本发明涉及一种红细胞膜包裹的纳米磁性颗粒，本发明还涉及一种心梗动物模型的造模方法。
背景技术：
心肌梗死是威胁人类生命的重大疾病，一直是备受关注的治疗和研究热点。心肌梗死动物模型的建立和应用，是研究人类心肌梗死病理、诊断乃至于治疗的基础，对于人类心肌梗死的预防、诊断和治疗具有极其重要的价值。目前心肌梗死动物模型制备中，结扎冠状动脉是最常用的方法。但在实际操作中，一方面，由于需要开胸手术，对动物的损伤巨大甚至局部组织是完全破坏，与实际情况中心肌梗死发生过程相去甚远；另一方面，麻醉和人工呼吸的使用不当、肺损伤以及左冠状动脉定位错误等各种原因，造成动物死亡或制模失败。因此，能否不用外力避免大面积创伤，从而减少动物死亡率，提高制模成功率，已成为困扰相关研究工作的一大难题。技术实现要素：本发明的技术方案是提供了一种红细胞膜包裹的纳米磁性颗粒。本发明还提供了该红细胞膜包裹的纳米磁性颗粒及其用途。本发明提供了一种红细胞膜包裹的纳米磁性颗粒，它是由如下方法步骤制备而成：一种红细胞包裹的纳米磁性颗粒，其特征在于：它是由如下方法步骤制备而成：(1)取磁性纳米颗粒；(2)提取红细胞膜；(3)携磁人工红细胞制备：将步骤(1)的磁性纳米颗粒与步骤(2)制备红细胞膜混合，震荡，红细胞膜包裹磁性颗粒表面，形成红细胞包裹的纳米磁性颗粒。步骤(1)中，所述磁性纳米颗粒为纳米磁性四氧化三铁粒子。所述纳米磁性四氧化三铁粒子的制备方法如下：将二价铁盐和三价铁盐溶液按物质的量比为1：2的比例混合，铁盐总浓度为0.5mol/l，加入200ml蒸馏水，温度控制在(30±1)℃，连续通入氮气，再滴加碱至ph＝10，搅拌，恒温水浴晶化，混合液由橙红色变成黑色后，再继续搅拌15min后结束反应，离心，得四氧化三铁颗粒，用蒸馏水洗涤直至ph＝7，移去上层清液，将产物在80℃下保温30min，研磨，即得纳米磁性四氧化三铁粒子；优选地，所述二价铁盐为feso4·7h2o；所述三价铁盐为fecl3·6h2o；所述碱为0.25mol/lnaoh溶液。步骤(2)中，提取红细胞膜的方法是：取红细胞，用生理盐水洗涤3次，彻底倾去上清，得压积红细胞；取压积红细胞，加入10倍体积的纯化水，室温充分混匀5min，5000rpm条件下离心10min,去上清，用纯化水洗涤至上清无色，再用生理盐水洗涤2次，最后一次彻底倾去上清，所得沉淀即为红细胞膜。步骤(3)中：所述的红细胞膜与磁性纳米颗粒的重量配比为：(1-3):(1-3)；优选所述的红细胞膜与磁性纳米颗粒的重量配比为：(1-2):1；进一步优选为2:1。步骤(3)的操作步骤如下：制备纳米磁性颗粒溶液和红细胞膜溶液，再按照红细胞膜与磁性纳米颗粒的重量配比称取相应的红细胞膜溶液和纳米磁性颗粒溶液，混匀；优选地，所述每100ml磁性粒子溶液的制备方法：取纳米磁性四氧化三铁粒子5mg，加水至100ml，形成磁性粒子溶液；所述每10ml红细胞膜溶液的制备方法：取红细胞膜50μg，加水至10ml，形成红细胞膜溶液；和/或，所述混合后，室温放置30分钟；和/或，震荡后离心，去除上清，得红细胞包裹的纳米磁性颗粒。本发明还提供了前述红细胞包裹的纳米磁性颗粒在制备心肌梗死动物模型中的用途。本发明还提供了一种心肌梗死动物模型的造模方法，它包括如下步骤：4)取受试动物，以心尖搏动点为中心固定在磁场发生器特定位置；5)施入前述的红细胞膜包裹的纳米磁性颗粒；6)在磁场强度为0.1μt的条件下作用30min，即可。所述的受试动物是大鼠。步骤2)中，所述施入是静脉输入。