JAK2抑制剂在预防和治疗印戒细胞癌中的应用的制作方法

本发明涉及医药技术领域，具体涉及jak2抑制剂在预防和治疗印戒细胞癌中的应用。

背景技术：

印戒细胞癌的发病年龄较传统腺癌明显提前，而且结直肠印戒细胞癌相对于传统腺癌来说，预后要差的多。与传统腺癌相比，印戒细胞癌发现时的病期要晚的多，约60％的印戒细胞癌患者在确诊时已经处于iii期或iv期，i-ii期的印戒细胞癌比率仅有5％左右。因多数印戒细胞癌患者在初诊时已是iii-iv期，且印戒细胞癌多为局部弥漫浸润性生长，因此手术的r0切除率仅为53％，远远低于传统腺癌(80％)。以氟尿嘧啶及奥沙利铂为基础的化疗是高危结直肠癌患者的标准辅助治疗，而新辅助放化疗已成为t3-4/n+直肠癌患者的标准治疗，但根据临床经验，印戒细胞癌对放化疗的敏感性明显低于传统腺癌。同时，印戒细胞癌多伴有腹膜转移，腹膜转移相比肝肺转移来说预后常常更差。局限性的肝肺转移还有根治性切除的机会，而腹膜转移常常意味着丧失了根治性手术的可能。此外，腹膜转移的病人对化疗的敏感性也要差得多，这都为结直肠印戒细胞癌的治疗增加了难度。

目前尚没有专门针对印戒细胞癌的治疗方法，因此印戒细胞癌的治疗需要进一步研究。

技术实现要素：

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种可以有效、价廉、毒性较小的能够治疗印戒细胞癌的药物，提高印戒细胞癌患者的预后，具有很高的临床应用价值。

本发明是基于以下发现完成的：

针对印戒细胞癌，目前尚没有专门的有效的治疗方法。以结直肠印戒细胞癌为例，临床上，通常根据医师的临床经验及传统结直肠癌的指南和规范进行处理。对于局限性结肠癌，根治性手术是其最主要的治疗方式，对伴有淋巴结转移、淋巴结数量不足12枚、伴有脉管瘤栓及低分化的高危结肠癌患者通常进行以氟尿嘧啶和奥沙利铂为主的辅助化疗。对于转移性结直肠癌，若肝、肺转移病灶可达到r0切除，则可进行原发灶联合转移灶的根治性手术切除后进行全身化疗，若肝、肺转移病灶无法切除，或为广泛的腹腔转移，应以全身治疗为主。

对于结直肠印戒细胞癌的全身治疗，化疗是主要的治疗方式。对于iii期肠癌来讲，根治性切除后进行辅助化疗是标准的治疗方案，而对于具有高危及微卫星稳定(mss)的肠癌患者同样建议进行辅助化疗。约有20-30％的肠癌患者在初治时即为不可切除的转移性结直肠癌(mcrc)，而另有40-50％的患者在根治性手术后会出现复发和转移，这些患者的主要治疗方案均为以化疗和靶向治疗为主的全身治疗。化疗药物具有很强的毒性，患者多会出现骨髓抑制、消化道反应、肝肾损害、神经毒性等，结直肠癌患者在进行化疗过程中，很多患者因出现各种毒性反应，而无法完成化疗。且化疗药物有最高耐受剂量，因此不能持续长时间应用，否则患者可能因严重的毒性反应而危害生命。对于结直肠印戒细胞癌的局部治疗方法通常是采用放疗。但是从临床结果来看，印戒细胞癌对于放疗的敏感性较差。

