一种DNA纳米带在抗细胞凋亡上的应用及其制备方法与流程

本发明属于生物医药技术领域，特别涉及一种DNA纳米带在抗细胞凋亡上的应用及其制备方法。

背景技术：

细胞凋亡是指为维持人体内环境稳定，由基因控制的细胞程序性的死亡，是细胞的一种基本生物学现象，但紊乱的细胞凋亡过程与许多疾病的发生有直接或者间接的关系。其中，细胞色素C是参与细胞凋亡不可或缺的重要因子，细胞色素C是线粒体内膜上的嵌入蛋白，位于线粒体内膜外侧，具有亚铁血红素基团，作为一个单电子载体在膜结合复合物Ⅲ(Cyt c还原酶)和复合物Ⅳ(Cyt c氧化酶)之间传递电子。当凋亡信号引发时会引起线粒体中的细胞色素c释放，细胞色素c与凋亡酶激活因子等形成凋亡体，然后激活细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶caspase-3，进而引发caspases级联反应，导致细胞凋亡。目前，抑制细胞凋亡的几种方法有：(1)通过免疫耗竭从胞质溶胶中消除细胞色素c；(2)在胞质溶胶中加入蔗糖以稳定线粒体，抑制细胞色素c被释放；(3)使用凋亡抑制蛋白(AP家族)，在细胞有丝分裂期的纺锤体上抑制caspase-3，caspase-7的活性，使有丝分裂继续进行下去；(4)应用通常以二聚体的形式发挥抑制细胞色素C从细胞线粒体中释放的B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)。以上几种传统方法比较繁琐，不好控制，有些目的蛋白难以制备而且难以投入市场推广，且效果不可控。例如，AP家族中的survivin蛋白的表达基因只表达于肿瘤和胚胎组织，但在正常成人组织中表达很少，在现有的技术条件下虽然可以制得该蛋白，但需要在体外模拟复杂的基因转录及表达环境，是一个比较大的挑战，使得该蛋白难以制得；Bcl-2这一家族的物质大都既有抗凋亡作用，也有促凋亡的作用，控制不当可能会造成相反的效果。

DNA折纸技术就是利用DNA分子本身的结构与其分子之间的特异性结合把DNA像“纸”一样折成各种2D与3D结构，该技术使得DNA不仅仅为一种遗传物质，更开发出了DNA更为复杂的结构与功能，在DNA折纸技术日趋完善的条件下，DNA的结构与功能越来越多样化。

研究表明，当凋亡信号引发时，线粒体内，外膜之间的通透性转化孔(PTP)开放，细胞色素C通过易位从线粒体释放，并与胞浆中的凋亡蛋白水解酶活化因子结合，进而启动caspase级联反应，促使细胞凋亡。

本发明将现有的一种DNA折纸结构应用与细胞非正常凋亡过程，通过抑制细胞色素C过氧化物酶活性来抑制细胞色素C所启动的caspase级联反应，从而达到抗细胞凋亡的目的。

技术实现要素：

本发明利用DNA折纸结构抑制细胞色素C过氧化物酶活性，从而达到抗细胞凋亡的目的，有望于在针对细胞色素C酶活性调控的药物传输系统和靶向送药方面提供重要参考。

本发明提供了一种DNA纳米带在抗细胞凋亡上的应用，并且所述DNA纳米带是由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所述的四条DNA链制备而成的。

一种上述应用中DNA纳米带的制备方法，包括如下步骤：

S1，准备浓度均为100μmol/L的以下四条DNA链，备用：

Staple 1:5’-cagccctgtaagatgaagatagcgtctatgcc-3’，

Staple 2:5’-ccctgactcaca atggtcggattccgtctctg-3’，

Staple 3:5’-tctcaacttcaactcgtattctca actcgtat-3’，

Scaffold strand:

5’-cagggctgggcatagaagtcagggcagagacgagttgagaatacgagttgagaatacgagttgagaatccgaccattgtgcgctatcttcatctta-3’；

