本发明属于天然物质提取领域，具体涉及一种具有降糖活性的蛹虫草提取物及其制备方法和应用。
背景技术：
蛹虫草学名为cordycepsmilitaris，蛹虫草，又叫北冬虫夏草，北虫草，简称蛹草，为子囊菌门，肉座目，麦角菌科、虫草属的模式种。经研究证明，人工培养的蛹虫草医药临床效果，与天然的冬虫夏草类似，同样能够调节全身功能、提高免疫能力、增强巨噬细胞的吞噬功能、促进抗体的形成，主要有保肺益肾养肝、止咳平喘祛痰、润肤防皱抗衰老、抗菌抗炎、镇静、扩张血管、降低血压、抗疲劳、耐缺氧等作用。
虽然有关人工虫草及其多糖提取物的降血糖活性报道已有不少，对多种糖尿病模型动物均有显著作用。但是目前关于蛹虫草提取物对肥胖型患者降糖效果还未见报道。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种具有降糖活性的蛹虫草提取物及其制备方法，蛹虫草提取物具有显著的改善葡萄糖耐受性的生理活性。
本发明的目的还在于提供一种具有降糖活性的蛹虫草提取物在功能食品或制备降糖药物中的应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种具有降糖活性的蛹虫草提取物的制备方法，包括以下步骤：
1)将蛹虫草粉与水混合，在70～90℃条件下提取50～100min，固液分离，得到液相；
2)将所述液相旋转蒸发至原体积的10％～25％，得到蛹虫草提取物。
优选的，所述蛹虫草粉的质量与水的体积比为1kg：8～12l。
优选的，所述蛹虫草粉的粒径为80～100目。
优选的，所述提取的温度为80℃。
优选的，所述提取的时间优选为60～90min。
优选的，所述固液分离得到的残渣重复提取，固液分离，合并液相；所述重复的次数为2～3次。
优选的，所述蒸发的温度优选为45～55℃。
优选的，所述旋转蒸发后进行真空冷冻干燥；所述真空冷冻温度为-60℃至-30℃，所述真空冷冻干燥的时间为4～24h。
本发明提供了所述蛹虫草提取物，虫草素的质量浓度为0.5～5％，虫草多糖的质量浓度为10～40％。
本发明提供了所述的蛹虫草提取物在制备降糖药物中的应用。
本发明提供了所述的蛹虫草提取物在保健食品中的应用。
本发明提供了一种具有降糖活性的蛹虫草提取物的制备方法，将蛹虫草粉与水混合，在70～90℃条件下提取50～100min，固液分离，得到液相；将所述液相旋转蒸发至原体积的10～25％，得到蛹虫草提取物。本发明采用水浸提法提取蛹虫草中活性成分虫草素和虫草多糖，所述制备方法，步骤简洁，操作方面，提取获得的活性成分含量高，且安全无毒副作用。
本发明提供的所述蛹虫草提取物含有虫草素和虫草多糖活性成分。动物实验证明蛹虫草提取物能够降低血清中葡萄糖(glucose)、谷丙转氨酶(alt)的含量水平，减轻由高脂膳食诱发的胰岛素抵抗，提高肥胖小鼠的葡萄糖耐受性。
附图说明
图1为蛹虫草提取物对小鼠体重的影响；
图2为蛹虫草提取物对小鼠口服葡萄糖耐量(ogtt)影响；
图3为蛹虫草提取物对小鼠腹腔注射胰岛素耐受实验(ipitt)影响。
具体实施方式
本发明提供了一种具有降糖活性的蛹虫草提取物的制备方法，包括以下步骤：
1)将蛹虫草粉与水混合，在70～90℃条件下提取50～100min，固液分离，得到液相；
2)将所述液相经旋转蒸发至原体积的10～25％，得到蛹虫草提取物。
本发明先将蛹虫草粉与水混合，在70～90℃条件下提取50～100min，固液分离，得到液相。
在本发明中，所述蛹虫草粉的粒径优选为80～100目，更优选为90目。所述蛹虫草粉的制备方法优选将蛹虫草洗净，烘干，粉碎，过筛得到。所述烘干的温度优选为40～90℃，更优选为60℃。本发明对所述粉碎和过筛的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的粉碎和过筛方法即可。所述蛹虫草的种类和来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的蛹虫草的种类和来源即可。