本发明的发明人在研究过程中发现：

印戒细胞癌时一种含有大量粘液的癌细胞，而且印戒细胞的恶性程度均很高，而且分化程度都比较低。jak2活性对印戒细胞的分化和生长起着重要的调控作用。jak2是酪氨酸激酶中的janus家族的一员，参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程。细胞因子诱导受体的聚合反应,从而使jaks相互靠近并引起交互的磷酸化而致活化,活化的jaks能磷酸化细胞因子受体胞浆结构域中的酪氨酸残基,而募集含sh2结构域的信号分子，如信号转导和转录活化因子(signaltransducerandactivatoroftranscription,stat)等。stat蛋白通过其sh2结构域与酪氨酸-磷酸化细胞因子受体结合,并通过jaks使其特殊的c端酪氨酸残基磷酸化。磷酸化的stats从受体上解离，并借其sh2结构域形成同源或异二聚体，随后进入核内,在核内它们与靶基因的启动子中特异的dna序列结合，并因而调节转录。许多细胞因子和生长因子通过jak-stat信号通路来传导信号。所以，通过抑制jak2活性对于预防或治疗印戒细胞癌将会是一个很好的策略来。

为此，根据本发明的第一方面，本发明提供了一种jak2抑制剂或其盐或其衍生物在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗印戒细胞癌。根据本发明，jak2抑制剂可以显著抑制结直肠印戒细胞癌类器官的生长，并可抑制体内结直肠印戒细胞癌成瘤的增殖，可以作用治疗印戒细胞癌的有效的药物。

另外，根据本发明上述实施例的jak2抑制剂或其盐或其衍生物在制备药物中的用途还可以具有如下附加的技术特征：

在本发明的一些实施例中，所述jak2抑制剂选自nvp-bsk8052hcl、at9283、azd1480、ly2784544、az960、cyt387、tg101209、tc101348、cep-33779、pacritinib中的至少一种。

在本发明的一些实施例中，所述印戒细胞癌为结直肠印戒细胞癌。

在本发明的一些实施例中，所述jak2抑制剂或其盐或其衍生物的使用浓度为0.1μm以上，优选为10μm以上。

在本发明的一些实施例中，所述jak2抑制剂的盐选自以下中的至少一种：氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、甲酸盐、乙酸盐、抗坏血酸盐、苯甲酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、氨基甲酸盐、甲酸盐、葡萄糖酸盐、乳酸盐、甲基溴化物、甲基硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、二磷酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐以及三氟乙酸盐。例如可以为nvp-bsk8052hcl、at9283、azd1480、ly2784544、az960、cyt387、tg101209、tc101348、cep-33779或者pacritinib的氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、甲酸盐、乙酸盐、抗坏血酸盐、苯甲酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、氨基甲酸盐、甲酸盐、葡萄糖酸盐、乳酸盐、甲基溴化物、甲基硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、二磷酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐以及三氟乙酸盐等等。

根据本发明的第二方面，本发明提供了一种用于预防或治疗印戒细胞癌的药物组合物，所述药物组合物包括jak2抑制剂或其盐或者衍生物。在用于预防或者治疗印戒细胞癌时可以根据需要，单独服用某种jak2抑制剂或者将不同的jak2抑制剂联合使用。

另外，根据本发明上述实施例的用于预防或治疗印戒细胞癌的药物组合物还可以进一步附加如下技术特征：

在本发明的一些实施例中，所述jak2抑制剂选自nvp-bsk8052hcl、at9283、azd1480、ly2784544、az960、cyt387、tg101209、tc101348、cep-33779、pacritinib中的至少一种。

在本发明的一些实施例中，所述印戒细胞癌为结直肠印戒细胞癌。

在本发明的一些实施例中，所述jak2抑制剂的盐选自以下中的至少一种：氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、甲酸盐、乙酸盐、抗坏血酸盐、苯甲酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、氨基甲酸盐、甲酸盐、葡萄糖酸盐、乳酸盐、甲基溴化物、甲基硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、二磷酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐以及三氟乙酸盐。

根据本发明的第三方面，本发明提出了一种药物，所述药物用于预防或治疗印戒细胞癌，所述药物包括jak2抑制剂或其盐或其衍生物。

根据本发明的实施例，所述药物可以进一步附加如下技术特征：

在本发明的一些实施例中，所述jak2抑制剂选自nvp-bsk8052hcl、at9283、azd1480、ly2784544、az960、cyt387、tg101209、tc101348、cep-33779、pacritinib中的至少一种。

