本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种mir-15a-5p在提高car-t细胞抗肿瘤能力中的应用。
背景技术
嵌合抗原受体t细胞(chimericantigenreceptort-cell,car-t)是近年来新兴的免疫治疗技术，通过将靶细胞的特异性受体组装到t细胞上再输入病人体内，起到特异性肿瘤杀伤效果，取得不错的疗效。目前应用于临床的主要是第三代car-t，即在t细胞表面组装抗原受体的同时串联一些体细胞激活所需的共刺激分子，通常包括cd28和4-1bb，使嵌合在t细胞表明的抗原受体与靶抗原结合的同时激活共刺激分子使t细胞完全活。
cd28为t细胞表面b7类分子的受体，可以在t细胞增殖和分化中起到共刺激的作用，为t细胞完全活化提供条件，还与细胞周期、表过遗传修饰、代谢和翻译后修饰等有关。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种mir-15a-5p在提高car-t细胞抗肿瘤能力中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明通过将anti-cd19car载体与mirna-15a-5p抑制剂antagomir(产品编号：mir30000068-1-10，广州市锐博生物科技有限公司)共转t细胞，发现mirna-15a-5p抑制剂能够显著地提高t细胞内cd28的mrna水平和蛋白质水平，以及细胞因子ifn-γ和il-2的分泌水平，显著增强t细胞的细胞活性和杀瘤效果。这些结果表明mirna-15a-5p抑制剂能够提高car-t细胞内的cd28的表达，使t细胞在免疫过程中快速增殖、活化，提高抗肿瘤能力。因此，mirna-15a-5p可以作为靶标用于筛选提高car-t细胞抗肿瘤能力的药物。
mirna-15a-5p的抑制剂可用于制备提高car-t细胞抗肿瘤能力的药物。
一种提高car-t细胞抗肿瘤能力的药物，包含mirna-15a-5p的抑制剂。所述的药物还可以包含辅料，如赋形剂、载体等。
所述的mirna-15a-5p的抑制剂包括针对mirna-15a-5p的antagomir或sirna，以及其他能够抑制mirna-15a-5p活性的化学物质。
本发明具有如下优点和有益效果：本发明可以极大地提高car-t细胞的抗肿瘤能力，为抗肿瘤药物的开发提供了新的方向。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
一、anti-cd19car载体的构建
car的元件组成包括：引导链(leader)、抗cd19单链抗体(cd19-scfv)、铰链区(hinge)、cd28跨膜区(cd28tm)、cd28膜内区(cd28icd)、4-1bb和cd3ζ链。各元件序列均为现有已知技术(pub.no.:us2014/0271635a1)。
各元件通过重叠延伸pcr(oe-pcr)多步依次串联在一起。通过将leader和cd19-scfv、hinge和cd28tm、cd28icd和4-1bb两两相连成三段，再与cd3ζ两两相连，最终将上述序列依次串联在一起。所使用的dna扩增酶为pfudna扩增酶(北京擎科新业生物技术有限公司)。pcr反应体系及反应条件如下：
反应体系：pfu2×mix10μl，模板1μl，引物2μl，超纯水7μl。
反应条件：95度5分钟；95度30秒，55度30秒，72度1分钟，30个循环；72度5分钟，4度∝。
通过ecor1和mlu1两个酶切位点将car基因片段连入基于hiv-1型改造的慢病毒表达载体plvx-ef1α-ires-puro(产品编号：vt2015，优宝生物)，构建好的car载体质粒命名为plvx-ef1α-cd19，转化入大肠杆菌dh5α克隆载体质粒。
二、慢病毒anti-cd19car的包装
(1)在转染的前一天，传代准备细胞：用0.25％胰蛋白酶消化293t细胞，以含10％血清的dmem培养基(美国gibco公司)调整细胞密度后，按照每10cm细胞培养皿接种6～8×106细胞数到10cm细胞培养皿中，置于37℃、5％co2培养箱培养，16h～24h后待细胞密度生长到80％～90％时即可用于转染。
(2)第二天，在转染前2～4h，用5ml不含双抗的完全培养基换液(dmem+10％fbs)。
(3)应用pei进行转染
a、取dmem低糖无血清无双抗培养基(美国gibco公司)两份各500μl分别加入两个1.5mlep管中，标记为a、b。
b、在a中加入载体上述构建好的car慢病毒表达载体plvx-ef1α-cd196μg和pspax23μg、pmd2.g1μg慢病毒包装载体，充分混匀。
c、在b中加入25μl(1μg/μl)pei试剂(北京海德创业生物科技有限公司)，充分混匀。
d、将b中试剂加入a中，漩涡震荡混匀，37℃孵育20分钟。
e、然后将混合物逐滴均匀加入到10cm细胞培养皿中，轻微混匀。置于37℃、5％co2培养箱中培养。
(4)第三天，即培养12h～16h后弃去培养基，用10ml新鲜的完全培养基(dmem+10％fbs+p/s)换液。
(5)第四天，即换液后24h，收集上清液，置于4℃冰箱保存，然后加入10ml新鲜的完全培养基(dmem+10％fbs+p/s)至10cm细胞培养皿中，置于37℃、5％co2培养箱继续培养。