在本发明中，所述蛹虫草粉的质量与水的体积比优选为1kg：8～12l，更优选为1kg：10l。所述水优选为去离子水。本发明对所述混合方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的混合方式即可。
在本发明中，所述提取的温度优选为80℃。所述提取的时间优选为60～90min。所述提取优选伴随搅拌。所述搅拌的速度优选为100～300rpm，更优选为150～250rpm，最优选为200rpm。所述固液分离得到的残渣优选重复提取，固液分离，合并液相；所述重复的次数为2～3次。
得到液相后，本发明将所述液相旋转蒸发至原体积的10～25％，得到蛹虫草提取物。
在本发明中，所述液相优选旋转蒸发至原体积的20％。本发明对所述蒸发的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的旋转蒸发的方案即可。
在本发明中，所述旋转蒸发后进行真空冷冻干燥；所述真空冷冻温度为-60℃至-30℃，所述真空冷冻干燥的时间优选为4～24h，更优选为12h。
本发明提供了所述蛹虫草提取物，虫草素的质量浓度为0.5～5％，虫草多糖的质量浓度为10～40％。
在本发明中，所述蛹虫草提取物中虫草素的检测方法优选采用hplc检测。所述hplc检测的参数如下：。agilentsb-c18色谱柱(25cm×φ4.6mm,5μ)，流动相：乙腈：甲醇：水体积比为5：3：92，流速：1.0ml/min，检测波长：260nm。虫草多糖的检测方法采用gb/t15672—1995。
本发明提供了所述的蛹虫草提取物在保健食品中的应用。
根据fda推荐动物与人之间药物剂量换算准则，人体推荐剂量为8～16mg/kg，其中虫草素为0.19～0.37mg/kg，虫草多糖为1.34～2.67mg/kg(一个体重70千克的人每天摄入蛹虫草提取物0.56g～1.12g，其中虫草素为12.99～25.98mg，虫草多糖为93.52～187.04mg)。
考虑到蛹虫草提取物的摄入量较大，推荐每天摄入两次，且在片剂或胶囊剂中蛹虫草提取物的质量百分比为50％以上。
本发明提供了所述的蛹虫草提取物在制备降糖药物中的应用。
在本发明中，所述药物的剂型包括颗粒剂、胶囊剂、粉针剂、片剂、口服液、丸剂或膏剂。所述药物还包括医药中可接受的常规辅料。本发明对所述药物的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的药物各剂型的常规制备方案即可。
动物实验显示蛹虫草提取物的有效剂量为100～200mg/kg，根据fda推荐动物与人之间药物剂量换算准则，人体推荐剂量为8～16mg/kg，其中虫草素为0.19～0.37mg/kg，虫草多糖为1.34～2.67mg/kg(一个体重70千克的人每天摄入蛹虫草提取物0.56g～1.12g，其中虫草素为12.99～25.98mg，虫草多糖为93.52～187.04mg)。
下面结合实施例对本发明提供的一种具有降糖活性的蛹虫草提取物及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
将蛹虫草烘干，粉碎，过80目筛，收集筛下部分，得到蛹虫草粉。将蛹虫草粉1kg与水10l混合，在70℃条件下提取100min，离心，收集上清液；将所述上清液在50℃条件下旋转蒸发至原体积的20％，并-60℃真空冷冻干燥24h，得到蛹虫草提取物。
实施例2
将蛹虫草烘干，粉碎，过90目筛，收集筛下部分，得到蛹虫草粉。将蛹虫草粉1kg与水12l混合，在80℃条件下提取90min，离心，收集上清液；将所述上清液在55℃条件下旋转蒸发至原体积的25％，并-40℃真空冷冻干燥4h，得到蛹虫草提取物。
实施例3
将蛹虫草烘干，粉碎，过100目筛，收集筛下部分，得到蛹虫草粉。将蛹虫草粉1kg与水8l混合，在90℃条件下提取70min，离心，收集上清液；将所述上清液在45℃条件下旋转蒸发至原体积的10％，并-30℃真空冷冻干燥10h，得到蛹虫草提取物。
实施例4
一.实验方法
1.动物实验设计
