本发明属于复合材料的制备领域，具体涉及一种稀土上转换复合纳米材料的制备方法及产品和应用。
背景技术：
光动力治疗(photodynamictherapy,pdt)是将光敏剂(photosensitizer,ps)输入人体，在一定时间后，以特定波长的光照射病变部位，通过一系列光化学和光生物学反应，在分子氧的参与下，产生活性氧自由基(ros)，氧化破坏组织和细胞中的各种生物大分子，使异常增生活跃的细胞发生不可逆的损伤，最终使细胞死亡，达到治疗目的一种技术。由于光动力治疗具有非侵入和时空响应的治疗特点被应用于肿瘤的临床治疗。
1976年kelly和snell应用一种血卟啉衍生物成功治疗膀胱癌，由此开创了光动力学疗法。近年来由于光敏物质、光激活装置以及导光系统的发展和进步，光动力学疗法已逐步成为肿瘤的基本治疗手段之一。现在临床上光动力治疗主要用于食道癌、肺癌及一些皮肤疾病的治疗。由于所用到的光源为可见光，对组织的穿透能力有限，对一些深部的肿瘤仍无法进行治疗。
随着纳米技术的快速发展，稀土上转换纳米材料(ucnps)是一种能连续吸收两到三份近红外光发射出一份能量更高波长更短的可见光。由于近红外光具有更好的组织穿透性，因此可以利用稀土上转换纳米材料作为纳米转换器来激活光敏剂，实现深部肿瘤的光动力治疗。
然而现有的设计主要是将光敏剂共价连接或负载到上转换纳米粒子表面，这种设计会因缺乏肿瘤部位选择性的聚集在日光的照射下会造成不可避免的副反应。患者因此需要躲避日光，这也加重了患者的负担。
最近，各种通过肿瘤微环境激活的光敏剂被开发出来。在光照激活的同时需附加其他外加的激活条件(ph,h2o2,谷胱甘肽，酶等)，这样大大的提高了pdt的安全性。然而，到目前为止仍没有基于稀土上转换纳米材料肿瘤内部刺激响应的pdt制剂。通过优化材料设计稳定、高效和安全的稀土上转换复合纳米材料，将可能成为新一代的高肿瘤选择性深度光动力治疗制剂。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种稀土上转换复合纳米材料的制备方法。
本发明所提供的技术方案为：
一种稀土上转换复合纳米材料的制备方法，包括如下步骤：
1)将三氟乙酸钠、三氟乙酸钇、三氟乙酸镱和三氟乙酸铒加入到十八烯和油酸的混合液中，进行除水除气处理得到反应液；
2)随后将反应液加入到温度为270～320℃的十八烯和油酸的混合液中反应，分离后得到稀土上转换纳米材料；
3)将稀土上转换纳米材料采用乳化溶剂挥发法，进行两亲性高分子光敏剂的组装修饰，得到稀土上转换复合纳米材料；所述两亲性高分子光敏剂包括两亲性高分子以及连接在两亲性高分子上的光敏剂分子。
上述技术方案中，稀土上转换纳米材料的粒径为10～50nm，经过步骤3)后得到的稀土上转换复合纳米材料的粒径为10～600nm。稀土上转换纳米材料与稀土上转换复合纳米材料所属的粒径范围，便于应用于肿瘤治疗。
稀土上转换复合纳米材料借助稀土上转换纳米材料、两亲性高分子光敏剂以及肿瘤组织固有的特征微环境，实现对深部肿瘤选择性的光动力治疗，进而高效杀伤肿瘤细胞。首先，稀土上转换复合纳米材料以高通透性和滞留效应(epr效应)可以实现肿瘤组织靶向。入胞后，刺激介导稀土上转换复合纳米材料解体为分散的稀土上转换纳米材料和两亲性高分子光敏剂，其中光敏剂分子之间的距离变大使因复合组装聚集产生的淬灭效应消失，在肿瘤内部微环境下激活光敏剂的光动力活性；其次使用组织穿透能力更强的近红外光的照射，通过上转换纳米材料的吸收发射出可见光激活光敏剂与周围的氧分子反应产生活性氧自由基，氧化细胞内的生物大分子，进而导致肿瘤细胞死亡。
作为优选，所述步骤1)中三氟乙酸钠、三氟乙酸钇、三氟乙酸镱和三氟乙酸铒的摩尔比为0.5:0.01～0.78:0.02～0.8:0.002～0.02。进一步优选为0.5:0.1～0.39:0.1～0.4:0.01～0.02。
