几丁聚糖作为治疗外伤性视神经病变药物的应用的制作方法

本发明涉及几丁聚糖的临床新用途，尤其涉及几丁聚糖作为治疗外伤性视神经病变药物的应用。

背景技术：

外伤性视神经病变(Traumatic Optic Neuropathy，TON)是指钝挫伤或穿透性的头部或面部创伤引起的严重的视神经损伤性疾病，临床上表现为色觉障碍、视野缺陷、瞳孔传入障碍、视力丧失等。

TON包括原发性损伤和继发性损伤，原发性TON主要是由外伤直接导致的视神经牵拉损伤、挫裂伤等，病理变化表现为：视神经水肿、局部血管受压或循环障碍引起的视神经炎；继发性TON主要指原发伤导致的视神经缺血水肿等引起的视神经损伤，病理变化表现为：视网膜神经节细胞(Retinal Ganglion Cells,RGCs)不同程度的死亡，继发损伤发病机制目前尚不明确。动物研究证实视神经损伤后视功能下降的病理基础是以轴突纤维的溃变死亡以及RGCs继发性丧失为主。因此，如何促进损伤视神经的修复、尽力挽救视力功能是临床和基础研究的重要课题，也是当今世界医学领域里研究的热点之一。

目前临床上最常用的治疗方法是激素冲击疗法，但是无论临床随访以及动物实验结果均证明：激素疗法并没有改善视觉功能，甚至增加激素用量反而会加重轴突的损伤，导致RGCs进一步死亡(Steinsapir 2000；Diem 2003；Yu-Wai-Man&Griffiths,2007)。因此，找到一种安全有效且无副作用的药物抑制RGCs的凋亡和促进神经再生是治疗外伤性视神经病变的热点问题。本发明要解决的技术问题是：进一步扩大几丁聚糖在临床的新用途。

几丁聚糖(Chitosan)来源于几丁质，又名壳聚糖(chitosan)分子式为：(C6H11O4N)n，是从甲壳纲动物、真菌、酵母、硅藻海绵、低等植物菌类、藻类、软体动物及蠕虫等细胞壁中提取出来的一种含有大量阳离子的葡萄糖胺多聚体，几丁聚糖的制备方法可以参见(中国专利公开的一种几丁聚糖的制备方法，授权公告号CN 105542034 B，授权公告日2018.01.30)或者(中国专利公开的一种几丁聚糖制备方法，授权公告号CN 104045741 B，授权公告日2016.09.07)提取。

在大鼠体内进行几丁聚糖灌胃后的药代动力学及生物降解作用研究表明：聚集在肝脏和肾脏中的几丁聚糖最多，其次多在心脏、脑以及脾脏，同时也发现由于几丁聚糖是大分子多糖，在各组织器官检测到的几丁聚糖均为其降解产物且分子量小于65KD，因此在组织器官中真正起作用的也是几丁聚糖的降解产物。几丁聚糖的代谢产物几丁寡糖通过抑制Bax/Bcl-2的升高和caspase-3的活性避免凋亡的发生进而显著地抑制谷氨酸盐诱导的PC12细胞死亡。在Aβ1-42诱导的神经退行性疾病阿尔兹海默大鼠模型中，口服几丁寡糖可以抑制氧化压力和炎症反应有效减缓学习、记忆和认知能力的衰退。几丁聚糖还可以抑制细胞凋亡、线粒体膜电位的损坏以及ROS的产生以增加细胞的存活。由于几丁寡糖可以通过调控钙离子的增加阻止谷氨酸盐诱导的海马神经元的死亡，因此几丁聚糖及降解产物几丁寡糖可以用于治疗帕金森病。几丁寡糖还可以通过减少谷氨酸盐的神经毒性和活性氧的产生治疗亨廷顿舞蹈症。在几内亚猪脊髓损伤实验中发现局部使用几丁聚糖可以促进细胞膜封闭，恢复脊髓的神经冲动。在外周神经损伤后，几丁寡糖可以能够促进神经再生，同时发现几丁寡糖能够显著增加再生有髓神经纤维的数量、肌动作电位、肌肉纤维的横截面积以及再生髓鞘的厚度。同样，在大鼠坐骨神经损伤模型中，几丁寡糖能够促进外周神经的再生。几丁聚糖的降解产物几丁寡糖通过促进趋化因子CCL2，诱导和招募巨噬细胞到达损伤位点重构损伤部位的微环境，促进外周神经再生。

同时，在临床应用中，几丁聚糖不仅可以预防和治疗顾客手术后的组织粘连、缓解膝关节和骨关节等退行性关节炎，还能够降低血糖和血脂，减轻动脉粥样硬化，调节睡眠等(“几丁聚糖在临床上的应用”，万里、田伟，沈阳医学院学报，第15卷第2期，2013年6月)。

