本发明属于组织工程与新医药技术领域。具体涉及一种结合干细胞来源的外泌体的生物活性材料水凝胶滴眼液的制备，还涉及这类材料作为滴眼液应用于角膜组织损伤修复的治疗效果。
背景技术
干细胞因其全能性与多向分化潜能广泛应用于多种疾病，干细胞可分为成体干细胞和胚胎干细胞，其中，间充质干细胞是一种来源广泛的成体干细胞，只表达低水平的hla/mhci类分子，具有低免疫原性和一定的免疫抑制能力。其呈现出多能性，能够在体外和体内分化为许多结缔组织细胞类型如成骨细胞，软骨细胞和脂肪细胞的表型。成为干细胞治疗中的重要工具。目前的研究中，间充质干细胞在多种疾病治疗中表现出潜力，包括自身免疫性疾病，实体器官移植物存活，肝硬化，肾脏疾病，神经和肌肉退化疾病，心肌梗塞或脊髓引起的病变和损伤等。胎盘来源的间充质干细胞作为一种来源于年轻供体的细胞，可能具有更强的增殖和分化能力。
有研究认为，除了细胞移植后发生转分化代替损伤的组织细胞外，间充质干细胞的旁分泌作用是其在疾病治疗中发挥作用的重要机制。典型的间充质干细胞分泌谱包括生长因子，细胞因子，细胞外基质蛋白酶，激素和脂类介质等。在20世纪80年代早期，研究人员首次描述了由网织红细胞分泌的小内皮细胞囊泡（30nm-100nm），并应用外泌体（exosome）进行命名。exosome是由脂质，蛋白质，细胞骨架元素，分子伴侣和信号分子动态组成的的囊泡样小体，由细胞主动向胞外分泌，大小均一。多项研究表明，间充质干细胞和其他细胞之间的沟通可以通过外泌体（exosome）。研究证明，exosome中也含有遗传物质，包括信使rna（mrna）和微小rna（microrna）。多种类型的细胞，包括心肌细胞，血管内皮细胞和间充质干细胞，均可分泌含有mirna及细胞因子的exosome，而mirna介导的内皮细胞与心血管细胞之间的通讯也被证实。
水凝胶作为一种亲水聚合物的交联形式，已经展现出是一种在生物及医学领域具有巨大潜力的生物材料。这些亲水聚合物网络中通常对水有很高的亲和力，但由于其通过物理或化学作用形成了交联网络，故不会溶解在水中，同时水可以渗入聚合物的聚合物网络之间，随后引起膨胀形成一种水凝胶模式。作为植入体，可经过简单的混合而负载多种治疗药物和不需预设支架形状，是理想的药物载体、栓塞材料和组织工程支架材料。此外，水凝胶作为一种天然大分子化合物，具有一定的机械强度和可降解性等物理参数，同时也具有生物相容性和提供生物相关微环境的生物学特性，在医学领域具有广泛的应用。此外，因温度响应型水凝胶具有良好的可注射性，可以避免置放已成形细胞支架带来的损伤，故温度响应型水凝胶可作为组织工程的细胞支架用于移植细胞。天然水凝胶具有疏松多孔的网状结构，可以模拟天然的细胞外基质并为细胞粘附、迁移和增殖提供支持；另外，天然水凝胶可以被溶酶体降解，在生物体内具有良好的生物可降解性，可以完全被生物降解，以便在组织修复后完全被生物组分取代。
在人来源的间充质干细胞的培养基中，科学家已经证实了exosome的存在，将这些exosome注射到缺血-再灌注模型大鼠中，其显示出卓越的心肌保护作用。以上结果表明，mscs分泌的exosome可能具有促进组织修复的潜力。鉴于眼部的清洁作用，眼部给药一直以来存在一个问题，就是药物在角膜表面停留较短。因此，目前眼部给药的方法就是多次给药，但反复的药物刺激可能产生炎症反应，且药物使用量增加，患者依从性差。从这一点上来看，将外泌体与生物活性材料结合，制成水凝胶滴眼液，可以促进外泌体驻留，提高治疗效果，从而为组织损伤修复提供新的视角。
技术实现要素：
本发明是一种生物材料水凝胶包裹递送外泌体并增强其在角膜损伤中的治疗效果的技术手段。
该发明是使用干细胞分泌的外泌体通过物理混合与生物活性材料水凝胶结合，将外泌体释放至周围组织中，调控其释放速度和释放方式。
所述水凝胶为生物活性材料水凝胶滴眼液，所述的水凝胶即具有生物材料的物理和化学性能，也具有干细胞分泌的外泌体的生物活性。其特征在于，所述的生物材料可以是壳聚糖，但不限于壳聚糖，还包括透明质酸，羧甲基纤维素钠等可应用于眼部给药的材料。
所述外泌体为干细胞来源的外泌体，所述干细胞包括脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、尿液来源干细胞、内皮祖细胞、或心脏干细胞等。