(6)第五天：再一次收集上清，与第一次收集的上清液混合，1000rpm离心5min，弃去细胞碎片，上清液以0.45μmpvdf滤器(millipore公司)过滤至50ml圆底离心管中。
(7)4℃、50000g高速离心2h，离心后可用记号笔对病毒沉淀做好标记。
(8)小心弃去上清，晾干，按200μl/10cm培养皿的量加入dmem(美国gibco公司)(不含血清、双抗)或者pbs重悬病毒沉淀，室温静置2h，然后用移液器轻轻地吹匀(避免产生气泡)，继续室温放置30min，按每次使用的病毒量分装到洁净的1.5mlep管中，-80℃冰箱保存。
三、单核细胞(pbmcs)的获取
抗凝处理的正常人体捐赠的外周血、pbs(美国gibco公司)、淋巴细胞分离液ficoll(北京solarbio公司)各3ml。先在15ml离心管中加入3ml淋巴细胞分离液ficoll，3ml外周血与3mlpbs相互混匀后顺管壁轻轻加入到ficoll上层，水平离心400g×30分钟。
离心后可看见管内分为三层，上层为血浆和pbs，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液。在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，为单个核细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。
四、cd3+t细胞的分离
(1)免疫磁珠的洗涤
将小管内的anti-cd3免疫磁珠(cd3microbeads,human，德国美天旎公司)摇匀悬浮，取出所需量的免疫磁珠(正常人体每毫升外周血大概含有106个pbmc，免疫磁珠:pbmc约为3:1)到1.5ml试管内，加入1mlt细胞完全培养基(美国gibco公司)(1640，10％fbs，1％penicillin-streptomycin，50μmβ-mercaptoethanol，100u/mlil-2)并混悬好，漩涡洗涤1min。
将试管放入磁体架内静置吸附1分钟，吸管吸弃上清，离开磁体后再次用与初始anti-cd3免疫微磁珠体积等量体积的培养液重悬磁珠。
(2)分离
将混悬好的anti-cd3免疫微磁珠试管放在磁性细胞分离架上静置吸附2分钟，轻轻吸取移除上清，加入单个核细胞悬液到试管，离开磁场，在4℃冰箱旋转孵育20分钟后放入分离架静置吸附2分钟，用1mlt细胞完全培养基轻轻洗涤沉降复合物，尽量减少免疫微磁珠与cd3细胞脱离。再将试管放入分离架静置2分钟，轻轻吸取移除悬液。重复洗涤1-2次。
取所需体积的pbs，按照5μg/ml的终浓度加入anti-cd3和anti-cd28抗体，500μl/孔包被24孔板，室温放置4h，吸掉抗体悬液，加入500μl1％bsa(pbs配制)室温封闭30min，封闭结束加入500μlpbs洗孔一次。
将分离得到的cd3+t按照浓度5×105细胞数/ml重悬在t细胞完全培养基中，将细胞加入包被处理好的24孔板，1ml每孔(5×105cells/ml)，然后放入37℃、co2培养箱刺激培养48h后可进行病毒感染。
五、感染cd3阳性t细胞
待cd3+t细胞在上述环境培养48小时后接受病毒感染。另取一anti-cd3和anti-cd28抗体包被好的24孔板，每孔加入2-5×105细胞。按moi＝70加入包装好的anti-cd19car病毒轻轻吹打混匀。24孔板于1000g室温离心感染90min。离心结束后将平板放入37℃、co2培养箱感染6小时。感染结束后取出培养板，小心吸掉感染孔中350μl的培养基(70％)，加入0.85ml的t细胞完全培养基补足体积为1ml并吹打混匀。病毒感染24h后，小心吸掉培养基，在同一培养皿中按上述步骤进行病毒复感染操作。将细胞放入37℃、co2培养箱继续培养，2-3天后加入8μg/mlpuromycin筛选2-3天，至没有进行病毒感染的对照组全部死亡。避免震荡，轻轻吸取上清加入完全培养基，经过多次换液后可去除死细胞。
继续在完全培养基培养至第14天加入mirna-15a-5p抑制剂antagomir(20pmol/ml细胞悬液)。转染两天后2000rpm离心2分钟，换为完全培养基进行培养用于下游实验。
六、anti-cd19car载体与mirna-15a-5p抑制剂共转t细胞的特性检测
1、cd28分子表达水平
(1)mrna水平
用trizol法提取三组细胞：anti-cd19car+mirna-15a-5pantagomir组、anti-cd19car+mirna-15a-5pantagomirnegativecontrol(antagomirnegative产品编号：mir03101-1-10，广州市锐博生物科技有限公司)组和野生型t细胞的总rna，逆转录成cdna，以β-actinmrna作为内参基因(β-actin上下游引物分别为：f：5’-gtggacatccgcaaagac-3’，r：5’-aaagggtgtaacgcaactaa-3’)针对cd28(cd28上下游引物分别为：f：5’-ctatttcccggaccttctaagcc-3’，r：5’-gcggggagtcatgttcatgta-3’)做rt-qpcr。rt-qpcr体系20μl：sybrpremixextaqⅱ(2×)10μl，上游引物0.8μl，下游引物0.8μl，cdna模板2μl，ddh2o6.4μl。
