本发明属于药物化学领域，涉及静脉铁制剂原料药的制备，具体涉及超顺磁氧化铁原料药中内毒素的去除方法。
背景技术：
超顺磁氧化铁(ferumoxytol)是由聚葡萄糖山梨醇羧甲醚包裹超顺磁氧化铁形成的纳米颗粒，该药物的注射剂于2009年由fda批准上市，用于治疗慢性肾病(ckd)成人患者的缺铁性贫血。缺铁性贫血(ida)是体内铁的储存不能满足正常红细胞生成的需要而发生的贫血。是由于铁摄入量不足、吸收量减少、需要量增加、铁利用障碍或丢失过多所致。形态学表现为小细胞低色素性贫血。缺铁性贫血不是一种疾病，而是疾病的症状，症状与贫血程度和起病的缓急相关。缺铁和贫血是许多严重疾病常见的并发症，这些疾病包括慢性肾病、慢性心力衰竭、肿瘤化疗引起的贫血、炎症性肠病、大量月经出血和产后出血。慢性肾病患者、育龄妇女、怀孕妇女、发育期儿童中是缺铁性贫血的高危人群。缺铁性贫血会严重降低病人的生活质量，增加住院甚至死亡的风险，同时也增加了患者的医疗负担。数据显示，合并缺铁性贫血的慢性病患者的医疗费会增加30-40％。因此采用有效的治疗方案是病人血液管理的一项重要内容。ida的治疗主要有口服铁剂、肠道外制剂(即静脉铁剂)、输血治疗以及膳食调整和其他类治疗。治疗ida首选是口服铁剂，对于不能耐受口服铁剂、对口服铁剂没有充分响应的患者，以及患有肠道吸收疾病的患者，可以采取静脉铁剂。美国市场主流静脉铁制剂有：①右旋糖苷铁注射液(irondextran)；②蔗糖铁注射液(ironsucrose)；③羧基麦芽糖铁注射液(ferriccarboxymaltose)；④复合葡萄糖酸钠铁(sodiumferricgluconatecomplex)；⑤超顺磁氧化铁注射液(ferumoxytol)。中国市场主流静脉铁剂有右旋糖酐注射液和蔗糖铁注射液。ferumoxytol是胶体铁-碳水化合物复合物。该分子以氧化铁为中心，外覆聚葡萄糖-山梨醇-羧甲基纤维素钠外壳，这样可以在药物到达肝、脾、骨髓的巨噬细胞前阻止有生物活性的二价铁与血浆成分接触。在巨噬细胞内铁离子从复合物中释放出来，然后进入细胞内的铁存贮池(如，铁蛋白)或者通过血浆转铁蛋白转运至红系祖细胞合成血红蛋白。研究表明分子量及氧化铁核心越小，铁制剂越不稳定.活性铁释放越快，由活性铁引起的不良反应更多，也更易被机体清除，临床应用间隔时间及单次用药剂量也只能更小。而具有较高分子量及较大氧化铁核心颗粒的铁制剂则意味着更加安全和方便。超顺磁氧化铁的分子量达到750kd，具有较高的安全性。在一项“ckd患者缺铁性贫血”临床ⅲ期研究表明，与口服铁剂相比，两次注射ferumoxytol可更为显著提高血红蛋白量，同时耐受性良好。比口服铁剂和蔗糖铁相比，超顺磁氧化铁效果更好，因为其载铁量较蔗糖铁高，且使用方便，只需注射两次，提高了患者的依从性，减少了医疗操作，并降低了部分成本。内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，叫做脂多糖。脂多糖对宿主是有毒性的。常见的内毒素去除的方法有高浓度酸碱去除法，超滤膜和荷电微孔滤膜法，石棉及活性炭吸附法，化学降解法，离子交换色谱法，亲和色谱法。但对药品来说，由于其具有生理活性，控制内毒素主要通过环境控制法或者用活性炭来进行物理吸附。超顺磁氧化铁原料药中含有大量游离糖，且ph为中性，非常适合微生物的生长、且内毒素极难控制，对生产环境要求苛刻，生产成本高。通过环境来控制内毒素条件苛刻且失败率高；若选择用活性炭来除内毒素又担心活性炭能否完全除干净，且现在国内外不建议通过活性炭来除去注射液中内毒素。目前，现有技术还没有报道有效并简便去除超顺磁氧化铁原料药内毒素的方法。技术实现要素：由于超顺磁氧化铁原料药中的内毒素较难通过环境控制法或者活性炭物理吸附法去除，本发明技术人员需要探索其他的方法。本发明提供了一种简便有效去除超顺磁氧化铁原料药中内毒素的方法。该方法通过使用一定浓度的强碱和次氯酸钠的混合溶液去除内毒素。本发明技术人员发现，单纯使用强碱，如氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化锂等去除超顺磁氧化铁原料药中内毒素，强碱浓度大于5％时，虽然可将内毒素含量降低至6.25-12.5eu/ml，符合质量标准，但原料药粒径大于51nm，显示超顺磁氧化铁纳米粒遭到破坏，不符合质量标准。将强碱浓度降低至3％，内毒素和粒径均不符合质量标准。当强碱浓度为1％时，纳米粒虽没有遭到破坏，但内毒素不符合质量标准。单独使用强碱去除内毒素，较难使得内毒素含量和纳米粒粒径均符合质量标准。