本发明涉及医学影像学显像
技术领域：
，特别是在荧光腔镜下恶性肿瘤的精准切除手术。
背景技术：
恶性肿瘤已成为威胁人类健康的首要疾病，2010年我国居民每死亡5人中，即有1人死于癌症，预计到2020年每年将有2000万起新的癌症病例，而癌症患者死亡人数将突破1000万人。现在实体肿瘤患者治疗方式仍以手术切除为主，辅以化疗、放疗和分子靶向治疗。而癌症患者的治疗关键是早发现、早干预。影像学检查ct/mr/pet/b超和实验室检查已经成为临床医生诊断早期肿瘤的依据，但是现有的诊断方法特异度及敏感度仍有不足之处，研究者们仍在努力研发特异的诊断方法指导临床诊疗决策。譬如宫颈癌患者标准手术治疗需清扫盆腔淋巴结，但如果研发出一种特异性诊断方法决定宫颈癌患者是否有淋巴结转移或者有哪几个淋巴结是有肿瘤转移的，将减少不必要的盆腔淋巴结清扫。在专利号为2007101878437的申请中，我们发明了一种特异性靶向肿瘤及其转移灶的导向性多肽，命名为tmtp1。tmtp1是利用细菌鞭毛肽库展示技术高转移前列腺癌细胞系pc-3m-1e8和不转移前列腺癌细胞系pc-3m-2b4进行四轮正负筛选，免疫荧光法体外验证特异地与pc-3m-1e8细胞亲和的细菌克隆获得重复性序列(nvvrq)，我们对多肽序列进行改造，改造为g(cgnvvrqgc)二硫键成环，以增加其在体内的稳定性。体外实验验证tmtp1对高转移肿瘤细胞有高亲和性而对低转移肿瘤细胞低亲和性。体内实验验证tmtp1能够靶向于高转移肿瘤的原发灶及微转移灶。在专利号为2012103403857、2012103658343、2013103540685的申请中，我们将tmtp1分别连接抗菌肽(tmtp1-kla)、白喉毒素(dt390-tritmtp1)及放射性核素((99m)tc-hynic/edda-tmtp1)，发现tmtp1能够携带相应的制剂，靶向地到达肿瘤部位，达到治疗肿瘤或者显像肿瘤的效果。分子诊断已成为许多恶性肿瘤靶向治疗及预后判断的主要指标，如乳腺癌her2，er和pgr2阳性的病人可以选择赫塞丁trastuzumab及雌激素受体拮抗剂等。肿瘤血管vegfreceptor如果表达阳性，可以选择贝伐单抗抑制血管生成。奥曲肽和rgd多肽是目前临床应用最经典的分子诊断及治疗的多肽。(99m)tc-edda/hynic-toc那能够很好的诊断神经分泌型肿瘤如胰腺癌、脑胶质瘤等，[18f]galacto-rgd能够对新生血管能力强的肿瘤进行诊断。吲哚菁绿(indocyaninegreen,icg)，是一种高灵敏近红外荧光素，其已经被美国fda批准用于临床。其安全性较高，且已有基于icg开发的荧光腹腔镜应用于临床。icg静脉注射至人体后，98％-99％的icg与血浆高分子蛋白(如白蛋白)结合，icg-蛋白质复合物的激发波长为750-810nm，在近红外区，此区间生物组织的透射性达到最大。欧美国家主要将其用于眼部血管造影、心输出量测定、肝功能评估，近年来有大量关于icg在肿瘤的诊断、治疗方面的研究。在荧光腹腔镜下将icg用于宫颈癌、子宫内膜癌的前哨淋巴结显像，增加了前哨淋巴结活检的阳性率。因此icg是一个很好的前哨淋巴结指示剂，但是其对淋巴结的显像存在明显的局限性，缺乏特异性，无法区分肿瘤转移的淋巴结与炎性增生的淋巴结。peg修饰在蛋白及多肽的药物开发中是一项成熟的技术，以增加水溶性、生物相容性和药物作用时间。peg(聚乙二醇)是一种ph中性，无毒，水溶性较高的亲水聚合物，其重复单元为氧乙烷基，端基为两个羟基,呈线性或支化链状结构。peg聚合物是迄今为止已知聚合物中蛋白和细胞吸收水平最低的聚合物，由于peg无毒及良好的生物相容性，peg已被fda批准可作为体内注射药用聚合物。