在本发明的一些实施例中，所述印戒细胞癌为结直肠印戒细胞癌。

在本发明的一些实施例中，所述jak2抑制剂的盐选自以下中的至少一种：氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、甲酸盐、乙酸盐、抗坏血酸盐、苯甲酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、氨基甲酸盐、甲酸盐、葡萄糖酸盐、乳酸盐、甲基溴化物、甲基硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、二磷酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐以及三氟乙酸盐。

在本发明的一些实施例中，所述药物进一步包含药学上可接受的赋形剂，所述赋形剂为选自粘结剂、填料、涂膜聚合物、增塑剂、助流剂、崩解剂和润滑剂的至少一种。由此，本发明用于预防或治疗印戒细胞癌的药物组合物能够被制备成任何便于给药的药物剂型。

在本发明的一些实施例中，所述药物的剂型为注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、膏剂、凝胶剂。由此，本发明用于预防或治疗印戒细胞癌的药物组合物能够被制备成任何便于给药的药物剂型。

根据本发明的第四方面，本发明提出了一种用于类器官的培养基，所述培养基中包括jak2抑制剂或其盐或其衍生物，所述jak2抑制剂或其盐或其衍生物用来抑制印戒细胞癌的生长。

根据本发明的第五方面，本发明提出了一种药盒，所述药盒用于预防或治疗印戒细胞癌，所述药盒包括jak2抑制剂或其盐或其衍生物。本发明中药盒，也可以根据需要表示成试剂盒或者试剂套装，所述药盒或者试剂盒或者试剂套装中包括烟酰胺或其盐或其衍生物，所述药盒中可以制备成一个个独立的包装单元。

另外，根据本发明上述实施例的药盒还可以进一步附加如下技术特征：

在本发明的一些实施例中，所述jak2抑制剂选自nvp-bsk8052hcl、at9283、azd1480、ly2784544、az960、cyt387、tg101209、tc101348、cep-33779、pacritinib中的至少一种。

在本发明的一些实施例中，所述印戒细胞癌为结直肠印戒细胞癌。

在本发明的一些实施例中，所述jak2抑制剂的盐选自以下中的至少一种：氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、甲酸盐、乙酸盐、抗坏血酸盐、苯甲酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、氨基甲酸盐、甲酸盐、葡萄糖酸盐、乳酸盐、甲基溴化物、甲基硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、二磷酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐以及三氟乙酸盐。

在本发明的一些实施例中，所述jak2抑制剂或其盐或其衍生物的浓度为0.1μm以上，优选为10μm以上。

根据本发明的第六方面，本发明提供了一种治疗或者预防印戒细胞癌的方法，所述方法包括对生物样本提供前面实施例所述的药物。由此，可以显著抑制抑制印戒细胞癌的生长，从而可以起到预防或者治疗印戒细胞癌的作用。

本发明所取得的有益效果为：本发明通过体外结直肠印戒细胞癌类器官实验及动物实验证明，jak2抑制剂及其盐可以明显抑制结直肠印戒细胞癌类器官的生长，抑制印戒细胞在裸鼠体内成瘤的生长，从而可以将jak2抑制剂及其盐或者衍生物作为药物用于治疗印戒细胞癌，尤其是结直肠印戒细胞癌。

附图说明

图1为根据本发明的一个实施例提供的at9283对于结直肠印戒细胞癌类器官生长的影响图。

图2为根据本发明的一个实施例提供的at9283作用于结直肠印戒细胞癌类器官的ic50曲线图。

图3为根据本发明的一个实施例提供的tg101348对于结直肠印戒细胞癌类器官生长的影响图。

图4为根据本发明的一个实施例提供的tg101348作用于结直肠印戒细胞癌类器官的ic50曲线图。

图5为根据本发明的一个实施例提供的pacritinib对于结直肠印戒细胞癌类器官生长的影响图。

图6为根据本发明的一个实施例提供的pacritinib作用于结直肠印戒细胞癌类器官的ic50曲线图。

图7为根据本发明的一个实施例提供的at9283对裸鼠皮下接瘤后裸鼠肿瘤体积的变化图。

图8为根据本发明的一个实施例提供的at9283对裸鼠皮下接瘤后裸鼠体重的变化图。

图9为根据本发明的一个实施例提供的10种jak2通路抑制剂对于结直肠印戒细胞生长的抑制作用图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

