明的第一目的通过下述技术方案实现：本发明提供一种注射用具pH敏感性的KGM-LIPO魔芋葡甘聚糖-脂质体复合纳米药物载体，所述药物载体的制备原料按重量份数比计包括16份的蛋黄卵磷脂、1-4份的KGM-g-AH和1-8份的胆固醇。进一步地，所述药物载体的制备原料按重量份数比计包括16份的蛋黄卵磷脂、2-4份的KGM-g-AH和2-4份的胆固醇。再进一步地，所述药物载体的制备原料按重量份数比计包括16份的蛋黄卵磷脂、2份的KGM-g-AH和2份的胆固醇。再进一步地，所述KGM-g-AH的制备原料按重量份数比计包括1份KGM、0.4-1.5份高碘酸钠、0.5-1.5份脂肪胺。再进一步地，所述KGM-g-AH的制备原料按重量份数比计包括1份KGM、0.6-1份高碘酸钠、0.5-1.0份脂肪胺；再进一步地，所述脂肪胺为八胺、十一胺、十二胺、十四胺、十六胺和十八胺中的一种。再进一步地，所述KGM-g-AH的制备方法，包括以下步骤：1)二醛基魔芋葡甘聚糖(DAK)的合成：称取KGM分散于去离子水中，在室温机械搅拌、溶胀8-24h，制得KGM分散液；然后将高碘酸钠溶解于去离子水中，并滴加到KGM分散液中，室温避光搅拌反应12-48h后，在温度为40-60℃减压浓缩，过滤，最后转移到透析袋中透析除去盐类及小分子产物，冷冻干燥即得到白色的DAK粉末；2)KGM-g-AH的合成：将制备得到的DAK溶解于水中，将脂肪胺溶解于乙醇或者环己烷中，并加到DAK溶液中，在乙醇或环己烷的沸点处回流6-18h；反应结束后在温度为30-40℃条件减压除去乙醇或环己烷，用与水互不相溶的有机试剂萃取分层三遍，合并有机相，再用酸和水分别洗涤，再用去离子水洗至中性，减压浓缩后透析7天以除去杂质，最后将收集的透析液冷冻干燥即得到KGM-g-AH。本发明的第二目的通过如下技术方案实现：本发明还提供了一种上述注射用具pH敏感性的KGM-LIPO复合纳米药物载体的制备方法，包括以下步骤：1)按上述重量份数比称取16份的蛋黄卵磷脂、1-4份的KGM-g-AH和1-8份的胆固醇；2)将KGM-g-AH、胆固醇和蛋黄卵磷脂通过乙醇注入法、薄膜水合法、逆向蒸发法、乙醇注入-硫酸铵梯度法制备得到KGM-LIPO复合纳米药物载体。作为优选方案，所述步骤1)中，所述KGM-g-AH的制备方法，包括以下步骤：①DAK的合成：称取KGM分散于去离子水中，在室温机械搅拌、溶胀8-24h，制得KGM分散液；然后将高碘酸钠溶解于去离子水中，并滴加到KGM分散液中，室温避光搅拌反应12-48h，再在温度为40-60℃减压浓缩，过滤，最后转移到透析袋中透析除去盐类及小分子产物，冷冻干燥即得到白色的DAK粉末；②KGM-g-AH的合成：将制备得到的DAK溶解于水中，将脂肪胺溶解于乙醇或者环己烷中，并加到DAK溶液中，在乙醇或环己烷的沸点处回流6-18h；反应结束后在温度为30-40℃条件减压除去乙醇或环己烷，用与水互不相溶的有机试剂萃取分层三遍，合并有机相，再用酸和水分别洗涤，再用去离子水洗至中性，减压浓缩后透析7天以除去杂质，最后将收集的透析液冷冻干燥即得到KGM-g-AH；进一步地，所述步骤2)中，乙醇注入法的具体步骤：将KGM-g-AH、胆固醇和蛋黄卵磷脂溶解于乙醇中并混合均匀，在磁力搅拌的条件注入双蒸水中，搅拌均匀，在温度为25-35℃的条件下减压30-90min除去乙醇，然后在功率为200-400W条件下超声3-10min，过微孔滤膜即得到KGM-LIPO复合纳米药物载体。或者，所述步骤2)中，薄膜水合法的具体步骤：将KGM-g-AH、胆固醇和蛋黄卵磷脂溶解于乙醇或乙醇/氯仿混合溶剂或乙醇/乙醚混合溶剂中并混合均匀，在温度为25-35℃的条件下减压除去溶剂30-90min，然后加入双蒸水，在温度为60-70℃条件下快速旋转水合20-40min，再在功率200-400W条件下超声3-10min，过微孔滤膜即得到KGM-LIPO复合纳米药物载体。或者，所述步骤2)中，逆向蒸发法的具体步骤：将KGM-g-AH、胆固醇和蛋黄卵磷脂溶解于乙醇或乙醇/氯仿混合溶剂或乙醇/乙醚混合溶剂中并混合均匀，在功率为200-400W超声的条件下，注入双蒸水，超声3-15min，然后在温度为25-35℃的条件下减压30-90min除去有机试剂，再在功率为200-400W条件下超声3-10min，过微孔滤膜，即得到KGM-LIPO复合纳米药物载体。