作为优选，所述十八烯和油酸的混合液中十八烯与油酸的摩尔比为1:0.5～1.5。进一步优选为1:1。
作为优选，所述除水除气处理是指：在真空条件下，90～150℃下搅拌除水除气5～30分钟。
作为优选，所述步骤2)在反应后，加入经过除水除气处理的三氟乙酸钙溶液，维持温度继续进行反应，之后分离得到稀土上转换纳米材料；所述三氟乙酸钙溶液为溶有三氟乙酸钙的十八烯和油酸的混合液。加入三氟乙酸钙之后，稀土上转换纳米材料表面形成一层氟化钙成。氟化钙层能减少稀土上转换纳米材料表面的缺陷，有效提高发光强度。
作为优选，所述三氟乙酸钠与三氟乙酸钙的摩尔比为0.5:0.5～3。进一步优选为0.5:1.8-2.2。
作为优选，所述步骤2)反应液加入到十八烯和油酸的混合液中，以0.2～1ml/min的速度加入，进一步优选为注射器注射加入。
作为优选，所述步骤2)加入经过除水除气处理的三氟乙酸钙溶液，以0.2～1ml/min的速度加入，进一步优选为注射器注射加入。
作为优选，所述步骤2)中分离是指：将反应体系冷却到室温，采用不良溶剂沉淀。所述不良溶剂选自丙酮、乙醇、乙酸乙酯、甲醇、甲基吡咯烷酮、中链醇、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜中的一种或多种。
作为优选，所述步骤3)中乳化溶剂挥发法包括：将稀土上转换纳米材料分散在良溶剂中，室温下搅拌并加入到两亲性高分子光敏剂的水溶液中，超声，减压蒸发，得到稀土上转换复合纳米材料。
作为优选，所述良溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、正己烷、环己烷、二氧六环中的一种或多种。
作为优选，所述步骤3)中稀土上转换纳米材料与两亲性高分子光敏剂的质量投料比为1:1～20。通过调控二者之间的质量投料比，一方面，实现对刺激的灵敏响应，即于肿瘤部位实现刺激介导的分解组装；另一方面，控制稀土上转换复合纳米材料的大小和装载光敏剂的数量。
作为优选，所述步骤3)中两亲性高分子光敏剂通过物理吸附或化学合成。
作为优选，所述步骤3)中两亲性高分子光敏剂包括两亲性高分子、连接在两亲性高分子上的光敏剂分子以及连接在两亲性高分子上的刺激响应基团。利用功能性高分子光敏剂靶向传递和肿瘤微环境响应性解体产生光动力活性并以用上转换纳米材料近红外光激发过动力反应，联合使用多种策略，不仅增强对深部肿瘤的杀伤，同时也降低对正常组织的毒副作用。
作为优选，所述刺激响应基团包括肿瘤ph响应基团、肿瘤ros响应基团、肿瘤酶响应基团中的一种或几种。
作为优选，所述肿瘤ph响应基团选自咪唑、哌啶、原酸酯键、马来酸二甲酯键、肟键、缩醛/缩酮键、腙键、酰胺或酰腙键的一种或多种。
作为优选，所述肿瘤ros响应基团选自二硒键、琥珀酰亚胺-硫醚键、二硫键的一种或多种。
作为优选，所述肿瘤酶响应基团选自通过物理吸附或化学合成内含对基质金属蛋白酶、前列腺特异性抗原、组织蛋白酶b、分泌型磷脂酶a2、α-淀粉酶、赖氨酰基氧化酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、成纤维细胞活化蛋白敏感的基团。
作为优选，所述两亲性高分子选自泊洛沙姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、吐温、维生素e聚乙二醇琥珀酸酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸、司盘、磷脂、聚乙二醇、十二烷基硫酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、白蛋白、脂蛋白、蓖麻油聚氧乙烯醚、脂肪酸聚氧乙烯酯、脂肪酸聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚、多元醇酯、聚天冬氨酸苄酯中的一种或几种。