在本发明中，印戒细胞癌，根据2010年版who的组织学分类标准，印戒细胞癌被定义为组织内50％以上的肿瘤细胞由胞浆中富含黏蛋白的腺癌细胞构成，黏蛋白充满细胞质并使细胞核移移位，在显微镜下呈典型印戒细胞样结构。所述印戒细胞癌包括结直肠印戒细胞癌、卵巢印戒细胞癌、胃印戒细胞癌、腹膜印戒细胞癌、胆囊印戒细胞癌、膀胱印戒细胞癌、肝脏印戒细胞癌、肺印戒细胞癌。

其中，需要说明的是，术语“预防”指使得获病或障碍的风险减少(即：使疾病的至少一种临床症状在主体内停止发展，该主体可能面临或预先倾向面临这种疾病，但还没有经历或表现出疾病的症状)。

jak家族是一类非受体型酪氨酸激酶，包括jak1、jak2、jak3和tyk2。jak2由1132个氨基酸组成，相对分子质量为13493，定位于9号染色体断臂2区4带。jak2-stat信号转到通路参与多种生理病理调控：如参与免疫系统的调控、促进细胞生长、抗凋亡及影响细胞周期等；并与肿瘤的发生发展有着密切的关系，对造血细胞的生长发育也有着重要的调控作用。

本发明利用结直肠印戒细胞癌类器官培养体系，通过体外结直肠印戒细胞癌类器官实验及动物实验证明，jak2抑制剂可以明显抑制结直肠印戒细胞癌类器官的生长，抑制印戒细胞在裸鼠体内成瘤的生长。由于所有印戒细胞的恶性程度均很高，而且分化程度都比较低，所以jak2抑制剂可以用来预防或治疗印戒细胞癌。

在本发明中，所述jak2抑制剂指的是任何天然的或者合成的，并对jak2活性有明显抑制的化合物。包括但不限于nvp-bsk8052hcl、at9283、azd1480、ly2784544、az960、cyt387、tg101209、tc101348、cep-33779、pacritinib等。

本发明中，所用到的人源的人源的结直肠印戒细胞癌细胞系csrcc01，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：c201722。关于该细胞系的生物学特征等均记载在申请号为201710290004.1，公开号为cn107058227a中。该人结直肠印戒细胞癌细胞系源于类器官培养体系，能够最大程度的还原体内肿瘤生长状态，性状稳定，可稳定多次传代，具有高度成瘤性，可以成功制备结直肠印戒细胞癌动物模型，所制的动物模型可以用于基础研究及药物筛选。

本发明中所述类器官作本领域技术人员通常理解，是指在结构和功能上都类似来源器官或组织的模拟物，其为成熟器官来源的三维上皮结构。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

其中，实施例中所用到的试剂及其厂家见表1中：

表1试剂及其厂家

实施例1

实施例1中对三种jak2抑制剂，即at9283、tg101348、pacritinib，对于结直肠印戒细胞癌类器官的作用进行体外存活实验。实验过程如下：

其中所用到的类器官基础培养基为：advanceddmem/f1培养基、1×normocin(invivogen)、1×gentamicin/amphotericinb(gibco)、10mmhepes、10mmglutamax、rspondin重组蛋白，noggin重组蛋白，1×n2supplement，1×b27serum-freesupplement，1mmn-乙酰半胱氨酸，50ng/ml表皮细胞生长因子。

实验过程如下：吹散基质胶，用预冷的pbs清洗、机械吹散类器官，将类器官细胞以1×10⁴/15μl基质胶的密度(即每15μl基质胶中含有类器官细胞的个数为1×10⁴个)接种于48孔板中，每孔加入300μl培养基培养3天，然后更换加入了不同浓度的at9283(分别为0、0.0048μm、0.024μm、0.12μm、0.6μm、3μm)、tg101348(分别为0、0.0048μm、0.024μm、0.12μm、0.6μm、3μm)及pacritinib(分别为0、0.1μm、0.3μm、1μm、3μm、10μm)的培养基，每个浓度设置3个重复，加药培养5天后拍照，应用cck8法测量细胞活性，并应用prism6.0软件拟合曲线，计算ic50。