本发明可以有效增强外泌体在损伤部位的滞留率，同时提高外泌体内蛋白质及microrna等有效成分的稳定性，并可以将外泌体缓释到损伤部位，进一步提高外泌体的治疗效果，促进损伤组织结构和功能的恢复。
所述组织损伤包括角膜损伤，皮肤损伤等。
附图说明
图1为外泌体特征的鉴定，该外泌体为间充质干细胞分泌的外泌体。
图2为天然壳聚糖化学式以及本发明良好的生物相容性。
图3为外泌体可以被细胞内吞从而发挥作用。
图4为水凝胶包裹缓释的外泌体可以更好的促进角膜损伤后的恢复。h&e染色显示水凝胶包裹的外泌体治疗组中角膜结构修复最好，基质排列更规则。
具体实施方式
下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可以从商业途径获得。
实施例1，本发明提供一种干细胞来源的外泌体提取及鉴定的方法。
细胞培养基、双抗、胰酶等试剂均购于gibco公司；细胞培养耗材均购于corning公司。
细胞培养所需血清为去除外泌体的胎牛血清，购于bi公司，处理步骤如下：将胎牛血清置于超速离心管中，120,000g在4℃离心2h，在超净台中取上清，并用0.22μm的针式滤器过滤，保存于-80℃冰箱备用。
细胞传代培养、冻存及复苏等细胞生物学实验操作步骤详见《动物细胞培养（第六版）》。
收集含有外泌体的hp-mscs条件培养基：当培养于75cm2的细胞培养瓶中的hp-mscs处于对数增长期，细胞汇合度达到80%时，吸尽培养基，用pbs洗两次，每瓶加入10ml配置好的含有10%无外泌体的fbs的完全培养基，继续培养24h后，将培养基收集至离心管中，该培养基为富含外泌体的条件培养基。
超速离心法分离提取外泌体：①将上述步骤获得的条件培养基于4℃，300g离心10min，去除细胞碎片；②将所得上清于4℃，12,000g离心20min，去除凋亡小体等大的细胞碎片；③用0.22μm的针式滤器过滤所得上清，去除直径大于200nm的微囊泡；④把过滤后的上清置于超速离心管中，4℃100,000g离心70min，弃上清，加入适量pbs重悬管底沉淀，于-80℃保存。
使用透射电子显微镜鉴定外泌体形态，将上一步骤提取的外泌体滴于200目的样品网上，室温静止2min，用滤纸吸干多余液体；在样品网上滴加20mg/ml醋酸铀溶液，室温静置1min，对样品进行负染，用滤纸吸干多余液体，并将样品网晾干；将制备好的样品置于透射电镜下观察，并采集照片。如图1所示，外泌体为杯状囊泡样结构，直径约为70-100nm左右。
通过westernblot检测外泌体标志蛋白cd9和cd63（图1）。
1）蛋白样品制备：将超速离心后得到的外泌体沉淀中加入ripa裂解液裂解外泌体，反复吹打后移入洁净1.5mlep管中，在冰上裂解30min，每10min涡旋振荡一次，于4℃，12,000rpm离心15min，将上清移入新的ep管中；使用bca法测定外泌体蛋白浓度，其余蛋白液中加入5×上样缓冲液，在沸水中煮10min，保存于-80℃冰箱中备用。
2）聚丙烯酰胺凝胶电泳：将洁净晾干的玻璃板装于制胶架上，使底边吻合严密，用蒸馏水验漏。按照分离胶配方配制10%的分离胶溶液，充分混匀，用移液器加入4.5ml分离胶溶液至玻璃板缝隙中，立即轻柔加入蒸馏水将分离胶液面压平，约20min后分离胶凝固。按照配方配制5%的浓缩胶溶液，灌注1.5ml浓缩胶溶液到分离胶的上方，立即插入梳子，待浓缩胶凝固后便可使用。将配好的胶板放置到电泳槽内，注意短玻板向内侧，在两块玻板中间加入电泳液，将梳子拔出，按照测定蛋白浓度统一上样量，将蛋白样品加入上样孔中，添加电泳液至电泳槽标记处，盖好电泳槽盖，注意连接正负极，90v开始电泳，待溴酚蓝跑至分离胶时，将电压调至120v，直至溴酚蓝接近玻板底部时停止电泳。
3）转膜：将转膜夹与海绵及滤纸浸泡于预冷的转膜缓冲液中，把聚丙烯酰胺凝胶置于黑色夹板一侧，剪取适宜大小的pvdf膜，置于甲醇中活化60s，放置于胶上，除尽气泡，覆盖滤纸和海绵，按照转膜夹负极（黑色）-海绵-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵-正极（白色）顺序夹好转膜夹，放置于转膜槽中，添加转膜液，冰浴恒压120v转膜2h。
4）封闭：将转膜完成的pvdf膜取出，用tbst溶液洗尽凝胶残渣，置于5%的脱脂牛奶（封闭液）中，水平摇床100rpm室温封闭1h。