或者，所述步骤2)中，乙醇注入-硫酸铵梯度法的具体步骤：将KGM-g-AH、胆固醇、大豆卵磷脂或蛋黄卵磷脂溶解于乙醇中并混合均匀，在功率为200-400W超声的条件下，注入硫酸铵水溶液，超声3-15min，然后在温度为25-35℃的条件下减压30-90min除去有机试剂，再将其转移至透析袋中用磷酸缓冲液透析6-24h，取出透析液定容，在温度为35-55℃的条件下孵育30-150min，过微孔滤膜即得到KGM-LIPO复合纳米药物载体。本发明的第三目的通过如下技术方案实现：本发明还提供了一种载药KGM-LIPO复合纳米药物载体，它由内部药物和外层的上述药物载体组成，所述载药KGM-LIPO复合纳米药物载体中，药物与载体的重量比为1：2-24。进一步地，所述药物选自疏水药物和亲水药物；所述疏水药物选自姜黄素、紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、五氟尿嘧啶、他莫昔芬和洛莫司汀。所述亲水药物选自盐酸阿霉素、盐酸拓扑替康、盐酸伊立替康、米托蒽醌、长春碱、顺铂、博来霉素、丝裂霉素和盐酸吉西他滨。本发明还提供了一种上述载药的KGM-LIPO复合纳米药物载体的制备方法，包括以下步骤：1)DAK的合成：称取KGM分散于去离子水中，在室温机械搅拌、溶胀8-24h，制得KGM分散液；然后将高碘酸钠溶解于去离子水中，并滴加到KGM分散液中，室温避光搅拌反应12-48h，再在温度为40-60℃减压浓缩，过滤，最后转移到透析袋中透析除去盐类及小分子产物，冷冻干燥即得到白色的DAK粉末；2)KGM-g-AH的合成：将制备得到的DAK溶解于水中，将脂肪胺溶解于乙醇或者环己烷中，并加到DAK溶液中，在乙醇或环己烷的沸点处回流6-18h；反应结束后在温度为30-40℃条件减压除去乙醇或环己烷，用与水互不相溶的有机试剂萃取分层三遍，合并有机相，再用酸和水分别洗涤，再用去离子水洗至中性，减压浓缩后透析7天以除去杂质，最后将收集的透析液冷冻干燥即得到KGM-g-AH；3)载药的KGM-LIPO复合纳米药物载体的制备：①按重量份数比称取16份的蛋黄卵磷脂、1-4份的KGM-g-AH和1-8份的胆固醇，备用；②将KGM-g-AH、胆固醇、蛋黄卵磷脂和药物通过乙醇注入法、薄膜水合法、逆向蒸发法、乙醇注入-硫酸铵梯度法制备得到载药KGM-LIPO复合纳米药物载体。其中，药物与载体的重量比为1：2-24。作为优选方案，所述步骤3)第②小步中，乙醇注入法的具体步骤：A.将KGM-g-AH、胆固醇、蛋黄卵磷脂和疏水药物溶解于乙醇中并混合均匀，在磁力搅拌的条件注入去离子水中，搅拌混匀，在温度为25-35℃的条件下减压30-90min除去乙醇，再在功率为200-400W条件下超声3-10min，过微孔滤膜即得到均一的载疏水药物的KGM-LIPO复合纳米药物载体；或，B.将KGM-g-AH、胆固醇和蛋黄卵磷脂溶解于乙醇中并混合均匀，在磁力搅拌的条件注入亲水药物溶液中，搅拌均匀，在温度为25-35℃的条件下减压30-90min除去乙醇，再在功率为200-400W条件下超声3-10min，过微孔滤膜即得到均一的载亲水药物的KGM-LIPO复合纳米药物载体；或，C.将KGM-g-AH、胆固醇、蛋黄卵磷脂和疏水药物溶解于乙醇中并混合均匀，在磁力搅拌的条件注入亲水药物溶液，搅拌均匀，在温度为25-35℃的条件下减压30-90min除去乙醇，再在功率为200-400W条件下超声3-10min，过微孔滤膜即得到均一的共载亲、疏水药物的KGM-LIPO复合纳米药物载体；或者，所述步骤3)第②小步中，薄膜水合法的具体步骤：或，A.将KGM-g-AH、胆固醇、蛋黄卵磷脂和疏水药物溶解于乙醇或乙醇/氯仿混合溶剂或乙醇/乙醚混合溶剂中并混合均匀，在温度为25-35℃的条件下减压除去溶剂30-90min，然后加入去离子水，在温度为60-70℃条件下快速旋转水合20-40min，再在功率为200-400W条件下超声3-10min，过微孔滤膜即得到均一的载疏水药物的KGM-LIPO复合纳米药物载体；或，B.将KGM-g-AH、胆固醇和蛋黄卵磷脂溶解于乙醇或乙醇/氯仿混合溶剂或乙醇/乙醚混合溶剂中并混合均匀，将其转入茄形瓶中，在温度为25-35℃的条件下减压30-90min除去溶剂，然后加入亲水药物溶液中，在温度为60-70℃条件下快速旋转水合20-40min，再在功率为200-400W条件下超声3-10min，过微孔滤膜即得到均一的载亲水药物的KGM-LIPO复合纳米药物载体；或，C.