本发明涉及从白花蛇舌草(hedyotisdiffusawilld，hdw)中提取的有机酸齐墩果酸(oleanolicacids)、熊果酸(ursolicacids)、阿魏酸(ferulicacid)在制备抗炎症疾病药物中的用途。
背景技术：
慢性阻塞性肺疾病，简称慢阻肺(copd)是世界各地疾病发生和致死的主要原因之一，且预计到2030年将成为全球疾病致死的第三大原因，吸烟被认为是该病的主要发病因素。该疾病的特征在于进行性加重的气流受限且伴有肺部炎症，可能是由于反复暴露于香烟烟雾中及革兰氏阴性菌内毒素脂多糖刺激而造成的。慢阻肺的病理生理特点之一是多种炎症细胞(包括巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞等)的浸润，各种细胞因子的释放。
细胞因子是慢性炎性疾病的主要调控因子，目前已有50余种细胞因子被报道与慢阻肺相关。白细胞介素-1β(il-1β)是一种促炎细胞因子，它可以激活慢阻肺患者体内的巨噬细胞使其分泌炎症细胞因子及趋化因子，可促进淋巴细胞活化增殖及引起白细胞的聚集。肿瘤坏死因子-α(tnf-α)是一种在固有免疫中由巨噬细胞分泌的一种重要的细胞因子，其可在适应性免疫被激活前对入侵的病原微生物迅速产生防御反应；它可由革兰氏阴性菌内毒素脂多糖刺激活化巨噬细胞而生成。tnf-α的分泌失调已被证实在一些炎症性疾病中发挥作用。转化生长因子-β(tgf-β)是一种可以在慢阻肺中起重要作用的多功能生长因子，可诱导成纤维细胞和气道平滑肌细胞的增生，胞外基质的沉积和上皮修复；它还具有通过调节调节性t(treg)细胞分泌il-10起免疫抑制作用，对气道炎症起免疫调节作用。抗炎药将通过抑制炎症细胞聚集及炎症因子释放达到治疗的目的。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供白花蛇舌草提取物在制备抗炎症疾病药物中的应用。
为了完成本发明的目的，本发明涉及从白花蛇舌草(hedyotisdiffusawilld，hdw)提取的有机酸，如式(i)所示的化合物齐墩果酸(oleanolicacids)
如式(ii)所示的化合物熊果酸(ursolicacids)
或如式(iii)所示的化合物阿魏酸(ferulicacid)
慢阻肺的病理生理特点是肺部炎症细胞(包括巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞等)的浸润。香烟烟雾和脂多糖均可刺激活化肺泡巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等炎症细胞，使之聚集于气道及其周围组织，参与气道壁和肺泡壁的破坏和重塑。因此肺灌流液中炎症细胞的数目反映了肺部炎症的严重程度。
在本发明白花蛇舌草提取物对小鼠支气管肺泡灌流液炎症细胞的作用中，与未经刺激的小鼠相比，香烟烟雾和脂多糖刺激可使支气管肺泡灌流液中白细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞数量升高；香烟烟雾和脂多糖刺激并使用白花蛇舌草提取物组(提取物用量：低剂量组：50mg/kg、高剂量组：100mg/kg)与香烟烟雾和脂多糖刺激但未用白花蛇舌草提取物组比较，低剂量组与高剂量组的支气管肺泡灌流液中白细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞数量均有不同程度的下降，表明白花蛇舌草提取物可降低炎症细胞在肺内的浸润程度，说明其对肺部炎症可起一定的缓解作用。
如前所述，慢阻肺中炎症细胞可在肺组织浸润并参与其炎症反应，破坏和重塑气道组织。在慢阻肺小鼠肺组织病理学检查中，经过白花蛇舌草提取物治疗处理的小鼠肺组织炎症程度及其评分显著地低于未经处理的小鼠肺组织炎症程度及其评分，说明白花蛇舌草提取物可减轻肺部炎症反应。
il-1β、tnf-α、tgf-β是炎症反应中的重要介质，il-10则与免疫抑制相关。慢阻肺患者中肺部局部il-1β水平升高激活全身性炎症反应轴，被确定为患者疾病急性加重发作的重要途径。在慢阻肺加重期，活化的单核巨噬细胞会产生较高水平的tnf-α，tnf-α促进炎症细胞粘附、游走和浸润，引起肺组织损伤。tgf-β是一种有效的促纤维化因子，表达过度会导致细胞外基质沉积引起气道重塑，参与慢阻肺的发生和发展。