作为优选，所述光敏剂分子选自血卟啉衍生物、二血卟啉醚、5-氨基酮戊酸、间-四羟基苯基二氢卟酚、初卟啉锡、亚甲基兰、亚甲苯兰、苯卟啉衍生物、苯并卟啉衍生物单酸、酞青类、得克萨卟啉、二氢卟酚e6、金丝桃素、血啉甲醚中的一种或几种。
进一步优选，所述两亲性高分子光敏剂选自聚乙二醇-聚天冬氨酸苄酯-二氢卟酚e6、磷脂-聚乙二醇-5-氨基酮戊酸、磷脂-聚乙二醇-二氢卟酚e6、聚乙二醇-聚(天冬氨酸-咪唑)-二氢卟酚e6、聚乙二醇-聚(天冬氨酸-哌啶)-二氢卟酚e6、聚乙二醇-聚(天冬氨酸-咪唑)-5-氨基酮戊酸、聚乳酸-羟基乙酸-ss-聚乙二醇-二氢卟酚e6、聚乳酸-ss-聚乙二醇-二氢卟酚e6、聚乳酸-羟基乙酸-ss-聚乙二醇-5-氨基酮戊酸、聚乳酸-羟基乙酸-基质金属蛋白酶敏感肽-聚乙二醇-二氢卟酚e6、聚乳酸-羟基乙酸-基质金属蛋白酶敏感肽-聚乙二醇-5-氨基酮戊酸、聚乳酸-羟基乙酸-组织蛋白酶敏感肽-聚乙二醇-二氢卟酚e6。
本发明还提供一种如上述的制备方法制备得到的稀土上转换复合纳米材料。
本发明还提供一种如上述的稀土上转换复合纳米材料在制备光动力治疗制剂中的应用。
同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
(1)本发明中稀土上转换复合纳米材料所属的粒径范围，便于应用于肿瘤治疗。
(2)本发明中稀土上转换复合纳米材料借助稀土上转换纳米材料、两亲性高分子光敏剂以及肿瘤组织固有的特征微环境，实现对深部肿瘤选择性的光动力治疗，进而高效杀伤肿瘤细胞。
(3)本发明稀土上转换复合纳米材料使用功能性高分子对稀土上转换纳米材料进行组装。借助功能性高分子以及高通透性和滞留效应(epr效应)实现对肿瘤细胞的靶向，并用肿瘤内部微环境刺激组装解体激活光敏剂分子，进而高效杀伤肿瘤细胞，而且对正常组织有良好的生物安全性。
(4)本发明所涉及反应体系温和，条件可控，具有良好的临床转化可能性。
附图说明
图1为实施例1中的稀土上转换纳米材料的xrd图；
图2为实施例1中的稀土上转换纳米材料的tem照片；
图3为实施例1和3中的稀土上转换纳米材料的荧光光谱图及相应发光照片；
图4为实施例7中的ph敏感稀土上转换复合纳米材料在ph7.4和ph5.5的动态光散射粒度分布图；
图5为实施例7中ph敏感稀土上转换复合纳米材料在ph7.4和ph5.5的tem照片；
图6为应用例1中稀土上转换复合纳米材料在不同ph条件下活性氧自由基释放定量分析结果图；
图7为应用例2中不同浓度的上转换复合纳米材料在同ph条件下对肿瘤细胞的细胞活性定量分析结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和说明书附图对本发明作进一步说明。
实施例1：稀土上转换纳米材料的合成
将0.5mmol三氟乙酸钠、0.09mmol三氟乙酸钇、0.4mmol三氟乙酸镱和0.01mmol三氟乙酸铒加入到5mmol十八烯和5mmol油酸的混合液中，真空条件下在120℃下搅拌除水除气10分钟。
随后将反应液以0.3ml/min的速度注射到温度为310℃的5mmol十八烯和5mmol油酸的混合液中，反应1h。
随后将除水除气溶有2mmol三氟乙酸钙的5mmol十八烯和5mmol油酸的混合液以0.3ml/min分两次注入，反应30min，冷却到室温，用乙醇沉淀，离心得到稀土上转换纳米材料。
对得到的稀土上转换纳米材料进行x射线衍射分析，结果如附图1所示；对稀土上转换纳米材料用透射电镜进行形貌表征，结果如附图2所示。
实施例2：稀土上转换纳米材料的合成
将0.5mmol三氟乙酸钠、0.39mmol三氟乙酸钇、0.1mmol三氟乙酸镱和0.01mmol三氟乙酸铒加入到8mmol十八烯和8mmol油酸的混合液中，真空条件下在110℃下搅拌除水除气20分钟。