将KGM-g-AH、胆固醇、蛋黄卵磷脂和疏水药物溶解于乙醇或乙醇/氯仿混合溶剂或乙醇/乙醚混合溶剂中并混合均匀，在温度为25-35℃的条件下减压30-90min除去溶剂，然后加入亲水药物溶液中，在温度为60-70℃条件下快速旋转水合20-40min，再在功率为200-400W条件下超声3-10min，过微孔滤膜即得到均一的共载亲、疏水药物的KGM-LIPO复合纳米药物载体；或者，所述步骤3)第②小步中，逆向旋蒸法的具体步骤：或，A.将KGM-g-AH、胆固醇、蛋黄卵磷脂和疏水药物溶解于乙醇或乙醇/氯仿混合溶剂或乙醇/乙醚混合溶剂中并混合均匀，在功率为200-400W的超声条件下，注入去离子水，超声3-15min，在温度为25-35℃的条件下减压30-90min除去有机试剂，再在功率为200-400W条件下超声3-10min，过微孔滤膜即得到均一的载疏水药物的KGM-LIPO复合纳米药物载体；或，B.将KGM-g-AH、胆固醇和蛋黄卵磷脂溶解于乙醇或乙醇/氯仿混合溶剂或乙醇/乙醚混合溶剂中并混合均匀，在功率为200-400W超声的条件下，注入亲水药物溶液，超声3-15min，在温度为25-35℃的条件下减压30-90min除去有机试剂，再在功率为200-400W条件下超声3-10min，过微孔滤膜即得到均一的载亲水药物的KGM-LIPO复合纳米药物载体；或，C.将KGM-g-AH、胆固醇、大豆卵磷脂或蛋黄卵磷脂和疏水药物溶解于乙醇或乙醇/氯仿混合溶剂或乙醇/乙醚混合溶剂中并混合均匀，在功率为200-400W的超声条件下，注入亲水药物溶液超声3-15min，在温度为25-35℃的条件下减压30-90min除去有机试剂，再在功率为200-400W条件下超声3-10min，过微孔滤膜即得到均一的共载亲、疏水药物的KGM-LIPO复合纳米药物载体；或者，所述步骤3)第②小步中，乙醇注入-硫酸铵梯度法的具体步骤：或，A.将KGM-g-AH、胆固醇和蛋黄卵磷脂溶解于乙醇中并混合均匀，在功率为200-400W的超声条件下，注入硫酸铵水溶液，超声3-15min，在温度为25-35℃的条件下减压30-90min除去乙醇，再将其转移至透析袋中用磷酸缓冲液透析6-24h，取出透析液定容，与亲水药物水溶液混合，在温度为35-55℃的条件下孵育10-60min，过微孔滤膜即得到均一的载亲水药物的KGM-LIPO复合纳米药物载体；或，B.将KGM-g-AH、胆固醇、蛋黄卵磷脂和疏水药物溶解于乙醇中并混合均匀，在功率为200-400W的超声条件下，注入硫酸铵水溶液，超声3-15min，然后在温度为25-35℃的条件下减压30-90min除去有机试剂，再将其转移至透析袋中用磷酸缓冲液透析6-24h，取出透析液定容，与亲水药物水溶液混合，在温度为35-55℃的条件下孵育10-60min，过微孔滤膜即得到均一的共载亲、疏水药物的KGM-LIPO复合纳米药物载体。针对现有技术，本发明的有益效果在于：1)本发明制备的注射用具pH敏感性的KGM-LIPO复合纳米药物载体，可用于药物控制释放、协同治疗以及功能因子传递等领域。2)本发明基于KGM良好的生物相容性、生物可降解性和组织粘附性，以及脂质体的两亲性、细胞亲和性、被动靶向性和高包载效率，构建以KGM为亲水表层、脂质体为疏水内壳的核壳复合纳米药物载体，提高了脂质体的物理、化学和生物稳定性，有效延长其在体内循环时间，并且赋予了其pH敏感性和肿瘤被动靶向性。3)本发明为注射用具pH敏感性的KGM-LIPO复合纳米药物载体在药物传递和协同治疗方面的应用提供了新思路。4)本发明制备的注射用具pH敏感性的KGM-LIPO复合纳米药物载体呈球形且具有较好的分散性和物化稳定性。5)该药物载体外层KGM-g-AH分子中的亚胺键可选择性在酸性环境中断裂，使其具有pH敏感性，当载药载体到达癌变组织时，弱酸性的肿瘤环境使载体外壳降解，裸露出具正电荷的氨基可与肿瘤细胞膜结合，可通过膜融合作用进入肿瘤细胞内并大量释放出所包载的药物，从而高效杀灭肿瘤细胞。附图说明图1为样品的透射电镜图；图中的a、b、c、d分别指未载药、载阿霉素、载姜黄素以及共载姜黄素和阿霉素的KGM-LIPO复合纳米药物载体的形貌。图2为样品的储藏稳定性图；图中的a指样品的粒径(size)随着天数的变化曲线图，b指样品的分散度(PDI)随着天数的变化曲线图，c指样品的电位(ZP)随着天数的变化曲线图。