综合以上，治疗外伤性视神经病变的关键在于找到一种可以减少RGCs的凋亡和促进视神经的再生的药物。几丁聚糖及其降解产物在神经退行性疾病及其他神经疾病中的神经保护作用主要包括以下：抗氧化、抑制神经炎症、抑制兴奋毒性、减少凋亡作用、调控基因表达和离子通道、金属离子螯合剂、神经营养因子、金属蛋白酶抑制剂。并且几丁聚糖在临床中已大量使用，是很安全的药物。而几丁聚糖促进神经组织及其它组织生长愈合的潜在功能无疑对于目前尚无有效治疗方法的神经病变疾病带来了希望。但是迄今为止，在TON中几丁聚糖的作用无人报道。同时，在外伤性视神经病变中几丁聚糖在TON中机制也不清楚。

技术实现要素：

本发明目的是提供几丁聚糖在临床上的新用途。

为了实现上述目的，本发明提供几丁聚糖的一个新用途：几丁聚糖或其药学上可接受的盐、脂、溶剂合物在治疗外伤性视神经病变药物中的应用。

上述应用中，所述外伤性视神经病变为钝挫伤或穿透性的头部或面部创伤引起的视神经损伤性疾病。

上述疾病选择下述任意一种：色觉障碍、视野缺陷、瞳孔传入障碍、视力丧失。

上述疾病的治疗对象为：所述的疾病为外伤性视神经损伤的人群。

上述应用中，所述几丁聚糖的浓度为30mg/kg/day、100mg/kg/day、300mg/kg/day。

上述应用中，所述几丁聚糖的浓度优选为300mg/kg/day。

本发明提供一种治疗外伤性视神经病变的药物，其活性成分为几丁聚糖或其药学上可接受的盐、脂、溶剂合物。

上述药物用于治疗外伤性视神经病变为钝挫伤或穿透性的头部或面部创伤引起的视神经损伤性疾病，主要为下述任意一种：色觉障碍、视野缺陷、瞳孔传入障碍、视力丧失。

上述药物用于治疗外伤性视神经损伤的人群。

上述药物中，几丁聚糖的浓度为300mg/kg/day。

本发明的有益效果：本发明通过实验证明几丁聚糖是一种用于治疗外伤性视神经病变药物，具有如下优点：

(1)实验结果证明，几丁聚糖能促进视神经RGCs的存活。

(2)实验结果证明，几丁聚糖代替以往的激素疗法，改善视觉功能，减少视视网膜RGCs的死亡。

(3)实验结果证明，几丁聚糖促进视神经的再生。

(4)实验结果证明，几丁聚糖促进视神经闪光视觉诱发电位(F-VEP)的恢复。

(5)相较于其他治疗治疗外伤性视神经病变的药物，安全，成熟，毒副作用低。

(6)由于几丁聚糖在临床上用途广泛，因此作为治疗外伤性视神经病变药物，可降低研究成本，节约资源，缩短开发周期。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是不同浓度的几丁聚糖灌胃后大鼠体重的变化图；

图2是不同浓度的几丁聚糖灌胃后大鼠视神经的HE染色结果图；

图3是不同浓度的几丁聚糖灌胃后大鼠视网膜的HE染色结果对比图；

图4中A是不同实验组大鼠视网膜GCL层RGCs的数量变化图；B是不同实验组大鼠视网膜GCL层RGCs的数量变化电镜图；

图5中A是手术组和加药组不同天数大鼠视网膜GCL层RGCs的数量变化图；B是手术组和加药组不同天数大鼠视网膜GCL层RGCs的数量变化电镜图；

图6是几丁聚糖促进大鼠视神经夹持后视神经的再生(星号标记为视神经夹持部位)图；

图7是几丁聚糖促进闪光视觉诱发电位(F-VEP)的恢复图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如果没有特殊说明，均为常规的实验方法。

实验一：探索大鼠视神经夹持损伤模型中几丁聚糖浓度的影响

步骤一：采用经球结膜外眦部开神经鞘膜并夹伤视神经法建立稳定的视神经夹持伤模型；

步骤二：由于商品化几丁聚糖分子量较大且难溶，因此通过灌胃方式将不同浓度的几丁聚糖注入视神经夹持模型中，不同浓度即采用30mg/kg/day、100mg/kg/day、300mg/kg/day的几丁聚糖；

步骤三：注入不同浓度的几丁聚糖之后连续观察18天，记录实验结果(参见图1)。

由实验结果显示可知，灌胃18天后，发现不同浓度的几丁聚糖对大鼠体重均无影响，且与手术组无显著差异，因此不同浓度几丁聚糖对大鼠并无毒害作用。

实验二：探索几丁聚糖对大鼠夹持模型中视神经及其视网膜的作用

步骤一和步骤二同上述实施例一的步骤一和步骤二；

步骤三：视神经夹持14天以后，经过苏木精-伊红染色，观察结果。

视神经夹持14天以后(参见图2)，经过苏木精-伊红染色后可以看见假手术组的视神经染色均匀。呈现条索状，神经胶质细胞核排列整齐，空泡极少；而经过视神经夹持以后发现神经胶质细胞核排列紊乱，细胞质减少，空泡增加，出现水肿现象；与手术组相比，30mg/kg/day和100mg/kg/day浓度组的视神经染色不均一，细胞排列紊乱，空泡仍然很多，而300mg/kg/day浓度组与手术组相比，染色均匀，空泡明显减少，细胞质增加。