使用氧化剂次氯酸钠去除超顺磁氧化铁原料药中内毒素，当使用浓度高达10％的次氯酸钠溶液时，内毒素含量仍然不符合质量标准，同时，纳米粒遭到破坏。本发明技术人员意外的发现将原料药浓缩液中同时加入强碱和次氯酸钠，使原料药浓缩液中氢氧化钠的浓度为1％，同时次氯酸钠浓度为0.5％-2.0％时，可将内毒素水平降至3.0-6.25eu/ml，同时，原料药纳米粒没有遭到破坏，符合质量标准。本发明去除内毒素的反应时间大于0.5小时，优选2小时。本发明去除内毒素的反应温度为50℃～100℃，优选70℃～90℃，最优选80℃。具体实施例在下面将对本发明进行详细描述。然而，本发明可能具体体现为许多不同的形式，而且它不应该被局限于此处所描述的实施例中，提供这些实施例中的目的是使所披露内容更完整与全面。所用试剂和原料，除了提供制备方法的除外，其余均为市售。除非另有定义，否则本文中所有科技术语具有的含义与权利要求主题所属
技术领域：
人员通常理解的含义相同。实施例1将100g右旋糖酐10(psc)溶于200ml水中，加入50％氢氧化钠溶液2g，投入硼氢化钠量1.6g，室温反应4小时，在不高于25℃下加入50％氢氧化钠80.0g，溴乙酸27.8g，室温反应16小时后用6m盐酸将体系ph调节到6.2，加入5000ml乙醇形成白色沉淀，去除上清液，残留物溶于240ml水中，加入800mg氯化钠，加入120ml乙醇，形成白色沉淀，重复上述提纯2次后将残留物溶于120ml水中，加入1l乙醇，白色固体析出，过滤、50℃干燥24小时得psc。psc(40g)溶于850ml水中，三氯化铁·六水(29.9g)和氯化亚铁·四水(14.9g)溶于373ml水中，使用0.2um滤膜过滤后，将其混合，在反应瓶中，降温至10℃，通氮气保护，在搅拌下，加入114ml，28％的氨水，滴加完毕后，加热到78℃，在78℃条件下，保温60min，然后在78℃的温度条件下，通入空气氧化，氧化完毕后，加水1.5l稀释，使用0.2um滤膜过滤反应液，滤液用10万分子量超滤膜超滤纯化、浓缩，得到超顺磁氧化铁原料药。实施例2将实施例1得到的原料药按照以下方法进行内毒素的测定：细菌内毒素检查法(中国药典2015年版通则1143)操作过程：(1)仪器及设备旋涡混合器、精密移液器、电热恒温器。(2)试验用具无热源取样勺、无热源空安瓿、一次性无热源吸头。(3)试药》＝0.125eu/ml的鲎试剂、细菌内毒素工作标准品、细菌内毒素检查用水(4)试验过程按照《中国药典》2015年版中国药典通则1143进行细菌内毒素检测，方法如下：根据干扰试验结果，本试验选择鲎试剂灵敏度为0.125eu/ml，供试品最大有效稀释倍数为100倍。(4-1)反应项目设置项目名称供试品检查供试品阳性对照阳性对照阴性对照溶液编号abcd溶液内容s100s100e0.25e0.25w平行管数2222(4-2)各反应溶液制备溶液c：细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后逐步稀释制备成2》细菌内毒素标准溶液。每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30s。溶液a：吸取超顺磁氧化铁适量，然后加入bet水，逐步稀释供试品溶液100倍。每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30s。可参考以下稀释步骤：溶液b：分别吸取0.5ml的s50和e0.5溶液至无热源空安瓿瓶中，旋涡混合30s，得到供试品阳性溶液s50e0.5。示意图如下：(4-3)加样：取8支复溶后的0.1ml/支的鲎试剂原安瓿，其中2支加入0.1ml稀释浓度为s100的溶液a作为供试品管；2支加入2》内毒素工作标准品溶液0.1ml作为阳性对照管；2支加入细菌内毒素检查用水0.1ml作为阴性对照管；2支加入0.1ml浓度为s100e0.25的溶液b作为供试品阳性对照管。加样结束后，用封口膜封口，轻轻混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37℃±1℃水浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态，保温60±2分钟，观察结果。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。(4-4)判定：将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性，记录为(+)；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记录为(－)。