图3为载姜黄素KGM-LIPO复合纳米药物载体和载姜黄素普通脂质体分别在pH5.0和pH7.4的缓冲介质中的时间-释药浓度曲线图；图4为加入不同浓度的KGM-LIPO复合纳米药物载体液培养48h后HepG2细胞的相对存活率图。具体实施方式为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。反应步骤一：二醛基魔芋葡甘聚糖(DAK)的合成：称取KGM分散于去离子水中，在室温机械搅拌、溶胀8-24h，制得KGM分散液；然后将高碘酸钠溶解于去离子水中，并滴加到KGM分散液中，室温避光搅拌反应12-48h，40-60℃减压浓缩，过滤，最后转移到透析袋中透析除去盐类及小分子产物，冷冻干燥即得到白色的DAK粉末。实施例1称取0.5克KGM分散于250mL去离子水中，在室温机械搅拌、溶胀24h，制得KGM1分散液；称取0.2克高碘酸钠溶解于10mL去离子水中，并滴加到KGM分散液中，室温避光搅拌反应48h，40℃减压浓缩，过滤，最后转移到截留分子量为3500g/mol(3500MW)透析袋中透析除去盐类及小分子产物，冷冻干燥48h即得到白色的DAK1粉末。实施例2称取0.5克KGM分散于250mL去离子水中，在室温机械搅拌、溶胀12h，制得KGM2分散液；称取0.3克高碘酸钠溶解于15mL去离子水中，并滴加到KGM分散液中，室温避光搅拌反应24h，50℃减压浓缩，过滤，最后转移到3500MW透析袋中透析除去盐类及小分子产物，冷冻干燥48h即得到白色的DAK2粉末。实施例3称取0.5克KGM分散于250mL去离子水中，在室温机械搅拌、溶胀12h，制得KGM3分散液；称取0.4克高碘酸钠溶解于20mL去离子水中，并滴加到KGM分散液中，室温避光搅拌反应24h，55℃减压浓缩，过滤，最后转移到3500MW透析袋中透析除去盐类及小分子产物，冷冻干燥48h即得到白色的DAK3粉末。实施例4称取0.5克KGM分散于250mL去离子水中，在室温机械搅拌、溶胀8h，制得KGM4分散液；称取0.5克高碘酸钠溶解于25mL去离子水中，并滴加到KGM分散液中，室温避光搅拌反应12h，60℃减压浓缩，过滤，最后转移到3500MW透析袋中透析除去盐类及小分子产物，冷冻干燥48h即得到白色的DAK4粉末。实施例5：称取0.5克KGM分散于250mL去离子水中，在室温机械搅拌、溶胀8h，制得KGM5分散液；称取0.75克高碘酸钠溶解于35mL去离子水中，并滴加到KGM分散液中，室温避光搅拌反应12h，60℃减压浓缩，过滤，最后转移到3500MW透析袋中透析除去盐类及小分子产物，冷冻干燥48h即得到白色的DAK5粉末。通过凝胶渗透色谱测定DAK的分子量和分散系数，使用碘量法测定所制备得到的DAK的氧化度，结果如表1所示。表1二醛基魔芋葡甘聚糖(DAK)的分子量、分散系数和氧化度由表1数据可得知，当KGM和高碘酸钠质量比在1:0.6-1之间时，所得到DAK分子量可控制在1-5×104g/mol范围内，且其多分散系数可控制在1.5之内，更利于下一步两亲性分子KGM-g-AH的合成。因此，所述DAK的制备原料按重量份数比优选为1份KGM和0.6-1份高碘酸钠，后续合成中优选DAK2、DAK3、DAK4为制备原料。反应步骤二：疏水改性魔芋葡甘聚糖(KGM-g-AH)的合成：将制备得到的DAK溶解于水中，将脂肪胺溶解于乙醇或者环己烷中，并加到DAK溶液中，在乙醇或环己烷的沸点处回流6-18h；反应结束后在温度为30-40℃条件减压除去乙醇或环己烷，用与水互不相溶的有机试剂萃取分层三遍，合并有机相，再用酸和水分别洗涤，再用去离子水洗至中性，减压浓缩后透析7天以除去杂质，最后将收集的透析液冷冻干燥即得到KGM-g-AH。实施例6称取0.5克DAK2溶解于70mL双蒸水中得到DAK2水溶液，称取0.25克辛胺溶解于100mL乙醇中，再加入DAK2水溶液中，于78℃回流反应12h。反应结束后于30℃减压除去乙醇，用30mL氯仿萃取三次，合并氯仿液；分别用30mL0.1mol/L的盐酸溶液和30mL双蒸水洗涤三次，再用双蒸水洗涤至水相为中性，收集合并氯仿层，于30℃减压浓缩至30mL，使用3500MW透析袋在双蒸水中透析7d，再将透析液冷冻干燥48h，即得到KGM-g-AH8-1。实施例7称取0.5克DAK3溶解于70mL双蒸水中得到DAK3水溶液，称取0.5克辛胺溶解于120mL乙醇中，再加入DAK3水溶液中，于78℃回流反应18h。