视神经夹持14天以后(参见图3)，同样经过HE染色结果发现，与假手术组相比，手术组的视网膜厚度明显变薄，GCL层及各层细胞数目明显减少，且内核层和外核层显稀薄。加药后可见，视网膜厚度较手术组明显增加，内外核层较手术组明显增厚。

实验三：探索不同浓度的几丁聚糖对大鼠视神经夹持后促进RGCs的存活情况

步骤一和步骤二同上述实施例一的步骤一和步骤二；

步骤三：通过心脏灌注取出眼球，冰冻切片进行免疫荧光染色，观察结果。

实验结果显示(参见图4)，与假手术组相比，手术组RGCs数目显著减少，而通过给予几丁聚糖以后发现，RGCs的数目均不同程度地增加，并且RGCs的数量随着几丁聚糖浓度的增加呈现增长趋势,经过统计学分析，100mg/kg/day和300mg/kg/day浓度组与手术相比，RGC数量增加有统计学意义(P>0.05)。

实验四：探索几丁聚糖减少不同时间点视网膜RGCs的死亡情况

上述各实施例的结果表明，300mg/kg/day浓度的几丁聚糖对于动物本身并无不良影响，且通过HE结果发现该浓度的几丁聚糖对于视网膜和视神经结构都有一定保护作用。因此，本实施例进一步研究300mg/kg/day浓度在视神经夹持损伤后不同时间点对视网膜和视神经的作用，探索几丁聚糖在视神经夹持损伤中可能的作用机制。

首先，通过NeuN抗体进行免疫荧光染色，比较不同时间点的几丁聚糖对RGCs的作用，结果显示(参见图5)，与假手术组相比，夹持视神经后，RGCs数目随着时间的延长而逐渐减少，而夹持的不同时间点加药后，其数目都不同程度地增加，且与手术组有显著差异,因此，几丁聚糖对于不同时间点的RGCs都有保护作用。

实验五：探索几丁聚糖促进大鼠视神经夹持后视神经的再生情况

生长相关蛋白(Growth associated protein,GAP-43)是神经再生的特异性标志物，GAP-43的表达可在一定程度上反映伤后视功能恢复的情况，因此利用免疫荧光的方法检测几丁聚糖是否可以促进视神经的再生。

(参照图6)在正常组的视神经中GAP-43几乎没有表达，夹持3天和7天后，加药组与手术组无差异，没有视神经再生，而夹持14天组的结果发现加药组的GAP-43表达明显增加(白色箭头所指)，提示几丁聚糖可以促进视神经再生。

实验六：探索几丁聚糖促进闪光视觉诱发电位(F-VEP)的恢复情况

(参见图7)F-VEP指示着视神经夹持损伤后视路的光觉传导功能。右眼为手术眼，手术组振幅降低，且随着时间延迟并没有改善；与手术组相比，加药组振幅明显回复。进一步表明几丁聚糖促进视觉功能的恢复。

本发明的具体实施例

以外伤性视神经病变的患者为例，对本发明药物新用途的具体实施方式进行说明。

第一步，采集取样，选取20名患有外伤性视神经病变的患者，年龄在20岁以上，男女不限。患者入组条件如下：

1)未接受过手术治疗或其他药物治疗；

2)无严重的药物过敏史；

3)可以口服药物；

4)签署书面知情同意书；

5)血象、心、肺、肝、肾等主要器官功能基本正常，血常规检查检查正常。

第二步：分组，通过随机盲法对照试验法将20名患者分为两组：试验组、对照组各10人。

第三步：进行试验，按照300mg/kg/day浓度，给试验组的每个人服用几丁聚糖，每天服用一次，每个疗程七天，连续服用5个疗程；给对照组的每个人服用安慰剂，不做治疗。

第三步：用药2个疗程以后，对两个组的患者进行检查，发现试验组的各个患者视力明显有了好转，没有明显的副作用。而对照组的各位患者，并没有明显的变化。

用药3个疗程后，对两个组的患者进行检查，发现试验组的各个患者视力有了好转，并且视野比之前正常，没有明显的副作用。而对照组的各位患者，并没有明显的变化。

用药4个疗程后，对两个组的患者进行检查，发现试验组的各个患者视力比以前好了，视野比较正常，且眼球可以向内、上、下方向活动自由。对照组的各位患者依旧没有明显的变化。

用药5个疗程后，对两个组的患者进行检查，发现试验组的各个患者视力有了明显的回升，视野变的正常，眼球向内、上、下方向活动自由，眼球向下及外展运动正常。对照组的各位患者依旧没有明显的变化。

由此可知，相比没有采取治疗措施的患者，用药以后的患者视力有了回升，视野变的正常，眼球向内、上、下方向活动自由，眼球向下及外展运动正常。因此药物几丁聚糖对外伤性视神经病变的患者的治疗有明显的治疗效果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。