结果：anti-cd19car+mirna-15a-5pantagomir组中cd28的mrna较anti-cd19+mirna-15a-5pantagomirnegativecontrol组上调约13％，其差异具有统计学意义(p<0.05)；和野生型t细胞比较表达上调约22％，其差异具有统计学意义(p<0.05)。
(2)蛋白质水平
运用westernblot技术，分析anti-cd19car+mirna-15a-5pantagomir组、anti-cd19car+mirna-15a-5pantagomirnegativecontrol组和野生型t细胞三组中cd28分子的表达量。用ripa裂解细胞20分钟，4℃、12000rpm离心3分钟，吸取上清为细胞总蛋白进行bca蛋白定量。取等量总蛋白进行westernblot分析。用10％浓度的聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离后的蛋白转移到至固相支持物(硝酸纤维膜)，利用cd28特异抗体进行检测。
结果：anti-cd19car+mirna-15a-5pantagomir组中cd28的蛋白表达水平较anti-cd19+mirna-15a-5pantagomirnegativecontrol组上调约14％，其差异具有统计学意义(p<0.05)；和野生型t细胞比较表达上调约23％，其差异具有统计学意义(p<0.05)。
2、细胞活性检测
(1)运用mtt染色法鉴定共感染t细胞活性。分别将三组同等数目细胞(每孔1000-10000个)接种至anti-cd3和anti-cd28抗体包被的96孔板中在相同条件下培养3天，各孔加入mtt溶液(5mg/ml)继续培养4小时，每孔加入150μldmso震荡溶解结晶10分钟，选取490nm波长在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
结果：anti-cd19car+mirna-15a-5pantagomir组细胞活性水平较anti-cd19+mirna-15a-5pantagomirnegativecontrol组上调约19％，其差异具有统计学意义(p<0.05)；和野生型t细胞比较表达上调约23％，其差异具有统计学意义(p<0.05)。
3、细胞因子分泌水平检测
运用r&delisa试剂盒(美国r&dsystems)检测ifn-γ和il-2细胞因子水平。实验方案简述如下：将三组细胞用pbs洗两遍与b型急性白血病细胞按照数量比1:1接种共培养16-22小时，取上清10倍稀释后检测ifn-γ，取上清不稀释检测il-2。将酶标仪激发波长设置540nm，读取波长设置在450nm，30分钟内完成检测。
结果：anti-cd19car+mirna-15a-5pantagomir组中ifn-γ和il-2分泌水平较anti-cd19+mirna-15a-5pantagomirnegativecontrol组分别上调约20％和23％，其差异均具有统计学意义(p<0.05)；和野生型t细胞比较ifn-γ和il-2分泌水平分别上调28％和31％，其差异均具有统计学意义(p<0.05)。
4、体外杀瘤实验
运用51cr靶细胞杀伤实验分析三组t细胞体外杀瘤能力。实验流程简下：用3.7mbqna251cro437度标记1×106个b型急性白血病细胞1小时，洗涤细胞三次。向96孔板加入靶细胞，每孔100μl。按三组细胞:靶细胞＝50:1的比例向各孔加入100μl不同效应细胞。每组均设3个复孔，阴性对照孔(自发释放)只加100μl完全培养液，阳性对照孔(最大释放)加100μl1％np40(v/v)。将96孔板置37℃培养4h后，1000g离心培养板10min，每孔吸取100μl上清在液闪计数仪上测定每分钟放射活性(cpm值)。
细胞杀伤活性按以下公式计算：活性(％)＝[(实验组cpm-自发释放cpm)/(最大释放cpm-自发释放cpm)]×100％。
结果：anti-cd19car+mirna-15a-5pantagomir组b型急性白血病细胞几乎全部裂解(>95％)，而anti-cd19car+mirna-15a-5pantagomirnegativecontrol组b型急性白血病细胞裂解率约为83％左右，杀瘤能力提高约15％，其差异均具有统计学意义(p<0.05)；野生型t细胞中的b型急性白血病细胞裂解率在35％，anti-cd19car+mirna-15a-5pantagomir组与之比较杀瘤效果提升约60％，其差异均具有统计学意义(p<0.0001)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>武汉科技大学
<120>mir-15a-5p在提高car-t细胞抗肿瘤能力中的应用
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
gtggacatccgcaaagac18
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
aaagggtgtaacgcaactaa20
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
gcggggagtcatgttcatgta21