本发明还提供了一种筛选治疗心肌梗死药物的方法，它包括如下步骤：a、取受试药物；b、将受试药物施用于前述方法制备的心梗动物模型；或者，将受试药物施用于动物，再按照前述方法制备的心梗动物模型；c、观察模型动物的心肌梗死指标的变化，判断药物的预防或治疗效果。所述心肌梗死指标包括：血肌钙蛋白i(troponini)、血浆angⅱ水平，或者心肌梗死面积心电图、心脏ct以及、肌酸激酶同工酶(ck-mb)、肌红蛋白(myoglobin)及脑利钠肽(bnp)等指标改变。本发明心肌梗死动物模型对心肌梗死的预防、诊断和治疗具有极其重要的价值，本发明跳出以往通过冠状动脉结扎制备心肌梗死动物模型的思路，构建携磁人工红细胞并回输动物体内，用体外磁场控制携磁人工红细胞的局部聚集导致心脏局部血管阻塞，引发局部心肌梗死。这样完全避免血管结扎造成的重大创伤，得到能真实模拟心肌梗死发生过程的动物模型，对相关研究治疗具有极为重大的意义。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明图1、造模后心肌纤维化、骨化、色素沉着、单核细胞浸润图2、造模后心外膜增厚、心肌纤维化图3、造模后masson染色提示出现明显纤维化改变具体实施方式实施例1本发明红细胞膜包裹的纳米磁性颗粒的制备1、磁性纳米颗粒制备方法本实施例采用的磁性纳米颗粒为纳米磁性四氧化三铁粒子，可以采用如下方法制备，也可采用直接购买的方式获得。其中，四氧化三铁粒子的形状为球体，粒径分布为500～2000nm，平均粒径在900～1000m。纳米磁性四氧化三铁粒子的制备方法如下：1.1、试剂和仪器fecl3·6h2o(ar)、feso4·7h2o(ar)、去离子水、0.25mol/lnaoh(ar)、0.4mol/l硅酸钠(na2sio3·9h2o)(分析纯)、氯化铵(nh4cl)(分析纯)、无水乙醇(分析纯)；控温磁力搅拌器、ph计、高速离心机、三口烧瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、ph试纸1.2、制备方法将二价铁盐(feso4·7h2o)和三价铁盐(fecl3·6h2o)溶液按物质的量比为1：2的比例混合，铁盐总浓度为0.5mol/l，取铁盐溶液5ml加入到三口烧瓶中，加入200ml蒸馏水，温度控制在(30±1)℃，连续通入氮气，再将0.25mol/lnaoh缓慢滴加到三口烧瓶中至ph＝10，剧烈搅拌，高温恒温(100℃)水浴晶化。混合液由橙红色逐渐变成黑色后，再继续搅拌15min后结束反应，离心，得四氧化三铁颗粒，用蒸馏水反复洗涤直至ph＝7，移去上层清液，将产物在80℃下保温30min，使之陈化，研磨，即得纳米磁性四氧化三铁粒子。2、红细胞膜提取方法红细胞膜的性状是决定携磁人工红细胞质量的主要因素。本研究采用低渗法制备红细胞膜。2.1、实验材料2.1.1.红细胞的选择大鼠红细胞在无菌条件下从尾静脉采集，并且在采集24小时内使用。2.1.2.试剂制备红细胞膜所需试剂：新鲜红细胞，十二烷基硫酸钠(sds)，0.02mpbs2.2、方法与结果：2.2.1.取红细胞用生理盐水洗涤3次，最后彻底倾去上清，得压积红细胞。2.2.2.取1ml压积红细胞，加入10ml纯化水，室温充分混匀5min，5000rpm，离心10min,去上清，重复用纯化水洗涤3次，每次10ml至上清无色，再用生理盐水洗涤2次，最后一次彻底倾去上清，所得沉淀即为红细胞膜，4℃备用。3、携磁人工红细胞(红细胞膜包裹的纳米磁性颗粒)构建方法携磁人工红细胞制备方法纯化的红细胞膜与纳米磁性颗粒混合，室温作用30分钟，轻轻震荡，红细胞膜会包裹纳米磁性颗粒表面，形成携磁人工红细胞。