按以下配方配制10×TA/Mg溶液：2.42g tris、1.34g四水乙酸镁、40ml超纯水，用醋酸调节其pH为7.4后用超纯水定容至50ml；

S2，将S1中四条DNA链各取1μL加入10μL的S1中配制的10×TA/Mg溶液中，然后加入86μL超纯水，得混合液；

S3，将S2中的混合液进行反应，反应条件为：85℃-20℃以1℃的梯度下降，每个温度梯度保持2min，4℃保存，得DNA纳米带。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

DNA折纸结构通过抑制细胞色素C过氧化物酶活性来抑制细胞色素C所启动的caspase级联反应，从而达到抗细胞凋亡的目的，提供了一种方便易行、稳定高效、准确可控的抑制细胞凋亡的药物。

附图说明

图1为本发明DNR抑制细胞色素C过氧化物酶活性的紫外吸光度曲线图；

图2为本发明DNR对细胞色素C蛋白结构影响的圆二色光谱图；

图3为本发明DNR的结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图1-3对本发明的几个具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制，实施例中涉及的试剂均能通过公共渠道获得。

实施例1

一种DNA纳米带(以下称为DNR)在抗细胞凋亡上的应用，并且DNA纳米带是由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4的四条DNA链制备而成的。该DNA纳米带是由DNA折纸技术合成的。

上述DNR制备步骤如下：

S1，准备浓度均为100μmol/L的以下四条DNA链(通过Invitrogen公司人工合成)，备用：

Staple 1:5’-cagccctgtaagatgaagatagcgtctatgcc-3’，如SEQ ID NO.1所示；

Staple 2:5’-ccctgactcaca atggtcggattccgtctctg-3’，如SEQ ID NO.2所示；

Staple 3:5’-tctcaacttcaactcgtattctca actcgtat-3’，如SEQ ID NO.3所示；

Scaffold strand:

5’-cagggctgggcatagaagtcagggcagagacgagttgagaatacgagttgagaatacgagttgagaatccgacc attgtgcgctatcttcatctta-3’，如SEQ ID NO.4所示；

按以下配方配制10×TA/Mg溶液：2.42g tris、1.34g四水乙酸镁、40ml超纯水，用醋酸调节其pH为7.4后用超纯水定容至50ml；

S2，将S1中四条DNA链各取1μL加入10μL的S1中配制的10×TA/Mg溶液中，然后加入86μL超纯水，得混合液；

S3，将S2中的混合液进行反应，反应条件为：85℃-20℃以1℃的梯度下降，每个温度梯度保持2min，4℃保存，得DNA纳米带，该反应可利用PCR仪完成。

需要说明的是：如图3为本发明DNR的平面结构示意图，本发明DNR由三个平行螺旋结构域的重复矩形单位组成，每个结构域都含有一段48bp的DNA螺旋。在每个矩形单位中，96个碱基长的DNA链作为支架链(scaffold strand)。在三条含32个碱基的短DNA链(staple1staple2staple3)的帮助下，以光栅填充模式进行。相邻的单元通过三个订书钉连接在一起形成一个长条带。

为验证本发明的应用效果，应用紫外动力学方法做了相关测试：

(1)配制20mmol/L的愈创木酚溶液。

(2)配制50mmol/L的过氧化氢溶液。

(3)配制10×TA/Mg溶液：加入2.42g tris，1.34g四水乙酸镁，加入40ml超纯水，用醋酸调节其pH为7.4后定容至50ml。

(4)在离心管中加入17.5μL浓度为400μmol/L的细胞色素C溶液，17.5μL浓度为2μmol/L的DNR，25μL步骤(3)配制的10×TA/Mg，190μL超纯水，总体积为250μL，在4℃下孵育一夜，得孵育DNR溶液。