当peg藕联到药物分子或药物表面时，可以将其优良性质赋予修饰后的药物分子，改变它们在水溶液中的生物分配行为和溶解性，在其修饰的药物周围产生空间屏障，减少药物的酶解，避免在肾脏的代谢中很快消除，从而可以有效地延长药物的半衰期，增强药物的稳定性；peg修饰后的药物水溶性一般均增加,药物通过改变分子结构从而改进了药物动力学和药效等性质，提高了作用部位的血药浓度。但同时peg引入也会带来新的问题，比如药物系统清除减慢，药物长期滞留体内可能发生中毒现象，以及药物自血液向目标组织的输送速度也会受到限制。因此，如何设计peg桥接方式以及peg链的长短对药物的设计至关重要。临床上对于分期在ia2期及以上的宫颈癌患者无论是否有淋巴结转移，常规进行淋巴结清扫，造成部分患者术后淋巴回流障碍，下肢水肿，影响患者术后的生活质量。因此迫切需要研发一种技术鉴别有无淋巴结转移，进而决定是否进行淋巴结清扫术。阴道镜最主要是用于评估子宫颈细胞学检查结果异常的女性，其检查的目的是通过识别细胞学检查所发现的异常细胞来源，结合阴道镜下直接活组织检查结果、病理类型以及级别进行诊断，并通过确定子宫颈的病变范围来确定适宜的治疗方法。阴道镜的局限性在于不能看到子宫颈管内的病变，也不易鉴别有无间质浸润，在诊断子宫颈病变方面受到一定限制，尤其是绝经后的妇女。因此，在阴道镜下宫颈活检取样时需要有可靠的指示剂来指导取样。icg连接tmtp1为解决此类问题提供了一种可能。常规的icg不能直接连接多肽，我们尝试用icg的衍生物icg-osu通过(peg)n来桥接tmtp1，icg-osu为氨基反应性，而tmtp1为羧基反应性，二者分别连接于(peg)n的两端，此方式icg连接多肽属于首创。目前，荧光腹腔镜已在临床上得到应用，icg-osu-(peg)n-tmtp1将是具有良好应用前景的肿瘤分子靶向的荧光显像剂。技术实现要素：为了克服传统的icg显像肿瘤特异性低的缺点，本发明提供了一种肿瘤靶向近红外荧光显像剂icg-osu-(peg4)n-tmtp1，在原有的肿瘤靶向多肽tmtp1(nvvrq)的基础上进行设计改造，获得了结构式为icg-osu-(peg)n-g(cgnvvrqgc)的荧光显像剂，利用该显像剂不仅用于肿瘤诊断，还用于荧光腔镜手术中引导病灶的精准切除，用于荧光阴道镜中指导宫颈活检的取样。本发明的技术方案如下：tmtp1能特异性靶向于高侵袭转移的肿瘤细胞，将其设计成环状结构cyclic(cgnvvrqgc)g，以增加其稳定性，通过(peg)n与icg-osu共价连接，构建为本发明所示的新的显像剂icg-osu-(peg)n-tmtp1。一方面此显像剂仍保持肿瘤的靶向特性，能够特异性结合于恶性肿瘤的原位灶及转移灶。另一方面icg的荧光特性也保持不变，在带有荧光激发器的成像设备下，能够清晰显示荧光图像。peg两端的活性羟基可以修饰蛋白和多肽，可以改善生物相容性和药物作用时间，但peg的引入修饰带来新的技术问题，系统清除越慢，药物长期滞留体内可能发生中毒现象，以及药物自血液向目标组织的输送速度也会受到限制。在此处，我们通过大量的细胞毒性实验、体外的靶向性实验，一方面通过设计peg桥接结构以及peg链，其一端连接icg-osu的氨基，另一端连接tmtp1的羧基。由此设计而来的显像剂水溶性增强，体内循环时间延长，在体内1-2h肝肾聚集最多，在6h以后主要滞留于靶向的肿瘤部位，既安全有效，又利用此时间差有效的去除了非特异性结合所导致的荧光背景。本发明提供的显像剂为一种稳定的化合物，无细胞毒性，副作用少，同时在前期的临床实验研究中，局部给药或静脉给药后在任何配置有荧光检测系统的仪器(荧光腹腔镜、荧光阴道镜等)下能够显像，为临床上微小病灶的检出及精准切除提供了新的思路。具体地本发明提供一种肿瘤靶向近红外荧光显像剂，其结构式为icg-osu-(peg)n-g(cgnvvrqgc)，其中icg为近红外荧光显像剂吲哚菁绿，icg-osu为磺酸基吲哚菁绿活化脂，g(cgnvvrqgc)为肿瘤靶向环状多肽tmtp1，聚乙二醇(peg)桥接，其中n为2到20的整数。