本发明属于医药学领域，具体涉及一种红葱头提取物及其制备方法与应用。
背景技术：
：缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemicencephalopathy，hie)是各种原因引起的脑组织缺氧缺血导致的脑部病变，最常见的是新生儿缺氧缺血脑病，是导致婴幼儿急性死亡和慢性神经损伤的主要原因之一。新生儿缺氧缺血性脑病是围生期新生儿因缺氧引起的脑部病变，常见的原因有各种原因导致的胎儿宫内窘迫，如脐带绕颈、羊水异常等，也常见于分娩过程及出生后的窒息缺氧，少数可见于其他原因引起的脑损伤。统计学显示，每1000个足月新生儿中有2-4个会发生新生儿窒息，并有将近60％为低体重的早产儿。在患有新生儿窒息的新生儿中，大约20％-50％在新生儿期间死于缺氧缺血性脑病，约25％幸存者可并发永久性神经心理障碍，例如智能障碍，脑性瘫痪，癫痫以及学习困难。新生儿hie的病理机制非常复杂，缺乏有效促神经功能修复的治疗措施，已成为围产医学研究亟待解决的重要课题，探究围生期缺氧缺血性脑损伤的发病机制对于有效干预措施的实施有极其重大的意义。无论何种类型的新生儿缺氧缺血性脑损伤，都会引起脑细胞功能的失常、大量神经元死亡及脑组织水肿等病理性改变，造成患儿不同程度的脑损伤。因此，新生儿缺氧缺血性脑损伤后如何阻止或延缓疾病的进展，减少梗死灶的体积，是目前治疗新生儿缺氧缺血后脑损伤迫切需要解决的问题。我们的前期研究发现，红葱头提取物对培养小鼠海马神经元(ht22细胞)体外糖氧剥夺损伤(ogd)具有保护作用，其作用机制与抑制凋亡相关基因表达有关，提示红葱头提取物可能是一种对神经损伤具有保护作用的中药。据目前研究认为，多种中药来源的红葱头提取物具有神经保护作用，我们在体外针对红葱头提取物神经保护作用进行了预实验。预实验结果显示，红葱头提取物能显著增加小鼠海马神经元ht22细胞糖氧剥夺(ogd)损伤后细胞的细胞活力，且其作用可能与其抗凋亡作用有关，这些结果提示：红葱头提取物中具有神经保护作用的活性成分。在此基础上，本研究采用动物实验和免疫荧光，westernblot等分子生物学方法，通过体内外的研究，证实其神经保护的作用和其抑制凋亡的分子机制。我们的研究将为红葱头提取物在新生鼠缺氧缺血性脑损伤防治中的临床应用提供重要的参考资料和新的理论依据。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种红葱头提取物及其制备方法与应用。本发明提供的红葱头提取物能显著抑制ht22细胞ogd损伤后细胞凋亡，可显著减少新生鼠hibd后脑梗死体积，具有脑保护作用。本发明的技术方案是：红葱头提取物的制备方法，包括以下步骤：s1取干红葱头，粉碎至粒径为40-60目，得红葱头粉末，置于2000ml三角瓶中，加入体积分数为55-65％的乙醇水溶液，乙醇水溶液的添加量为上述红葱头粉末重量的9-12倍，充分搅拌，放入超声波清洗器的清洗槽中进行超声，超声时间为0.5-1.5h，过滤，收集醇液，残渣备用；s2将步骤s1所得残渣进行第二、三次提取，提取步骤与步骤s1相同，将所得醇液与步骤s1所得醇液合并，减压回收乙醇至无醇味，所得浸膏即为红葱头提取物。优选地，所述步骤s1粉碎至粒径为50目。优选地，所述步骤s1加入体积分数为60％的乙醇水溶液。优选地，所述步骤s1所述乙醇水溶液的添加量为上述红葱头粉末重量的10倍。优选地，所述步骤s1超声时间为1h。本发明中，红葱(学名：eleutherinebulbosa(mill.)urb.)是鸢尾科红葱属植物，采用红葱的根。一种对缺氧缺血性脑损伤具有脑保护作用的红葱头提取物，所述红葱头提取物由上述红葱头提取物的制备方法制得。本发明的另一目的在于提供上述的红葱头提取物的制备方法制得的红葱头提取物在制备防治缺氧缺血性脑损伤的药物中的应用。针对红葱头提取物是否在体内具有神经保护作用，我们目前已经建立了新生鼠缺氧缺血性脑损伤(hibd)的动物模型，我们采用此模型通过腹腔注射给药的方式观察红葱头提取物对新生鼠缺氧缺血性脑损伤脑保护作用。结果显示，本发明红葱头提取物可显著减少新生鼠缺氧缺血性脑损伤后脑梗死体积，具有脑保护作用。与现有技术相比，本发明采用了以上技术方案，具有如下的优点和有益效果：(1)本发明提供的红葱头提取物能显著抑制ht22细胞ogd损伤后细胞凋亡，对体外ht22细胞ogd损伤后细胞活力具有保护作用。