其原理在于红细胞膜为脂质双分子层结构，其理化特征为:当脂质双分子层达到一定浓度时会迅速自发形成球状物，以使其达到最小体积。当红细胞膜遇到纳米磁性颗粒时就会以纳米磁性颗粒为中心，形成膜包被的磁珠。3.1材料：红细胞膜、磁性粒子3.2方法：将膜红细胞膜与纳米磁性颗粒按以下重量比例3:1、2:1、1:1、1:2、1:3混匀，室温放置30分钟，轻轻震荡，最后用生理盐水配成浓度为2％的悬液，4℃备用。具体步骤：制备纳米磁性颗粒溶液：取纳米磁性四氧化三铁粒子5mg，加水至100ml，形成磁性粒子溶液；制备红细胞膜溶液：取红细胞膜50μg，加水至10ml，形成红细胞膜溶液；按照膜红细胞膜与纳米磁性颗粒按以下重量比例3:1、2:1、1:1、1:2、1:3，取相应体积的红细胞膜溶液和纳米磁性颗粒溶液，混匀，室温放置30分钟，轻轻震荡，离心，去除上清，最后用生理盐水配成浓度为2％的悬液(浓度为2％是指红细胞膜包裹的纳米磁性颗粒占总悬液的体积的2％，也就是相当于2ml的红细胞膜包裹的纳米磁性颗粒稀释至100ml所得的悬液)，4℃备用。经过检测，红细胞膜与纳米磁性颗粒的重量比2:1或者1:1制备的红细胞膜包裹的纳米磁性颗粒质量较优，因此，本发明优选地红细胞膜包裹的纳米磁性颗粒的制备方法如下：将红细胞膜与纳米磁性颗粒按重量比2:1或者1:1混匀，室温放置30分钟，轻轻震荡，最后用生理盐水配成浓度为2％的悬液，4℃备用。实施例2采用红细胞膜包裹的纳米磁性颗粒制备心肌梗死的动物模型1、红细胞膜包裹的纳米磁性颗粒的制备按照实施例1的优选方法制备，其中，红细胞膜与纳米磁性颗粒按重量比2:1混混匀。2、携磁人工红细胞诱发大鼠心肌梗死方法安静状态下，取尾静脉抽取1.5ml血液标本标记号留存。将大鼠以心尖搏动点为中心固定在磁场发生器中央，尾静脉输入2％携磁人工红细胞800ul，启动磁场发生器(其中，磁场强度0.1μt，作用30min)，观察大鼠的心率、血流动力学变化包括舒张压和收缩压，检测尾静脉血肌钙蛋白i(troponini)和血浆angⅱ水平改变。把大鼠尾静脉空气栓塞法处死。切片观察观察心脏组织学改变。实验对照组(又称假手术组)为无磁场作用的注射携磁人工红细胞大鼠，空白对照组为无磁场作用未注射携磁人工红细胞大鼠。3、指标检测结果(1)证明心肌梗死的关键指标1)大鼠尾静脉血肌钙蛋白i表1不同组别肌钙蛋白变化组别造模前肌钙蛋白i造模后肌钙蛋白i空白对照组0.0257±0.0170.0266±0.013实验对照组0.0273±0.0150.0281±0.019本发明模型组0.0216±0.01245.11±36.31*由表1可以看出，造模前后相比，空白对照组大鼠肌钙蛋白i无显著差异；实验对照组造模前后肌钙蛋白i无显著差异；本发明模型组造模前后相比，肌钙蛋白i存在显著差异，表明携磁人工红细胞聚集造成的心肌损伤作用明显。2)心肌的梗死面积表2三组大鼠梗死面积的比较由表2可以看出，空白对照组与实验对照组(假手术对照组)没有心肌梗死，本发明模型组大鼠心肌梗死面积显著增加，提示造模后，大鼠发生急性心肌梗死，梗死面积显著增加。3)血浆angⅱ水平的影响表3各组大鼠血浆angⅱ的比较注：方差不齐，p<0.05具有显著差异。由表3可以看出，实验对照组的血浆angⅱ显著低于本发明模型组(p<0.05)，而本发明模型组则显著高于其他组(p<0.05)。4)大鼠心肌组织病理学检查的影响造模后，通过组织病理学检查，he染色发现模型组动物的心肌出现了一些纤维化、骨化、心脏外膜增厚等变化(图1、图2)。