优选n为3-10的整数，更优选n为4、5、6、7，最优选n为4。其中icg-osu是icg的氨基反应性衍生物，环状多肽tmtp1为羧基反应性。本发明所述的肿瘤靶向近红外荧光显像剂icg-osu-(peg)n-tmtp1，具体的合成步骤为:1)利用固相载体根据设计的氨基酸序列合成多肽gcgnvvrqgc，共价连接至(peg)n；2)将多肽从树脂上切除下来，用meoh/i2进行氧化，将多肽序列通过二硫键搭桥形成环状，即(peg)n-g(cgnvvrqgc),然后进行分离、提纯、冻干；3)将步骤2)所得的产品与icg-osu按1:1混合，溶解在dmf里，然后加2倍体积的diea，反应10分钟，lcms鉴定反应完全后，分离、提纯、冻干，得到本发明所述的显像剂icg-osu-(peg)n-tmtp1。本发明的肿瘤靶向近红外荧光显像剂还可以进一步用于在制备肿瘤诊断试剂中应用，所述肿瘤选自宫颈癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、肾癌，优选宫颈癌、乳腺癌。本发明的肿瘤靶向近红外荧光显像剂在区分肿瘤转移的淋巴结与炎性增生的淋巴结诊断试剂中的应用。本发明的肿瘤靶向近红外荧光显像剂还可以在制备荧光腔镜手术中引导肿瘤病灶及淋巴结转移灶的切除指示试剂中的应用，所述肿瘤为宫颈癌、乳腺癌。本发明的肿瘤靶向近红外荧光显像剂可以在制备荧光阴道镜中取样指示试剂中应用，其特征在于，所述肿瘤为宫颈癌。我们检测了本发明所述显像剂icg-osu-(peg)n-tmtp1的理化性质，根据本显像剂的体外细胞结合效率，最优选n为4，通过细胞实验、动物实验检测了icg-osu-peg4-tmtp1的安全性及肿瘤靶向性。所合成的显像剂纯度高，荧光性质与icg一致。cck-8试验证明其对肿瘤细胞系、正常细胞系均没有毒性；小鼠的急性毒性实验证明其对小鼠脏器无毒副作用，安全性高；细胞结合实验证明其能与肿瘤细胞特异性结合，效果明显优于icg；接种宫颈癌细胞、乳腺癌细胞的荷瘤小鼠动物实验证明其能与肿瘤组织特异性结合，效果明显优于icg；乳腺癌淋巴转移模型小鼠动物实验证明其能特异性显像肿瘤转移淋巴结。本显像剂目前正在进行ii期临床试验(注册号：chictr-inr-17013087)，用于宫颈癌术中指导淋巴结的精准清扫，初步表现出优于icg的特异性指示效应。与现有的技术相比，本发明的有益效果是：与目前fda唯一批准用于人体的近红外荧光显像剂icg相比，icg-osu-peg4-tmtp1在稳定、安全的前提下，显像肿瘤病灶及淋巴转移灶的特异性更好，应用前景更广泛。附图说明图1为icg-osu-peg4-tmtp1的合成路线图。图2为icg-osu-peg4-tmtp1的质量检测图。图3为icg-osu-peg4-tmtp1的细胞毒性实验结果。图4为icg-osu-(peg)n-tmtp1与肿瘤细胞结合效率图。图5为icg-osu-peg4-tmtp1的细胞结合实验结果。图6为icg-osu-peg4-tmtp1的体内分布及药代动力学检测结果。图7为hela-luc荷瘤鼠icg-osu-peg4-tmtp1与icg的显像对比结果。图8为4t1-luc荷瘤鼠icg-osu-peg4-tmtp1与icg的显像对比结果。图9为4t1淋巴结转移荷瘤鼠icg-osu-peg4-tmtp1与icg的显像对比结果。图10为icg-osu-peg4-tmtp1临床试验中的其中一例结果。