反应结束后于35℃减压除去乙醇，用30mL氯仿萃取三次，合并氯仿液；分别用30mL0.1mol/L的盐酸溶液和30mL双蒸水洗涤三次，再用双蒸水洗涤至水相为中性，收集合并氯仿层，于30℃减压浓缩至30mL，使用3500MW透析袋在双蒸水中透析7d，再将透析液冷冻干燥48h，即得到KGM-g-AH8-2。实施例8称取0.5克DAK4溶解于70mL双蒸水中得到DAK4水溶液，称取0.75克辛胺溶解于150mL乙醇中，再加入DAK4水溶液中，于78℃回流反应8h。反应结束后于40℃减压除去乙醇，用30mL氯仿萃取三次，合并氯仿液；分别用30mL0.1mol/L的盐酸溶液和30mL双蒸水洗涤三次，再用双蒸水洗涤至水相为中性，收集合并氯仿层，于30℃减压浓缩至30mL，使用3500MW透析袋在双蒸水中透析7d，再将透析液冷冻干燥48h，即得到KGM-g-AH8-3。实施例9称取0.5克DAK2溶解于70mL双蒸水中得到DAK2水溶液，称取0.36克十二胺溶解于100mL乙醇中，再加入DAK2水溶液中，于78℃回流反应6h。反应结束后于30℃减压除去乙醇，用30mL氯仿萃取三次，合并氯仿液；分别用30mL0.1mol/L的盐酸溶液和30mL双蒸水洗涤三次，再用双蒸水洗涤至水相为中性，收集合并氯仿层，于30℃减压浓缩至30mL，使用3500MW透析袋在双蒸水中透析7d，再将透析液冷冻干燥48h，即得到KGM-g-AH12-1。实施例10称取0.5克DAK3溶解于70mL双蒸水中得到DAK3水溶液，称取0.72克十二胺溶解于120mL乙醇中，再加入DAK3水溶液中，于78℃回流反应12h。反应结束后于35℃减压除去乙醇，用30mL氯仿萃取三次，合并氯仿液；分别用30mL0.1mol/L的盐酸溶液和30mL双蒸水洗涤三次，再用双蒸水洗涤至水相为中性，收集合并氯仿层，于30℃减压浓缩至30mL，使用3500MW透析袋在双蒸水中透析7d，再将透析液冷冻干燥48h，即得到KGM-g-AH12-2。实施例11称取0.5克DAK4溶解于70mL双蒸水中得到DAK4水溶液，称取1.08克十二胺溶解于150mL乙醇中，再加入DAK4水溶液中，于78℃回流反应18h。反应结束后于40℃减压除去乙醇，用30mL氯仿萃取三次，合并氯仿液；分别用30mL0.1mol/L的盐酸溶液和30mL双蒸水洗涤三次，再用双蒸水洗涤至水相为中性，收集合并氯仿层，于30℃减压浓缩至30mL，使用3500MW透析袋在双蒸水中透析7d，再将透析液冷冻干燥48h，即得到KGM-g-AH12-3。实施例12称取0.5克DAK2溶解于70mL双蒸水中得到DAK2水溶液，称取0.52克十八胺溶解于100mL环己烷中，再加入DAK2水溶液中，于81℃回流反应6h。反应结束后于30℃减压除去乙醇，用30mL氯仿萃取三次，合并氯仿液；分别用30mL0.1mol/L的盐酸溶液和30mL双蒸水洗涤三次，再用双蒸水洗涤至水相为中性，收集合并氯仿层，于30℃减压浓缩至30mL，使用3500MW透析袋在双蒸水中透析7d，再将透析液冷冻干燥48h，即得到KGM-g-AH18-1。实施例13称取0.5克DAK3溶解于70mL双蒸水中得到DAK3水溶液，称取1.04克十八胺溶解于120mL环己烷中，再加入DAK3水溶液中，于81℃回流反应12h。反应结束后于35℃减压除去乙醇，用30mL氯仿萃取三次，合并氯仿液；分别用30mL0.1mol/L的盐酸溶液和30mL双蒸水洗涤三次，再用双蒸水洗涤至水相为中性，收集合并氯仿层，于30℃减压浓缩至30mL，使用3500MW透析袋在双蒸水中透析7d，再将透析液冷冻干燥48h，即得到KGM-g-AH18-2。实施例14称取0.5克DAK4溶解于70mL双蒸水中得到DAK4水溶液，称取1.56克十八胺溶解于150mL乙醇中，再加入DAK4水溶液中，于81℃回流反应18h。反应结束后于40℃减压除去乙醇，用30mL氯仿萃取三次，合并氯仿液；分别用30mL0.1mol/L的盐酸溶液和30mL双蒸水洗涤三次，再用双蒸水洗涤至水相为中性，收集合并氯仿层，于30℃减压浓缩至30mL，使用3500MW透析袋在双蒸水中透析7d，再将透析液冷冻干燥48h，即得到KGM-g-AH18-3。使用碘紫外法测定KGM-g-AH的临界胶束浓度(CMC)，结果如表2所示。