5）抗体杂交：①一抗孵育：用封闭液按照说明书稀释一抗（gapdh，1:5000稀释，cd9，1：1000稀释，cd63，1:1000稀释），吸取2ml一抗置于抗体孵育盒中，对照蛋白marker将目的条带剪下，浸泡于对应一抗中，4℃孵育过夜；②二抗孵育:将条带用tbst溶液清洗3次，每次5min，然后加入对应二抗，水平摇床100rpm室温孵育2h，孵育完成后用tbst洗3次，每次5min。
6）发光检测：把发光液a/b按1:1比例进行混合配成工作液，在暗室中将发光液滴加在膜上，待目的条带发出绿色荧光时，用胶片进行曝光、显影及定影。
实施例2，本发明提供壳聚糖水凝胶的制备方法。
温度响应壳聚糖水凝胶制备方法：将脱乙酰壳聚糖（mn=50,000）粉末溶解于0.1m乙酸中，0.22μm滤器过滤灭菌，并在冰浴中制备成2％壳聚糖的溶液。
实施例3，本发明提供一种利用水凝胶包裹递送外泌体的方法。
将0.2%水凝胶溶液与干细胞来源的外泌体等体积互溶，制备成1×的含有外泌体的溶液，并一直使其处于4℃环境中，在使用时保持注射器于4℃预冷。
实施例4，本发明提供了一种利用间充质干细胞分泌的外泌体结合生物材料壳聚糖水凝胶滴眼液治疗角膜碱损伤的方法。
小鼠角膜碱损伤模型构建：将一片滤纸（11μm）切成多个2mm的圆形，备用。通过将2gnaoh溶解在50ml蒸馏水中来制备1m的naoh溶液。在室温下储存。腹腔注射4%水合氯醛进行麻醉，麻醉大概需要1-2分钟。麻醉深度可以通过轻轻地捏住小鼠的脚趾或尾巴来确定，如果麻醉计量足够，应该没有反应。注意：应小心确保小鼠不会因麻醉引起体温过低。术后可将小鼠转移至加热垫上。手术器械提前洗净并进行高温高压灭菌，使用无菌镊子，拿起一块浸过naoh的滤纸。注意如果到过量的naoh粘附在滤纸上或从滤纸上滴下来，应将多余的naoh去除，将滤纸轻轻敲打在干燥的滤纸上以吸收多余的naoh。将动物随机分为4组：pbs组，壳聚糖（cs）组，外泌体（exo）组，cs包裹的外泌体（cs-exo）组。将一片naoh浸泡过的滤纸放在中央角膜上。静置30秒，产生约2×2平方毫米的急性碱烧伤。取下滤纸。随后马上应用使用10毫升注射器，用10毫升pbs轻轻冲洗眼睛两次，洗去残留的naoh。
手术后一天观察造模情况，在完成角膜损伤模型的构建后，在术后第一天观察小鼠眼部，可见2mm大小白色浑浊区域，眼睑无损伤粘连，小鼠可正常睁眼，则造模成功。
每日三次每次滴加15微升外泌体水凝胶滴眼液，每日外泌体给药浓度为100微克。重复使用3次/天，连续14天。
在手术显微镜下每日检查小鼠并基于角膜混浊度，nv和血管大小。使用数码相机，在5天拍摄代表性的眼部图像。直接进行临床评估或者牺牲小鼠并将眼睛用于角膜常规石蜡/冷冻组织学评估。
实施例5，本发明提供检测水凝胶对干细胞来源外泌体治疗功能影响的方法。
通过体视显微镜观察治疗效果：连续14天。在手术显微镜下每日检查小鼠并基于角膜混浊度，nv和血管大小。使用数码相机，拍摄代表性的眼部图像。
角膜荧光素染色：在第七天进行角膜荧光素钠染色。小鼠应用4%水合氯醛腹腔麻醉后，将荧光素钠滤纸用灭菌的pbs沾湿，轻贴于小鼠角膜上，随后用pbs冲洗，去除多余的荧光素。在紫外灯光下观察角膜的破损染色情况，应用数码相机拍照。
角膜组织冰冻切片免疫染色：将切片从-20℃冰箱中取出，室温放置30分钟；将切片放入（-20°c预冷30分钟的）丙酮原液中固定10分钟；将切片置于空气中干燥30分钟；使用pbs洗涤切片（每次5分钟，共2次）；破膜：0.1%tritonx-100，室温，10分钟；pbs洗涤，5分钟，2次；血清封闭，室温，一个小时加一抗，4℃过夜次晨复温，1小时；pbs洗涤，5分钟，4次；加二抗（避光），室温，2小时；pbs洗涤，每次5分钟，共3次；dapi封片，荧光显微镜下观察，拍照。
实施例6，本发明提供小鼠下皮肤损伤模型的构建方法。
小鼠皮肤损伤模型的构建：称取小鼠体重，按330mg/kg（10μl/g）4%水合氯醛的剂量，腹腔注射麻醉小鼠；在小鼠背部剪除全层皮肤及肉膜，暴露肌肉层，造成直径为1cm的圆形皮肤缺损；用iv3000无菌不透水伤口敷料覆盖创面，贴膜边缘用伤口粘合剂點附于裸鼠背部皮肤，自第3天起每隔2天更换创面敷料；将手术后动物随机分为4组：pbs组，壳聚糖（cs）组，外泌体（exo）组，cs包裹的外泌体（cs-exo）组，并于皮肤损伤位点分别注射pbs、cs、exo和cs-exo。