具体实施方式以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例1制备icg-osu-peg4-tmtp1参见图1，icg-osu-peg4-tmtp1的制备流程为：1)利用固相载体根据设计的氨基酸序列合成多肽gcgnvvrqgc，共价连接至peg4；2)将多肽从树脂上切除下来，用meoh/i2进行氧化，将多肽序列通过二硫键搭桥形成环状，即peg4-g(cgnvvrqgc),然后进行分离、提纯、冻干；3)将步骤2)所得的产品与icg-osu按1:1混合，溶解在dmf里，然后加2倍体积的diea，反应10分钟，lcms鉴定反应完全后，分离、提纯、冻干，得到本发明所述的显像剂icg-osu-peg4-tmtp1。该合成过程委托上海药明康德新药开发有限公司完成参见图2，图2a和2b通过液相质谱和色谱联用(lc-ms，agilent1200hplc&6410triplequad，美国)检测证明了本发明所示显像剂的正确合成，图2c是通过高效液相色谱仪(hplc，agilent1200，美国)检测本显像剂的纯度(＞95％)，图2d是通过紫外分光光度计(jh754pc，上海，中国)检测的该显像剂的吸光谱，其峰值与icg一致。实施例2细胞毒性试验：1.细胞培养鼠乳腺癌细胞系4t1(购自美国atcc细胞库)用含有体积分数10％胎牛血清的rpmi-1640培养基(gibco，thermofish公司，美国)培养，宫颈癌细胞系hela、siha(购自美国atcc细胞库)和正常皮肤角化上皮细胞(购自中国cctcc细胞库)用含有体积分数10％胎牛血清的dmem培养基(gibco，thermofish公司，美国)培养，宫颈上皮内瘤变细胞系s12(由英国kennethraj教授赠予)用含有体积分数5％胎牛血清、5μg/ml胰岛素(sigma-aldrich，美国),8.4ng/ml霍乱毒素(sigma-aldrich，美国),24.3μg/ml腺嘌呤(sigma-aldrich，美国),0.5μg/ml氢化可的松(sigma-aldrich，美国)和10ng/ml内皮生子因子(egf，peprotech)的f12与df12培养基(gibco，thermofish公司，美国)按1：1比例配置培养。以上细胞均在37℃，含5％c02的培养箱培养。2.cck-8试验分别将4t1、siha、hela、s12、hacat细胞按照1*104个/孔的密度种96孔板，在37℃，5％co2培养箱培养24h后，置换入分别含有0,3.125,6.5,12.5,25,50umol/licg-osu-peg4-tmtp1的新鲜培养基，每组设置3个副孔。孵育24h后，吸出培养基，换入cck-8试剂(dojindomoleculartechnologies，japan)，孵育2.5h之后，在酶标仪(biorad,美国)波长450nm下测od值。细胞活性度计算公式为：viablerate＝(odtreated-odblank)/(odcontrol-odblank)*100％。实验结果参见图3，无论是癌细胞还是正常细胞，无论药物浓度高低，均对细胞的增殖无明显影响。实施例3不同peg数目下肿瘤细胞结合效率实验按实施例1中所示方法合成不同peg数目的该显像剂，分别取n＝2,4,6,8,10，20。如实施例2中所示方法培养4t1细胞、hela细胞，将4t1、hela细胞按照1*105个/孔的密度种24孔板，隔夜培养后，各孔分别加入500ul1μm的icg，icg-osu-(peg)n-tmtp1，加入pbs的孔作为空白对照，冰上孵育20分钟后，用冷的pbs洗3遍，置于小动物活体成像仪下采集孔板的荧光图片。再通过ivis显像软件的roi工具对各孔的荧光值进行定量分析。实验结果参见图4，图4a为4t1细胞在不同peg数目的本显像剂孵育后的荧光图像，图4b为各孔荧光强度的定量分析。说明取n＝4时，本显像剂与肿瘤细胞具有最佳的结合效率。在hela细胞实验中亦得到一致的结果。