表2疏水改性魔芋葡甘聚糖(KGM-g-AH)的制备原料与临界胶束浓度编号DAK脂肪胺KGM-g-AH-RCMC(g/mol)实施例6DAK2辛胺KGM-g-AH8-11.08×10-5实施例7DAK3辛胺KGM-g-AH8-21.02×10-5实施例8DAK4辛胺KGM-g-AH8-39.75×10-6实施例9DAK2十二胺KGM-g-AH12-16.03×10-6实施例10DAK3十二胺KGM-g-AH12-25.84×10-6实施例11DAK4十二胺KGM-g-AH12-35.56×10-6实施例12DAK2十八胺KGM-g-AH18-14.39×10-6实施例13DAK3十八胺KGM-g-AH18-24.17×10-6实施例14DAK4十八胺KGM-g-AH18-33.91×10-6由表2数据可得知，制备原料脂肪胺为辛胺、DAK与脂肪胺质量比为1:0.5-1时，所得到两亲分子KGM-g-AH的临界胶束浓度在1×10-5g/mol以上，更利于在下一步复合纳米递送系统制备时选择溶剂和充分溶解，因此，所述KGM-g-AH制备原料按重量份数比优选为1份DAK和0.5-1份辛胺，后续样品制备中优选KGM-g-AH8-1和KGM-g-AH8-2为制备原料。反应步骤三：KGM-LIPO复合纳米药物载体的制备上述KGM-LIPO复合纳米药物载体的制备方法，包括以下步骤：1)按重量份数比称取16份的蛋黄卵磷脂、1-4份的KGM-g-AH和1-8份的胆固醇；2)将KGM-g-AH、胆固醇和蛋黄卵磷脂分别通过乙醇注入法、薄膜水合法、逆向旋蒸法、乙醇注入-硫酸铵梯度法，制备得到KGM-LIPO复合纳米药物载体；实施例15将5mgKGM-g-AH8-1、40mg胆固醇和80mg蛋黄卵磷脂溶解于40mL乙醇中并混合均匀，在磁力搅拌的条件注入80mL双蒸水中，搅拌60min后，将其转入茄形瓶中，在35℃的条件下减压蒸馏60min除去乙醇，取下茄形瓶300W超声5min，分别过0.45μm和0.22μm微孔滤膜5次，即得到均一的KGM-LIPO复合纳米药物载体1。实施例16将10mgKGM-g-AH8-2、10mg胆固醇和80mg蛋黄卵磷脂溶解于20mL乙醇/氯仿混合溶剂中，将其转入茄形瓶中，在25℃的条件下减压蒸馏90min除去溶剂，然后加入15mL双蒸水于茄形瓶中，在65℃条件下快速旋转水合20min，取下茄形瓶400W超声10min，分别过0.45μm和0.22μm微孔滤膜5次，即得到均一的KGM-LIPO复合纳米药物载体2。实施例17将20mgKGM-g-AH8-1、20mg胆固醇和80mg蛋黄卵磷脂溶解于40mL乙醇/乙醚混合溶剂中并混合均匀，在200W超声的条件下，用注射器将60mL双蒸水注入其中，超声15min后转入茄形瓶中，35℃下减压60min除去有机试剂，取下茄形瓶200W超声10min，分别过0.45μm和0.22μm微孔滤膜5次，即得到均一的KGM-LIPO复合纳米药物载体3。实施例18将40mgKGM-g-AH8-2、5mg胆固醇和80mg蛋黄卵磷脂溶解于40mL乙醇中并混合均匀，在300W超声的条件下，用注射器将60mL硫酸铵水溶液注入其中，超声10min后转入茄形瓶中，30℃下减压90min除去有机试剂，再将其转移至透析袋中用磷酸缓冲液透析24h，取出透析液定容，在45℃的条件下孵育30min，分别过0.45μm和0.22μm微孔滤膜5次，即得到均一的KGM-LIPO复合纳米药物载体4。表3KGM-LIPO复合纳米药物载体的平均粒径、多分散系数和电位由表3数据可得知，四种未载药的KGM-LIPO复合纳米药物载体中，实施例16和17所制得的复合纳米药物载体的多分散系数较小，因此，所述KGM-LIPO复合纳米药物载体制备原料按重量份数比优选为16份的蛋黄卵磷脂、2-4份的KGM-g-AH和2-4份的胆固醇。四种KGM-LIPO复合纳米药物载体中，实施例16制得的复合纳米药物载体的粒径最小，因此，所述KGM-LIPO复合纳米药物载体制备原料按重量份数比进一步优选为16份的蛋黄卵磷脂、2份的KGM-g-AH和2份的胆固醇。反应步骤四：载药KGM-LIPO复合纳米药物载体的制备上述载药KGM-LIPO复合纳米药物载体的制备方法，包括以下步骤：1)按重量份数比称取16份的蛋黄卵磷脂、2份的KGM-g-AH和2份的胆固醇；2)将KGM-g-AH、胆固醇、蛋黄卵磷脂和药物通过乙醇注入法、薄膜水合法、逆向旋蒸法和乙醇注入-硫酸铵梯度法制备得到载药KGM-LIPO复合纳米药物载体。其中，药物与载体的重量比为1：2-24。