白花蛇舌草提取物在烟雾和脂多糖诱导的慢阻肺小鼠模型中起治疗作用。在本发明白花蛇舌草提取物对小鼠支气管肺泡灌洗液il-1β、tnf-α、tgf-β和il-10浓度的影响中，与未经暴露的小鼠相比，香烟烟雾和脂多糖暴露会使il-1β、tnf-α、tgf-β和il-10浓度水平上升；香烟烟雾和脂多糖暴露并使用白花蛇舌草提取物组(白花蛇舌草提取物用量：低剂量组：50mg/kg、高剂量组：100mg/kg)与香烟烟雾和脂多糖暴露但未用白花蛇舌草提取物组比较，低剂量组与高剂量组的il-1β、tnf-α、tgf-β浓度水平均显著降低，il-10浓度水平则被抑制但并不显著，表明白花蛇舌草提取物对il-1β、tnf-α、tgf-β的释放有较强的抑制作用，说明本发明白花蛇舌草提取物有较明显的抗炎作用。
慢阻肺进展过程中，由于各种炎症细胞浸润和聚集、各类炎症因子的释放及刺激，不仅会造成肺组织的损伤，同时也会引起肺组织的增生修复，此为慢阻肺炎症病理变化的特征之一。在本发明白花蛇舌草提取物对人正常肺上皮细胞(beas-2b)的增殖实验中，其对beas-2b细胞增殖起抑制作用，实验所得的ic50为9.05μmol/l，说明本发明提取物可减缓炎症增生，缓解炎症症状。
附图说明
图1为hplc-ms获取的关于阿魏酸(ferulicacid)的提取离子流色谱图(xic)，飞行时间质谱(tofms，扫描范围m/z80-800)表明最高峰所代表的分子其分子量为193.051±0.005da。
图2为hplc-ms获取的关于齐墩果酸(oleanolicacids)、熊果酸(ursolicacids)的提取离子流色谱图，飞行时间质谱(扫描范围m/z80-800)表明最高峰所代表的分子其分子量为455.353±0.005da。
图3为白花蛇舌草提取物对copd小鼠肺部炎症的缓解作用之h&e染色结果(放大倍数为200倍)。control，经纯净空气及生理盐水诱导的小鼠且其接受过生理盐水的治疗；sl，经烟草烟雾及脂多糖诱导的小鼠且其接受过生理盐水的治疗；bl，经烟草烟雾及脂多糖诱导的小鼠且其接受过剂量为50mg/kg白花蛇舌草提取物的治疗；bh，经烟草烟雾及脂多糖诱导的小鼠且其接受过剂量为100mg/kg白花蛇舌草提取物的治疗；dex，经烟草烟雾及脂多糖诱导的小鼠且其接受过剂量为1mg/kg地塞米松的治疗。
图4为白花蛇舌草提取物对copd小鼠肺部炎症的缓解作用之肺部炎症程度评分。分组说明同图3。注：**p<0.01，与c组相比；#p<0.05，与sl组相比。
图5为白花蛇舌草提取物对beas-2b细胞增殖的作用。抑制率的计算：(对照组的吸光度均值－治疗组的吸光度均值)/对照组的吸光度均值。
具体实施方式
本发明将通过以下实施例作进一步说明，但本发明并不限于这些实施例。
实施例1：白花蛇舌草提取物制备。
将2.5kg新鲜的白花蛇舌草叶及茎干切成小碎片，以25l85％乙醇回流提取并过滤。乙醇滤液溶剂以旋转式蒸发器蒸发，乙醇蒸发后剩余液体的相对密度为1.05，随后通过喷雾干燥仪获取干粉即白花蛇舌草提取物。
干粉制成供试品溶液进行hplc-ms法分析。色谱柱为shim-packgistc18柱(75mm×2.1mm，2μm)；柱温35℃；流动相为乙醇、水及0.05％乙酸；进样量5μl，体积流量为0.2ml/min。质谱条件离子源为电喷雾离子化源(esi)，采用负离子检测模式。检测范围为m/z80-800。hplc-ms分析显示，白花蛇舌草提取物干粉主要含有齐墩果酸、熊果酸、阿魏酸三种成分，三种成分的相对保留时间为：齐墩果酸、熊果酸为20.720min，阿魏酸为4.866min。相关分析结果如附图1和附图2。
实施例2：白花蛇舌草提取物对copd小鼠肺组织中炎症细胞浸润的抑制作用。
慢阻肺的病理生理特点是炎症细胞(包括巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞等)移行浸润于肺部。香烟烟雾和脂多糖均可刺激活化肺部中巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等炎症细胞，使之聚集于气道及其周围组织，参与气道壁和肺泡壁结构的炎症。因此肺灌流液中炎症细胞的数目可反映肺部炎症的严重程度。本实验意在探究白花蛇舌草提取物对炎症细胞浸润于肺组织的抑制作用。