(5)在另一只离心管中加入17.5μL浓度为400μmol/L的细胞色素C溶液，25μL步骤(3)配制的10×TA/Mg，207.5μL超纯水，总体积为250μL，在4℃下孵育一夜，得孵育细胞色素C蛋白溶液。

(6)在两个紫外微量比色皿中均加入50μL步骤(2)配制的过氧化氢溶液，然后其中一个紫外微量比色皿中加入步骤(4)的孵育DNR溶液，另一个紫外微量比色皿中加入步骤(5)的孵育细胞色素C蛋白溶液，再分别添加50μL步骤(1)配制的愈创木酚溶液，用紫外动力学方法在470nm的单波长下分别监测吸光度变化。结果如图1。

紫外吸收曲线的斜率大小反应了酶促反应速率的大小，从图1中可以看出细胞色素C中不加DNR的曲线在470nm的检测波长下和愈创木酚、过氧化氢的酶促反应过程中的紫外吸收和速率大于细胞色素C中加入DNR后细胞色素C的紫外吸收和速率，这说明本发明的DNR结构对于细胞色素C的过氧化物酶活性有明显的抑制作用。

实施例2

一种DNA纳米带(称为DNR)在抗细胞凋亡上的应用，并且所述DNA纳米带是由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所述的四条DNA链制备而成的。该DNA纳米带是由DNA折纸技术合成的。

上述DNR纳米带制备步骤如下：

S1，准备浓度均为100μmol/L的以下四条DNA链(通过Invitrogen公司人工合成)，备用：

Staple 1:5’-cagccctgtaagatgaagatagcgtctatgcc-3’，如SEQ ID NO.1所示；

Staple 2:5’-ccctgactcaca atggtcggattccgtctctg-3’，如SEQ ID NO.2所示；

Staple 3:5’-tctcaacttcaactcgtattctca actcgtat-3’，如SEQ ID NO.3所示；

Scaffold strand:

5’-cagggctgggcatagaagtcagggcagagacgagttgagaatacgagttgagaatacgagttgagaatccgacc attgtgcgctatcttcatctta-3’，如SEQ ID NO.4所示；

按以下配方配制10×TA/Mg溶液：2.42g tris、1.34g四水乙酸镁、40ml超纯水，用醋酸调节其pH为7.4后用超纯水定容至50ml；

S2，将S1中四条DNA链各取1μL加入10μL的S1中配制的10×TA/Mg溶液中，然后加入86μL超纯水，得混合液；

S3，将S2中的混合液进行反应，反应条件为：85℃-20℃以1℃的梯度下降，每个温度梯度保持2min，4℃保存，得DNA纳米带，该反应可利用PCR仪完成。

为验证本发明的应用效果，应用圆二色谱方法做了相关测试：

(1)配制1×TA/Mg溶液：0.242g tris、0.134g四水乙酸镁、40ml超纯水，用醋酸调节其pH为7.4后定容至50ml。

(2)用步骤(1)配制的1×TA/Mg溶液配制4μmol/L的细胞色素C

溶液350μL，4℃下孵育一夜，得样品1。

(3)配制350μL、终浓度为0.02μmol/L DNR和4μmol/L细胞色素C

的混合液，4℃下孵育一夜，得样品2。

(4)将样品1、样品2分别用圆二色光谱仪监测，设置波长为190nm-250nm，结果如图2。

从图2中可以看出从圆二色光谱所反映的结果而言，在加入DNR后的样品2中细胞色素C的二级蛋白结构并没有改变，证明我们所设计的DNR对生物体蛋白的结构没有破坏，不会损坏生物体细胞活性，说明DNR对生物体无副作用。

综上，DNR能有效降低过氧化物酶活性，且无副作用，将其应用于生物医药方面是十分具有优势的。

需要说明的是，本发明权利要求书中采用的步骤方法与上述实施例相同，为了防止赘述，本发明的描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<120> 一种DNA纳米带在抗细胞凋亡上的应用及其制备方法

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cagccctgta agatgaagat agcgtctatg cc 32

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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