实施例19：载阿霉素KGM-LIPO复合纳米药物载体的制备使用薄膜水合法制备载阿霉素KGM-LIPO复合纳米药物载体，具体过程如下：将10mgKGM-g-AH8-1、10mg胆固醇、80mg蛋黄卵磷脂溶解于5mL乙醇中并混合均匀，将其转入茄形瓶中，在25℃的条件下减压除去乙醇90min，再注入15mL盐酸阿霉素水溶液(1mg/mL)于茄形瓶中，在65℃条件下快速旋转水合20min，取下茄形瓶200W超声5min，过0.45μm和0.22μm微孔滤膜，即得到均一的载阿霉素KGM-LIPO复合纳米药物载体。实施例20：载姜黄素KGM-LIPO复合纳米药物载体的制备使用薄膜水合制备载姜黄素KGM-LIPO复合纳米药物载体，具体过程如下：将10mgKGM-g-AH8-2、10mg胆固醇、80mg蛋黄卵磷脂和20mg姜黄素溶解于20mL乙醇中并混合均匀，在30℃的条件下减压90min除去乙醇，然后注入15mL去离子水于茄形瓶中，在65℃条件下快速旋转水合20min，取下茄形瓶400W超声5min，过0.45μm和0.22μm微孔滤膜，即得到均一的载姜黄素KGM-LIPO复合纳米药物载体。实施例21：共载姜黄素和阿霉素KGM-LIPO复合纳米药物载体的制备使用乙醇注入-硫酸铵梯度法制备共载姜黄素和阿霉素KGM-LIPO复合纳米药物载体，具体过程如下：将10mgKGM-g-AH8-2、10mg胆固醇、80mg蛋黄卵磷脂和30mg姜黄素溶解于10mL乙醇中并混合均匀，在300W超声的条件下，将20mL硫酸铵水溶液(300mmol/L)用注射器注入其中，超声10min，将其转入茄形瓶中，在35℃的条件下减压30min除去乙醇，再将其转移至3500MW透析袋中用去离子水透析6h，每隔2h更换透析介质，取出透析液定容，与20mL盐酸阿霉素水溶液(1mg/mL)混合，在50℃的条件下水浴孵育60min后，过0.45μm和0.22μm微孔滤膜，即得到均一的共载姜黄素和阿霉素KGM-LIPO复合纳米药物载体。实施例22：载紫杉醇KGM-LIPO复合纳米药物载体的制备使用乙醇注入法制备载紫杉醇KGM-LIPO复合纳米药物载体，具体过程如下：将10mgKGM-g-AH8-1、10mg胆固醇、80mg蛋黄卵磷脂和10mg紫杉醇溶解于10mL乙醇中并混合均匀，在磁力搅拌的条件注入双蒸水中，搅拌一定时间，将其转入茄形瓶中，在30℃的条件下减压60min除去乙醇，取下茄形瓶200W超声10min，过0.45μm和0.22μm微孔滤膜即得到载紫杉醇KGM-LIPO复合纳米药物载体。实施例23：载顺铂KGM-LIPO复合纳米药物载体的制备使用逆向蒸发法制备载顺铂KGM-LIPO复合纳米药物载体，具体过程如下：将10mgKGM-g-AH8-1、10mg胆固醇和80mg蛋黄卵磷脂溶解于10mL乙醇/氯仿混合溶剂中并混合均匀，在400W超声的条件下，将20mL顺铂水溶液(0.25mg/mL)用注射器注入其中，超声15min，将其转入茄形瓶中，在30℃的条件下减压60min除去有机试剂，取下茄形瓶400W超声5min，过0.45μm和0.22μm微孔滤膜即得到载顺铂KGM-LIPO复合纳米药物载体。实施例24：载药KGM-LIPO复合纳米药物载体包封率的测定将新鲜制备的实施例19-23中的载药KGM-LIPO复合纳米药物载体经排阻色谱法纯化：以去离子水作为洗脱液，使用葡聚糖凝胶G-25柱对载药KGM-LIPO复合纳米药物载体进行多次洗脱，而达到除去未包载入复合纳米药物载体的游离药物的目的。收集上述过柱后的复合纳米药物载体分散液，然后用乙醇溶解，用经同等处理的未载药的复合纳米药物载体的乙醇溶液作为对照，测定样品吸光度，用UV定量分析测定功能因子的吸光度A，通过标准曲线计算复合纳米药物载体中药物的含量。包封率(EE％)的计算公式如下：EE％＝C(E)/C(T)×100注：C(E)表示载体中药物的含量；C(T)为制备该复合纳米药物载体时总投入药物的量。载药KGM-LIPO复合纳米药物载体的包封率和载药量计算结果如表4所示。表4载药KGM-LIPO复合纳米药物载体的粒径、PDI、电位、包封率和载药量由表4数据可得知，实施例19-23的五种载药KGM-LIPO复合纳米药物载体中，载阿霉素、载姜黄素以及共载阿霉素和姜黄素的KGM-LIPO复合纳米药物载体的包封率和载药量最高，因此，在后续的检测中，选择载阿霉素、载姜黄素以及共载阿霉素和姜黄素的KGM-LIPO复合纳米药物载体进行考察，并以实施例16所制得的KGM-LIPO复合纳米药物载体2为对照。