该实验表明peg链及其数目将显著影响显像剂与肿瘤细胞的结合效率。实施例4体外细胞结合实验细胞培养如实施例2中所示，分别将4t1、siha、hela、s12、hacat细胞按照1*105个/孔的密度种6孔板，培养48h待细胞密度达到80％时，分别加入1ml1μmicg-osu-peg4-tmtp1或icg，pbs作为对照组，冰上孵育1h后用胰酶溶液(含有质量分数为0.25％的胰酶和质量分数为0.1％的edta)消化收集细胞，pbs洗2遍后用流式细胞仪(bdfacscalibur,美国)分析icg通道细胞的荧光阳性率。实验结果参见图5，对于肿瘤细胞系4t1、siha、hela，icg-osu-peg4-tmtp1的结合明显高于icg，对于癌前病变细胞系s12和正常细胞系hacat，两者均结合少。实施例5体内分布和药代动力学实验正常的balb/c小鼠(购自北京华阜康生物科技股份有限公司)尾静脉给100ul、25umol/l的icg-osu-peg4-tmtp1，不同时间点(30min、1h、2h、12h、24h、48h)在小动物成像仪(perkinelmer,美国)下进行显像(ex/em745/840nm)，在各时间点解剖小鼠，摘取主要脏器(心、肝、脾、肺、肾、结肠)进行显像，再通过ivis显像软件的roi工具对各时间点各脏器荧光值进行计量，每组3只老鼠。实验结果参见图6，图6a、6b分别为各个时间点小鼠和脏器的典型显像图，图6c为各脏器荧光量化统计图，表1为对应的统计表。说明icg-osu-peg4-tmtp1通过肝脏、肾脏两条途径代谢，给药1h在肝脏聚集最多，给药2h在肾脏聚集最多，之后迅速清除。在给药24h后肝脏清除达95.9％，肾脏清除达88.4％。48h后肝脏清除达96.1％，肾脏清除达94.4％。表1：体内分布和药代动力学实验结果heartliverspleenlungkidneycolon30min9.11e+082.55e+106.57e+084.16e+093.61e+094.71e+091h7.73e+082.66e+104.37e+083.24e+093.47e+096.17e+092h6.86e+081.86e+105.16e+082.68e+093.72e+095.82e+0912h8.20e+075.56e+091.12e+085.24e+081.03e+095.40e+0824h3.17e+071.11e+095.32e+073.44e+084.33e+082.98e+0848h3.39e+071.03e+094.81e+072.34e+082.09e+081.18e+08实施例6体内肿瘤靶向实验将人宫颈癌细胞系hela、鼠乳腺癌细胞系4t1转染荧光素酶(luciferase)慢病毒，使其能通过检测生物素光来实时监测肿瘤的大小。培养扩增hela-luc细胞，1×107个/只接种至4周的balb/c-nude小鼠(购自北京华阜康生物科技股份有限公司)左后背，3周后肿瘤生长至直径约1cm，尾静脉给100ul、25umol/l的icg-osu-peg4-tmtp1或者icg后，在小动物成像仪下显像(1h、2h、6h、12h、24h、48h)，解剖摘取肿瘤组织及各脏器显像，每组3只老鼠。培养扩增4t1-luc细胞，1×105个/只接种至4周的balb/c小鼠(购自北京华阜康生物科技股份有限公司)右侧乳房垫，3周后肿瘤生长至直径约1cm，如前述方式进行体内靶向性实验。实验结果参见图7、图8，图7a、8a为生物素光模式下的显像图，说明了皮下瘤模型的成功建立，图7b、8b为icg荧光模式下各个时间点的典型显像图，图7c、8c是两者在不同时间点的典型脏器荧光显像图。图7d、8d为利用roi工具测量肿瘤组织及鼠耳(作为对照)的荧光值，用graphpadprism5.0软件对icg-osu-peg4-tmtp1组和icg组各时间点t/nratio作的统计图。