若阴性对照溶液d的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液b的平行管均为阳性，阳性对照溶液c的平行管均为阳性，试验有效。若溶液a的两个平行管均为阴性，判定供试品符合规定。若溶液a的两个平行管均为阳性，判定供试品不符合规定。若溶液a的两个平行管一管为阳性，另一管为阴性，需进行复试。复试时溶液a需做4支平行管，若所有平行管均为阴性，判定供试品符合规定，否则判定供试品不符合规定。超顺磁氧化铁内毒素的质量标准为小于12.5eu/ml。经测定，实施例1得到的原料药，内毒素水平为50～100eu/ml。粒度作为纳米铁制剂关键质量属性之一，可以通过粒径的变化来观察纳米粒是否遭到破坏。将实施例1得到的原料药按照以下方法进行粒径的测定：照粒度及粒度分布测定法(中国药典2015年版通则0982第三法)(malvernmastersizernanozs90或性能相当的激光粒度分析仪)，取本品适量，加水溶解并制成每1ml中含铁约0.3mg的溶液，超声10～15秒，依法检查，光强平均粒度应为19-51nm。经测定，实施例1得到的原料药的粒径为31.15nm。实施例3向实施例1得到的原料药浓缩液中加入氢氧化钠至浓缩液中整体氢氧化钠浓度为10％，将其加热至80℃反应2小时，自然降至室温，超滤除去加入的强碱，调节浓度后，按照实施例2的方法测定内毒素和粒径，经测定内毒素水平为6.25-12.5eu/ml，粒径为60.39nm。实施例4向实施例1得到的原料药浓缩液中加入氢氧化钠至浓缩液中整体氢氧化钠浓度为5％，将其加热至80℃反应2小时，自然降至室温，超滤除去加入的强碱，调节浓度后，按照实施例2的方法测定内毒素和粒径，经测定内毒素水平为6.25-12.5eu/ml，粒径为58.47nm。实施例5向实施例1得到的原料药浓缩液中加入氢氧化钠至浓缩液中整体氢氧化钠浓度为3％，将其加热至80℃反应2小时，自然降至室温，超滤除去加入的强碱，调节浓度后，按照实施例2的方法测定内毒素和粒径，经测定内毒素水平为12.5-25eu/ml，粒径为58.02nm。实施例6向实施例1得到的原料药浓缩液中加入氢氧化钠至浓缩液中整体氢氧化钠浓度为1％，将其加热至80℃反应2小时，自然降至室温，超滤除去加入的强碱，调节浓度后，按照实施例2的方法测定内毒素和粒径，经测定内毒素水平为12.5-25eu/ml，粒径为31.59nm。实施例7向实施例1得到的原料药浓缩液中加入次氯酸钠至浓缩液中整体次氯酸钠浓度为0.5％，将其加热至80℃反应2小时，自然降至室温，超滤除去加入的次氯酸钠，调节浓度后，按照实施例2的方法测定内毒素和粒径，经测定内毒素水平为50-100eu/ml，粒径为32.01nm。实施例8向实施例1得到的原料药浓缩液中加入次氯酸钠至浓缩液中整体次氯酸钠浓度为5％，将其加热至80℃反应2小时，自然降至室温，超滤除去加入的次氯酸钠，调节浓度后，按照实施例2的方法测定内毒素和粒径，经测定内毒素水平为25-50eu/ml，粒径为32.23nm。实施例9向实施例1得到的原料药浓缩液中加入次氯酸钠至浓缩液中整体次氯酸钠浓度为10％，将其加热至80℃反应2小时，自然降至室温，超滤除去加入的次氯酸钠，调节浓度后，按照实施例2的方法测定内毒素和粒径，经测定内毒素水平为25-50eu/ml，粒径为60.64nm。实施例10向实施例1得到的原料药浓缩液中分别加入氢氧化钠和次氯酸钠，至浓缩液中整体氢氧化钠浓度为1％，次氯酸钠为0.5％，将其加热至80℃反应2小时，自然降至室温，超滤除去加入的氢氧化钠和次氯酸钠，调节浓度后，按照实施例2的方法测定内毒素和粒径，经测定内毒素水平为3.0-6.25eu/ml，粒径为31.80nm。实施例11向实施例1得到的原料药浓缩液中分别加入氢氧化钠和次氯酸钠，至浓缩液中整体氢氧化钠浓度为1％，次氯酸钠为1.5％，将其加热至80℃反应2小时，自然降至室温，超滤除去加入的氢氧化钠和次氯酸钠，调节浓度后，按照实施例2的方法测定内毒素和粒径，经测定内毒素水平为3.0-6.25eu/ml，粒径为39.27nm。实施例12向实施例1得到的原料药浓缩液中分别加入氢氧化钠和次氯酸钠，至浓缩液中整体氢氧化钠浓度为1％，次氯酸钠为2.0％，将其加热至80℃反应2小时，自然降至室温，超滤除去加入的氢氧化钠和次氯酸钠，调节浓度后，按照实施例2的方法测定内毒素和粒径，经测定内毒素水平为3.0-6.25eu/ml，粒径为35.78nm。当前第1页12