当加入药物的量过高时，复合纳米药物载体对药物的包封率会显著下降，而当加入药物的量过低时，复合纳米药物载体对药物的载药量较低，因此，所述的载药KGM-LIPO复合纳米药物载体制备原料按重量份数比进一步优选为16份的蛋黄卵磷脂、2份的KGM-g-AH、2份的胆固醇和2-4份药物。实施例25：微观形貌观察分别将新鲜制备的未载药(实施例16)和载药(实施例19、20、21)的KGM-LIPO复合纳米药物载体用去离子水稀释数倍后滴于铜网上，待其水分自然挥干，使用2％的磷钨酸复染数分钟，再待水分挥干，使用透射电镜观察其微观形貌，结果如图1所示。图1中的a、b、c、d分别指未载药、载阿霉素、载姜黄素以及共载姜黄素和阿霉素的KGM-LIPO复合纳米药物载体的形貌。从图中可见，四种复合纳米药物载体微粒均为球状核壳结构，尺寸约100-250nm，其中载姜黄素的KGM-LIPO复合纳米药物载体微粒的粒径最小，与动态光散射仪结果一致。实施例26：载药KGM-LIPO复合纳米药物载体储藏稳定性的测定分别将使用实施例19、20、21方法所制备的三种载药复合纳米药物载体置于4℃条件下避光保存28天，并且分别于第1、3、5、7、14、28天取样0.2mL稀释至2mL，测定其粒径、分散度和微粒表面的电荷的变化。图2为上述几种复合纳米药物载体在4℃、避光条件下、28天的储藏稳定性的图片，从图中可以看出，在储藏的过程中，三种载药KGM-LIPO复合纳米药物载体的粒径、电位和分散度变化不大，表明其储藏稳定性较好。实施例27：KGM-LIPO复合纳米药物载体的体外释药实验将实施例20中所制备的载姜黄素KGM-LIPO复合纳米药物载体和载姜黄素普通脂质体过葡聚糖凝胶G25色谱柱数次以除去未包载的游离药物，再分别取5mL样品置于3500MW透析袋中，将其分别置于25mLpH＝5.0和7.4的磷酸缓冲液(含有5％的吐温80)中，最后将其至置于37+1℃的避光恒温摇床中以60rpm的速度震荡。在固定的时间间隔取3mL透析外液，并及时补充等量的新鲜的透析液。通过紫外可见分光光度法，对透析外液进行姜黄素含量测定，建立时间-药物浓度曲线(体外释药曲线)。图3为上述复合纳米药物载体和普通脂质体在pH＝5.0和7.4条件下的体外释药曲线。从图中可以看出在pH＝5.0时，KGM-LIPO复合纳米药物载体对姜黄素的释放速率显著高于普通脂质体，这是因为复合纳米药物载体中的KGM-g-AH分子可在酸性条件下降解，从而可快速释放出大量药物；而在pH＝7.4时，KGM-LIPO复合纳米药物载体对姜黄素的释放速率均低于普通脂质体，表明载姜黄素KGM-LIPO复合纳米药物载体稳定性高于载姜黄素普通脂质体。实施例28：KGM-LIPO复合纳米药物载体的细胞毒性试验使用MMT法，选用HepG2细胞进行体外毒性实验。将实施例16中制备的KGM-LIPO复合纳米药物载体2经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，用含少量胎牛血清的DMEM培养液稀释至128、64、32、16、8、4、2、1、0ug/mL。HepG2细胞分别按6000个/孔的浓度接种于96孔板中，经含有10％FBS的DMEM(200μL/孔)培养24h后，换入200μL含前述系列浓度KGM-LIPO复合纳米药物载体的新鲜培养液，继续培养48h。以200μL新鲜培养基置换出孔中溶液后，向每孔加入20μLMTT溶液(5mg/mL)，于37℃在含5％CO2的培养箱中培养4h，然后将细胞用新鲜的细胞培养基冲洗干净以除去MTT，再向每孔中加入150μLDMSO。用酶标仪在570nm处测定其光密度(OD值)，计算相对细胞存活率。图4为上述方法所测得的KGM-LIPO复合纳米药物载体2对HepG2细胞的体外毒性，由结果可知，当加入的复合纳米药物载体浓度在0-64ug/mL时HepG2细胞的相对存活率均高于95％，当复合纳米药物载体浓度达128ug/mL时，HepG2细胞的相对存活率仍高于80％，表明KGM-LIPO复合纳米药物载体本身毒性较低。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。当前第1页1 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