随后将反应液以1ml/min的速度注射到温度为300℃的8mmol十八烯和8mmol油酸的混合液中，反应1.5h。
随后将除水除气溶有2mmol三氟乙酸钙的8mmol十八烯和8mmol油酸的混合液以1ml/min分两次注入，反应20min，冷却到室温，用乙醇沉淀，离心得到稀土上转换纳米材料。
实施例3：稀土上转换纳米材料的合成
将0.5mmol三氟乙酸钠、0.09mmol三氟乙酸钇、0.4mmol三氟乙酸镱和0.01mmol三氟乙酸铒加入到5mmol十八烯和5mmol油酸的混合液中，真空条件下在120℃下搅拌除水除气10分钟。
随后将反应液以0.3ml/min的速度注射到温度为310℃的5mmol十八烯和5mmol油酸的混合液中，反应1h，冷却到室温，用乙醇沉淀，离心得到稀土上转换纳米材料。
对实施例1和3得到的稀土上转换纳米材料在980nm测定其荧光光谱。结果如图3所示，经过氟化钙包覆后稀土上转换纳米材料的发光强度显著提升。
实施例4：稀土上转换复合纳米材料的合成
将5mg稀土上转换纳米材料(由实施例1制得)分散在氯仿中，滴入20mg聚乙二醇-聚天冬氨酸苄酯-二氢卟酚e6的水溶液中，探头超声(5分钟，150w)形成均匀乳液，减压蒸发除去有机溶剂，即得稀土上转换复合纳米材料。
实施例5：稀土上转换复合纳米材料的合成
将5mg稀土上转换纳米材料(由实施例1制得)分散在氯仿中，滴入20mg磷脂-聚乙二醇-5-氨基酮戊酸的水溶液中，探头超声(5分钟，150w)形成均匀乳液，减压蒸发除去有机溶剂，即得稀土上转换复合纳米材料。
实施例6：稀土上转换复合纳米材料的合成
将5mg稀土上转换纳米材料(由实施例3制得)分散在氯仿中，滴入20mg磷脂-聚乙二醇-二氢卟酚e6的水溶液中，探头超声(5分钟，150w)形成均匀乳液，减压蒸发除去有机溶剂，即得稀土上转换复合纳米材料。
实施例7：ph敏感稀土上转换复合纳米材料的合成
5mg稀土上转换纳米材料(由实施例1制得)分散在氯仿中0.5ml，滴入5mg泊洛沙姆、10mg聚乙二醇-聚(天冬氨酸-咪唑)-二氢卟酚e6的水溶液10ml，探头超声(5分钟，150w)形成均匀乳液，减压蒸发除去有机溶剂，即得肿瘤ph敏感的稀土上转换复合纳米材料。
利用动态光散射分析得到的ph敏感稀土上转换复合纳米材料在ph7.4和ph5.5测定其水动力直径，结果如附图4所示。使用透射电镜对得到的ph敏感稀土上转换复合纳米材料在ph7.4和ph5.5进行形貌表征，透射电镜结果如附图5所示。结果显示，该种稀土上转换复合纳米材料有良好的ph响应性。
实施例8：ph敏感稀土上转换复合纳米材料的合成
5mg稀土上转换纳米材料(由实施例1制得)分散在氯仿中0.5ml，滴入5mg泊洛沙姆、10mg聚乙二醇-聚(天冬氨酸-哌啶)-二氢卟酚e6的水溶液10ml，探头超声(5分钟，150w)形成均匀乳液，减压蒸发除去有机溶剂，即得肿瘤ph敏感的稀土上转换复合纳米材料。
实施例9：ph敏感稀土上转换复合纳米材料的合成
5mg稀土上转换纳米材料(由实施例2制得)分散在氯仿中0.5ml，滴入5mg泊洛沙姆、10mg聚乙二醇-聚(天冬氨酸-咪唑)-5-氨基酮戊酸的水溶液10ml，探头超声(5分钟，150w)形成均匀乳液，减压蒸发除去有机溶剂，即得肿瘤ph敏感的稀土上转换复合纳米材料。
实施例10：ros敏感稀土上转换复合纳米材料的合成
5mg稀土上转换纳米材料(由实施例1制得)分散在氯仿中，滴入20mg聚乳酸-羟基乙酸-ss-聚乙二醇-二氢卟酚e6的水溶液，探头超声(5分钟，150w)形成均匀乳液，减压蒸发除去有机溶剂，即得肿瘤ros敏感的稀土上转换复合纳米材料。
实施例11：ros敏感稀土上转换复合纳米材料的合成