c57bl/6小鼠在清华大学动物中心内喂养，饲养环境为12h光暗交替，温度为23±3℃，相对湿度为50％。小鼠适应性喂养1周后，将其随机分为6组(n＝10)，组别设计分别为：正常对照组(nd)，饲养正常饲料；高脂对照组(hfd)、膳食低剂量蛹虫草多糖组(bug-l)、膳食中剂量蛹虫草多糖组(bug-m)，膳食高剂量蛹虫草多糖组(bug-h)，左旋肉碱对照组(l-car)饲养高脂饲料。低中高剂量的蛹虫草多糖提取物摄入量分别为50mg/kg，100mg/kg，200mg/kg，左旋肉碱摄入量为300mg/kg，灌胃14周，nd和hfd对照组灌胃清水。每7天称量体重一次，实验期间小鼠自由进食和饮水。实验结束前将小鼠禁食12h，称量体重，眼眶取血后将小鼠进行颈椎脱臼处死，取皮下及附睾周围脂肪，快速摘取心、肝、脾、肾、棕色脂肪，取部分白色脂肪、肝脏组织于福尔马林溶液中保存，其余组织置于-80℃冰箱中。血液样品2500g离心15min，取血清保存。
2.口服葡萄糖耐量实验(ogtt)与胰岛素耐受实验(itt)
在实验的第12周，小鼠禁食12h，通过口腔给小鼠灌胃葡萄糖(2g/kg)。分别在时间点0,30,60,90,120min时通过尾静脉取血，测定血糖水平。在实验的第13周，小鼠禁食4h，通过腹腔注射胰岛素(0.5u/kg)。分别在时间点0,30,60,90,120min时通过尾静脉取血，测定血糖水平。
3.血清生化指标测定
血清中的葡萄糖、甘油三酯(tg)、总胆固醇(tc)、高密度脂蛋白(hdl-c)、低密度脂蛋白(ldl-c)、谷草转氨酶(ast)和谷丙转氨酶(alt)的含量水平使用东芝全自动生化分析仪进行测定
4.统计分析
实验数据采用spss22.0统计软件进行方差分析与显著性分析，采用duncan多重比较进行组间差异分析(p<0.05)，数据表示为mean±sd。
二.实验结果
1.蛹虫草提取物对小鼠体重的影响
结果见表1。
表1蛹虫草多糖各浓度的处理组中小鼠的体重增量
在为期15周的实验过程中实验小鼠没有发生异常临床症状。经过14周的高脂饮食诱导后，和正常对照组(nd)相比，高脂+清水组(hfd)小鼠发生明显的肥胖，蛹虫草多糖各浓度的处理组中小鼠的体重增量与hfd组相比没有显著差异(图1，表1)。实验结果表明膳食蛹虫草多糖对小鼠体重的增长没有显著影响。
2.蛹虫草提取物对小鼠脏器及血清葡萄糖含量的影响
结果见表2。
表2蛹虫草多糖对小鼠血清生化指标的影响
通过对小鼠脏器重量和血清中脂质相关生化指标的测定发现，也与hfd组相比，膳食用蛹虫草多糖未能显著逆转因高脂饮食诱导产生的小鼠心脏、肝脏、脾脏与肾脏重量的变化，也未能减小小鼠体内的白色脂肪(肾周脂肪和附睾脂肪)重量(表1)。与nd组小鼠相比，hfd组小鼠血清中的alt、ast、tc、tg、ldl-c与hdl-c的含量水平显著升高，白色脂肪比例增大，膳食蛹虫草多糖未能降低因高脂饮食引起的血清tg、tc、ldl-c、alt的升高，但却显著降低了ast与葡萄糖的含量水平(表2)。实验结果表明蛹虫草多糖不具有明显的降血脂效果，但可降低肥胖小鼠的血糖水平。
3.膳食蛹虫草提取物改善肥胖小鼠的葡萄糖和胰岛素耐受性
表3蛹虫草提取物处理后不同时间的血糖水平变化情况
表4注射胰岛素后，蛹虫草多糖组小鼠的葡萄糖变化水平
为探究膳食蛹虫草多糖对高脂膳食小鼠的葡萄糖耐量的影响，在实验第12周和第13周分别对各实验组小鼠进行ogtt和itt实验。实验结果如表3和图2所示，hfd组小鼠的空腹血糖水平明显高于lfd组与膳食蛹虫草多糖组。对小鼠进行灌胃葡萄糖溶液(2g/kg)后各膳食组小鼠血糖水平在30min后达到最高，随后趋于下降，到120min时hfd组血糖水平依然明显高于lfd与蛹虫草多糖组。如表4和图3所示，对小鼠腹腔注射胰岛素后，蛹虫草多糖组小鼠的葡萄糖变化水平与恢复速度明显优于hfd组。实验数据表明hfd组小鼠与lfd组相比出现了明显的葡萄糖不耐受，而膳食蛹虫草多糖提取物可以改善高脂膳食诱导产生的肥胖小鼠的葡萄糖不耐受性，且作用效果具有浓度依赖性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。