说明icg-osu-peg4-tmtp1的肿瘤靶向能力明显优于icg，能够与肿瘤组织特异性结合。实施例7小鼠转移淋巴结特异性显像实验扩增鼠乳腺癌细胞系4t1，以4×105个/ml的密度25ul/只局部接种至4周的balb/c小鼠，3周后观察淋巴结明显肿大，脚垫肿瘤局部给药20ul、25umol/l的icg-osu-peg4-tmtp1或者icg后，在小动物成像仪下显像(2h、12h、24h)，显像结束后解剖淋巴结，石蜡包埋切片后进行he染色，进一步确定肿瘤淋巴结转移模型的建立。实验结果参见图9，图9a为icg荧光模式下各个时间点的典型显像图，图9b为利用roi工具测量不同时间点转移淋巴结处的荧光值，用graphpadprism5.0软件对icg-osu-peg4-tmtp1组和icg组各时间点作的统计图。说明icg-osu-peg4-tmtp1的靶向肿瘤转移淋巴结的能力明显优于icg，能够与肿瘤转移淋巴结特异性结合。实施例8异常毒性实验选取4周龄balb/c小鼠(购自北京华阜康生物有限公司)15只，随机分为3组(尾静脉注射组、脚垫局部注射组、对照组)，每组5只，试验前和试验的整个观察期均按正常饲养条件饲养，实验前称老鼠的体重。尾静脉注射组每只小鼠注射100ul、250umol/l的icg-osu-peg4-tmtp1，局部注射组每只小鼠脚垫注射25ul、250umol/l的icg-osu-peg4-tmtp1，空白对照不做处理。7天内观察各实验组和对照组小鼠饮食、呼吸、活动、反射、排便、痛觉、皮肤。7天后称每个小鼠的体重，眼眶取血测肝肾功能，处死、解剖小鼠，实验组小鼠各脏器颜色、形态。实验结果：药物处理组小鼠在整个实验过程中，未出现死亡，未发现饮食、呼吸、活动、反射、排便、痛觉、皮肤异常。参见表2药物处理组小鼠同未处理组小鼠实验前后体重变化无明显差异(p>0.05)，器官未见明显病变，肝肾功能未见明显差异。表2：异常毒性实验结果实施例9安全性检测1.细菌内毒素检测：根据《中国药典》(2010版)内容，确定供试品内毒素检测水平λ＝0.125eu/ml。先进行灵敏度校验实验，确定鲎试剂灵敏度为0.125eu/m。再进行干扰实验，供试品与检测试剂无干扰反应。实验结果参见表3，凝胶实验检测样品的内毒素水平，证实样品内毒素水平符合要求。表3：2.无菌性检测：取本品1ml，在武汉同济医院检验科微生物临床检验组营养培养基培养3天，未见细菌生长。实施例10icg-osu-peg4-tmtp1在宫颈癌术中的临床应用将本试剂用于宫颈癌术中荧光腹腔镜下指导淋巴结的清扫，具体的用法为：术前30min宫颈局部(3°、9°)注射给药，现配现用，用注射用无菌水溶解粉剂，1mg/ml,各点分别注射200ul显象剂。对于宫颈癌分期为iib期的病人，于阴道中上端左右两侧分别加注200ul显象剂。同样剂量的icg注射液作为对照。分别观察术中荧光腹腔镜下淋巴结显像情况，并常规行广泛子宫切除术+盆腔淋巴结清扫术，术后参照病理科报告的淋巴活检结果，对比两者对转移淋巴结显像的敏感性和特异性。试验结果参见图10，本发明所述的试剂能准确的识别宫颈癌转移阳性的淋巴结。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>武汉凯德维斯生物技术有限公司<120>一种肿瘤靶向近红外荧光显像剂的设计、合成及应用<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>10<212>prt<213>人工序列()<220><221>disulfid<222>(2,10)<400>1glycysglyasnvalvalargglnglycys1510当前第1页12