masson染色发现，心肌细胞出现明显的纤维化改变。(图3)从组织病理学角度，证明本方法造模后，动物的心肌细胞会出现典型的心肌纤维化现象，综合表1～表3以及图1～图3可以知道，空白对照组和假手术组(实验对照组)未出现心肌梗死，肌钙蛋白i和血浆angⅱ水平的水平均较低，而采用本发明方法造模，制备的模型组出现了心肌梗死，梗死面积高达41.2±3.0％，肌钙蛋白i和血浆angⅱ水平的水平大幅度提高，符合心肌梗死模型的标准，证明造模成功。(2)其他指标1)造模ami后心率(hr)的影响表4各组大鼠心率(hr)的比较由表4可以看出，模型组与假手术组、空白对照组的心律无显著差异，p＞0.05。2)造模ami后收缩压(sbp)的影响表5各组大鼠收缩压(sbp)的比较由表5结果可以看到，实验对照组(假手术对照组)的收缩压显著地高于本发明模型组即急性心梗(ami)造模成功组(p<0.001)，而本发明模型组则显著低于其他组(p<0.001或p<0.01)，实验对照组与空白对照组之间没有显著差异(p＞0.05)。3)造模ami后舒张压(dbp)的影响表6各组大鼠舒张压(dbp)的比较由表6结果可以看到，实验对照组(假手术对照组)的舒张压显著地高于本发明模型组(ami造模成功组)(p<0.001)，而a本发明模型组则显著低于实验对照组(假手术对照组)及空白对照组(p<0.001)，空白对照组与实验对照组(假手术对照组)没有显著差异(p＞0.05)。4)造模对ami后左室收缩压的影响表7各组大鼠左室收缩压(lvsp)的比较注：方差不齐，p<0.05具有显著差异。由表7结果可以看到，实验对照组(假手术对照组)的左室收缩压(lvsp)显著地高于本发明模型组(ami造模成功后)(p<0.05)，而本发明模型组ami造模成功后则显著低于空白对照组(p<0.05)，空白对照组与实验对照组(假手术对照组)之间没有显著差异(p＞0.05)。可以看出，而本发明方法造模，制备的模型组的除了心率没有发现明显变化，其他血流动力学指标，如收缩压、舒张压和左室收缩压等均出现了明显变化。本发明模型组造模成功后，大鼠发生急性心肌梗死，大鼠死亡4只，其余大鼠出现血流动力学紊乱，收缩压、舒张压、左室收缩压迅速降低。。实施例3采用动物模型筛选心肌梗死的治疗药物采用实施例2制备的心肌梗死模型，按照如下步骤筛选：a、取受试药物；b、将受试药物施用于实施例2制备的心肌梗死模型；c、观察模型动物的血肌钙蛋白i(troponini)、血浆angⅱ水平以及心肌梗死面积的变化，判断药物的治疗效果。若血肌钙蛋白i(troponini)、血浆angⅱ水平明显下降，肌梗死面积明显减小，则说明药物有治疗效果，反之则证明没有治疗效果。或者，a1、取受试药物；b1、将受试药物施用于动物，按照实施例2的方法制备的心肌梗死模型；c1、观察模型动物的血肌钙蛋白i(troponini)、血浆angⅱ水平以及心肌梗死面积的变化，判断药物的治疗效果。若血肌钙蛋白i(troponini)、血浆angⅱ水平相比未使用受试药物的动物模型明显下降，肌梗死面积明显减小，则说明药物有预防效果，反之则证明没有预防效果。综上，本发明采用红细胞膜包裹的纳米磁性颗粒，成功地制备了心肌梗死模型，可以用于心肌梗死药物的筛选。本发明造模方法无需采用手术方法，仅需静脉输入红细胞膜包裹的纳米磁性颗粒后，在磁场下作用一段时间即可成功造模，避免血管结扎造成的重大创伤，得到能真实模拟心肌梗死发生过程的动物模型，同时，制备方法简便，无需专业的医学人员，普通技术人员操作即可实现，对相关研究治疗具有极为重大的意义。当前第1页12