加药培养5天后的照片可见图1、图3及图5，图1为at9283对于结直肠印戒细胞癌类器官生长的影响图，图3为tg101348对于结直肠印戒细胞癌类器官生长的影响图，图5为pacritinib对于结直肠印戒细胞癌类器官生长的影响图。从图1、图3以及图5可以看出，随着at9283、tg101348、pacritinib浓度的增高，结直肠印戒细胞癌的生长受到明显抑制。各药物抑制作用的拟合曲线分别如图2、图4以及图6所示，计算出at9283的ic50为0.068μm，tg101348的ic50为0.507μm，pacritinib的ic50为1.655μm。可见无论是at9283、tg101348、还是pacritinib，均表现出良好的结直肠印戒细胞癌的抑制作用。

实施例2

以药物at9283为例，本实施例进一步验证了药物at9283在动物体内的实验效果。包括如下步骤：

吹散基质胶，用预冷的pbs清洗、机械吹散类器官，以5×10⁶/50μl基质胶+50μlpbs/只的密度接种于12只6周雄性balb/c裸小鼠的皮下(即每只裸小鼠接种50μl基质胶以及50μlpbs，其中50μl基质胶中含有类器官细胞的个数为5×10⁶个)，3周后可见肿瘤生长。然后随机将裸小鼠分成2组，每组6只，待肿瘤生长至100mm³(接种后第24天)时，开始注射药物。

其中对照组注射腹腔注射生理盐水200μl/只，实验组以20mg/kg腹腔注射at9283200μl/只，连续注射5天，然后休息2天(即连续注射5天后停止注射2天)，共打药3个周期。隔天测量裸小鼠的肿瘤大小及体重变化。

观察42天裸小鼠的肿瘤大小以及体重变化情况，如图7和图8所示，其中对照组肿瘤大小为731.7±258.8mm³，实验组肿瘤大小为313.609±60.991mm³，t检验后有统计学意义，p＝0.0016(mean±sd，图7)。同时，对照组裸小鼠体重为21.917±0.842g，相比初始体重降低3.7％，实验组裸小鼠体重为21.750±0.554g，相比初始体重增加2％；打药5天时，实验组裸小鼠体重降至最低，为20.117±0.979g，相比初始体重降低5.6％(图8)，说明at9283的安全性良好。

实施例3

为了进一步验证jak2抑制剂对印戒细胞癌类器官生长的作用，我们扩大了jak2抑制剂的范围，另找了其余的7种jak2抑制剂，并以at9283、tg101348、pacritinib作为阳性对照，体外验证了这10种jak2抑制剂对印戒细胞癌类器官的抑制作用。所用药物的具体名称及作用靶点见下表2。

表210种jak2抑制剂及其作用靶点

实验过程如下：

吸去培养于24孔板中的结直肠印戒细胞癌类器官基础培养基，应用4℃预冷的pbs吹散基质胶，置于15ml离心管中，每个离心管中最多收集4孔的类器官，4℃离心5min，弃去上清，利用预冷的pbs，利用同样的方法应用预冷的pbs洗3次，反复吹打结直肠癌类器官直至镜下观察为单细胞，用培养基冲洗印戒细胞，然后对细胞进行计数，以1×10³/100μl的密度(即每100μl的培养基中含有印戒细胞的个数为1×10³个)接种于96孔板中培养3天，然后更换分别加入了10种jak2抑制剂的培养基，培养基中每种药物的浓度分别为10μm，每种药物作用3天后应用cck法测量印戒细胞的活性，每种药物设置3个复孔。

实验结果如下：cck测定细胞活性结果显示，所有10种jak2抑制剂对结直肠印戒细胞增殖的抑制率均超过50％，提示我们jak2是治疗结直肠印戒细胞癌的潜在靶点。通过抑制jak2可以用来预防或者治疗结直肠印戒细胞癌。jak2抑制剂可以用来作为预防或者治疗结直肠印戒细胞癌的药物。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。