方法：6-8周龄的昆明雄性小鼠每组15只，分别分为control组(c组)、smoking+lps(sl组)、sl+hdw低高剂量组(bl/bh组)及地塞米松组(dex组)。除c组以纯净空气及生理盐水诱导处理外，其余各组均给予香烟烟雾及脂多糖诱导处理(烟雾诱导30天，20μg脂多糖溶于30μl生理盐水中于第1天及第14天经鼻滴诱导)；各组于香烟烟雾诱导前1h给予治疗措施(c组与sl组以生理盐水治疗，bl/bh组以不同浓度白花蛇舌草提取物治疗：bh组：100mg/kg、bl组：50mg/kg，dex组以1mg/kg地塞米松治疗)；实验结束24小时内，各组取9只小鼠麻醉并暴露气管，向左肺分三次注入1mlpbs并回抽获得支气管肺泡灌流液。将支气管肺泡灌流液离心，留取上清于-70℃保存备用，将底层细胞用300μlpbs溶液重悬，通过血细胞分析仪分类计数，比较不同组别之间炎症细胞的绝对数量。
结果：与c组相比，sl组支气管肺泡灌流液中白细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞数量升高；bl/bh组与sl组比较，bl/bh组支气管肺泡灌流液中白细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞数量均有不同程度的下降，表明白花蛇舌草提取物可抑制炎症细胞在肺组织内的浸润。见表1。
表1白花蛇舌草提取物对炎症细胞浸润的抑制作用
注：*p<0.05，与c组相比，#p<0.05，与sl组相比。
实施例3：白花蛇舌草提取物对copd小鼠肺组织炎症的缓解作用。
如前所述，慢阻肺中炎症细胞可在炎症部位聚集浸润并参与炎症。本实验目的是从病理学的角度探究白花蛇舌草提取物对copd小鼠肺组织炎症的缓解作用。
方法：按实施例1的方法进行分组造模，并给予治疗措施；实验结束24小时内，各组分别取6只小鼠麻醉，固定，胸腔解剖，心脏放血处死，结扎右肺门取右肺；右肺以4％的甲醛溶液固定。甲醛处理过的右肺经酒精梯度脱水及二甲苯透明后，进行石蜡包埋，冷却后制成3μm的切片进行h&e染色，随后通过数字分析成像系统对染色后的切片进行组织形态分析，并对炎症程度进行评分。炎症程度评分以0～5表示：0：没有炎症细胞，1：有少许炎症细胞浸润，2：有1层炎症细胞浸润，3：有2层炎症细胞浸润，4：有3～4层炎症细胞浸润，5：大于或等于5层炎症细胞浸润。
结果：经过白花蛇舌草提取物治疗处理的小鼠肺组织炎症程度及其评分显著地低于未经处理的小鼠肺组织炎症程度及其评分，说明白花蛇舌草提取物可缓解肺部炎症反应。见附图3和附图4。
实施例4：白花蛇舌草提取物对copd小鼠支气管肺泡灌流液中il-1β、tnf-α、tgf-β和il-10的影响。
il-1β、tnf-α、tgf-β和il-10是炎症反应中的重要介质。慢阻肺患者中气道局部组织il-1β水平升高激活全身性炎症反应轴，被确定为患者疾病急性加重发作的重要途径。在慢阻肺加重期活化的单核巨噬细胞产生较高的tnf-α，tnf-α促进炎症细胞粘附、游走和浸润，引起肺组织损伤。tgf-β是一种有效的促纤维化因子，表达过度会导致细胞外基质沉积引起气道重塑，参与慢阻肺的发生和发展。il-10由调节性t细胞分泌，其水平与慢阻肺炎症严重程度相关。本实验的目的在于探索白花蛇舌草对上述各类因子的影响。
方法：按实施例1方法留取的上清液用elasa试剂盒检测细胞因子水平，比较不同组别细胞因子的浓度水平。
结果：与c组相比，sl组il-1β、tnf-α、tgf-β和il-10浓度水平上升；bl/bh组与sl组比较，bl/bh组的il-1β、tnf-α、tgf-β浓度水平均显著降低，il-10浓度水平则被抑制但并不显著，表明白花蛇舌草提取物对il-1β、tnf-α、tgf-β的释放有较强的抑制作用。见表2。
表2有机酸提取物对不同细胞因子浓度水平的影响
注：*p<0.05，与c组相比，#p<0.05，与sl组相比
实施例5：白花蛇舌草提取物对人正常肺泡上皮细胞(beas-2b)的细胞增殖起抑制作用。
慢阻肺进展过程中，由于各种炎症因子的释放及刺激、炎症细胞浸润和聚集，不仅会造成肺组织细胞的损伤，同时也会引起肺组织细胞的增生修复，此为慢阻肺炎症病理变化的特征之一。该实验的目的在于考察白花蛇舌草提取物对beas-2b细胞增殖的影响。
方法：将beas-2b细胞种植在一块96孔板中，过夜使细胞贴壁。分别以0、0.1、1、10μmol/l的白花蛇舌草提取物处理细胞；处理24小时后，向96孔板各孔中加入cck8反应2h，随后用酶标仪以490nm波长测量并记录在490nm波长下各孔的吸光度，以0μmol/l白花蛇舌草提取物处理的细胞孔为对照组，计算细胞在其它浓度处理下的抑制率。
结果：白花蛇舌草提取物对beas-2b细胞增殖起抑制作用。经不同浓度白花蛇舌草提取物处理的细胞孔其抑制率为：0.1μmol/l：16.33％，1μmol/l：27.30％，10μmol/l：29.15％；经数据处理后所得ic50为9.05μmol/l。见附图5。