5mg稀土上转换纳米材料(由实施例1制得)分散在氯仿中，滴入20mg聚乳酸-ss-聚乙二醇-二氢卟酚e6的水溶液，探头超声(5分钟，150w)形成均匀乳液，减压蒸发除去有机溶剂，即得肿瘤ros敏感的稀土上转换复合纳米材料。
实施例12：ros敏感稀土上转换复合纳米材料的合成
5mg稀土上转换纳米材料(由实施例1制得)分散在氯仿中，滴入20mg聚乳酸-羟基乙酸-ss-聚乙二醇-5-氨基酮戊酸的水溶液，探头超声(5分钟，150w)形成均匀乳液，减压蒸发除去有机溶剂，即得肿瘤ros敏感的稀土上转换复合纳米材料。
实施例13：酶敏感稀土上转换复合纳米材料的合成
5mg稀土上转换纳米材料(由实施例1制得)分散在氯仿中，滴入20mg聚乳酸-羟基乙酸-基质金属蛋白酶敏感肽-聚乙二醇-二氢卟酚e6的水溶液，探头超声(5分钟，150w)形成均匀乳液，减压蒸发除去有机溶剂，即得肿瘤酶敏感的稀土上转换复合纳米材料。
实施例14：酶敏感稀土上转换复合纳米材料的合成
5mg稀土上转换纳米材料(由实施例1制得)分散在氯仿中，滴入聚乳酸-羟基乙酸-基质金属蛋白酶敏感肽-聚乙二醇-5-氨基酮戊酸的水溶液，探头超声(5分钟，150w)形成均匀乳液，减压蒸发除去有机溶剂，即得肿瘤酶敏感的稀土上转换复合纳米材料。
实施例15：酶敏感稀土上转换复合纳米材料的合成
5mg稀土上转换纳米材料(由实施例2制得)分散在氯仿中，滴入聚乳酸-羟基乙酸-组织蛋白酶敏感肽-聚乙二醇-二氢卟酚e6的水溶液，探头超声(5分钟，150w)形成均匀乳液，减压蒸发除去有机溶剂，即得肿瘤酶敏感的稀土上转换复合纳米材料。
应用例1：体外ph响应活性氧自由基释放
1、材料：稀土上转换复合纳米材料(由实施例7制得)、1,3-二苯基异苯并呋喃(dpbf)、乙腈、双蒸水。
2、方法：dpbf能与活性氧自由基发生不可逆的反应，导致其吸光度的降低，因此我们可将其作为指示剂来检测活性氧自由基的释放。
将dpbf的乙腈溶液(20μl,8mm)，滴入含稀土上转换复合纳米材料不同ph值的水溶液中(2mg/ml,2ml)。使用980nm激光器照射(2.5w/cm2)，使用紫外可见分光光度计测定不同时间点410nm处的吸光度。
ph响应活性氧自由基释放定量分析结果如图6所示，在ph7.4条件下，dpbf的吸光度并没有显著下降，而在ph5.5条件下随着光照时间的延长，dpbf吸光度显著下降，表明稀土上转换复合纳米材料具有良好的ph响应释放性活性氧自由基的能力。
应用例2：ph响应肿瘤细胞杀伤
1、材料：肿瘤细胞株(肺癌a549)、稀土上转换复合纳米材料(由实施例7制得)、cck-8试剂盒。
2、方法：取对数生长期的人源肿瘤细胞，用新鲜的培养液将细胞接种于96孔扳内(104每孔)，于37℃，5％co2的培养箱内培养。待细胞贴壁培养12-24h后换成含有稀土上转换复合纳米材料(由实施例7制得)的不同ph值的新鲜培养液。细胞继续培养4h后，吸出培养液并用pbs洗涤换上新鲜细胞培养液。用980nm(2.5w/cm2)激光起照射5min后，继续于37℃，5％co2的培养箱内培养24h。然后向96孔扳内加入cck-8溶液(20μl/孔)，于37℃下共同孵育1～4h，测定其450nm处光密度od值。
数据处理，利用酶标仪相应软件进行数据处理，计算每一种样品3～5个孔od值的平均值，利用平均值按如下公式计算细胞存活率(细胞存活率％)。
细胞存活率％＝样品组od值的平均值/空白对照组od值的平均值×100％
结果如图7所示，在ph5.5的条件下，肿瘤细胞活性显著低于在ph7.4的条件下，证明稀土上转换复合纳米材料具有ph响应肿瘤细胞杀伤作用。
以上所述实施例对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改，补充和等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。