(2)本发明提供的红葱头提取物可显著减少新生鼠hibd后脑梗死体积，具有脑保护作用。(3)本发明提供的红葱头提取物的制备方法简单，且具有生产周期短、设备简单、成本低、安全无毒等特点，适合工业化生产。(4)本发明为红葱头提取物在缺氧缺血性脑损伤防治中的临床应用提供重要的参考资料和新的理论依据。附图说明图1为红葱头提取物对ht22细胞ogd损伤后细胞活力的影响；图2为红葱头提取物对新生鼠hibd后脑梗死体积的影响；图3为红葱头提取物对pgc1-α蛋白表达的影响；图4为红葱头提取物对sirt1蛋白表达的影响。具体实施方式以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。实施例1、红葱头提取物的制备方法红葱头提取物的制备方法，包括以下步骤：s1取干红葱头，粉碎至粒径为40目，得红葱头粉末，置于2000ml三角瓶中，加入体积分数为55％的乙醇水溶液，乙醇水溶液的添加量为上述红葱头粉末重量的9倍，充分搅拌，放入超声波清洗器的清洗槽中进行超声，超声时间为0.5h，过滤，收集醇液，残渣备用；s2将步骤s1所得残渣进行第二、三次提取，提取步骤与步骤s1相同，将所得醇液与步骤s1所得醇液合并，减压回收乙醇至无醇味，所得浸膏即为红葱头提取物。实施例2、红葱头提取物的制备方法红葱头提取物的制备方法，包括以下步骤：s1取干红葱头，粉碎至粒径为60目，得红葱头粉末，置于2000ml三角瓶中，加入体积分数为65％的乙醇水溶液，乙醇水溶液的添加量为上述红葱头粉末重量的12倍，充分搅拌，放入超声波清洗器的清洗槽中进行超声，超声时间为1.5h，过滤，收集醇液，残渣备用；s2将步骤s1所得残渣进行第二、三次提取，提取步骤与步骤s1相同，将所得醇液与步骤s1所得醇液合并，减压回收乙醇至无醇味，所得浸膏即为红葱头提取物。实施例3、红葱头提取物的制备方法红葱头提取物的制备方法，包括以下步骤：s1取干红葱头，粉碎至粒径为50目，得红葱头粉末，置于2000ml三角瓶中，加入体积分数为60％的乙醇水溶液，乙醇水溶液的添加量为上述红葱头粉末重量的10倍，充分搅拌，放入超声波清洗器的清洗槽中进行超声，超声时间为1h，过滤，收集醇液，残渣备用；s2将步骤s1所得残渣进行第二、三次提取，提取步骤与步骤s1相同，将所得醇液与步骤s1所得醇液合并，减压回收乙醇至无醇味，所得浸膏即为红葱头提取物。试验例一、红葱头提取物对体外ht22细胞ogd损伤后细胞活力的保护作用研究1、试验材料：本发明实施例3制备的红葱头提取物。2、试验方法：体外培养小鼠海马神经元ht22细胞，并采用不同浓度红葱头提取物，并建立体外细胞糖氧剥夺(ogd)细胞损伤模型，体外模拟细胞缺氧缺血性脑损伤，通过采用cck-8细胞活力检测试剂盒检测红葱头提取物对体外ht22细胞ogd损伤后细胞活力的保护作用。具体步骤如下：用dmem-f12培养液加10％的胎牛血清，将小鼠海马神经元ht22细胞接种于上述培养液中，放在37℃、5％co2培养箱中培养，消化、收集对数生长期的细胞，并调整浓度为5×107/l的单细胞悬液，接种于96孔板中，每孔0.2ml，24h后加入以dmem-f12培养液配制的红葱头提取物，终浓度分别为：0μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml、64μg/ml，各浓度红葱头提取物处理的ht22细胞实验组，每组接种8个复孔，置于培养箱中培养2h后，终止培养前每孔加入cck-8液10μl，继续培养2h，在水平摇床摇动5min，在酶标仪450nm处测量吸光度od值，计算出细胞生长抑制率，分析红葱头提取物对ht22细胞ogd损伤后细胞活力的影响。其中，红葱头提取物终浓度为0μg/l时记为con。3、试验结果：不同浓度红葱头提取物对ht22细胞ogd损伤后细胞活力od值检测结果如表1所示。红葱头提取物对ht22细胞ogd损伤后细胞活力的影响如图1所示。表1不同浓度红葱头提取物对ht22细胞ogd损伤后细胞活力od值检测结果组别细胞活力od值con0.201±0.0058μg/ml0.283±0.12616μg/ml0.269±0.07132μg/ml0.341±0.13764μg/ml0.227±0.049表1、图1的结果显示，红葱头提取物能显著抑制ht22细胞ogd损伤后细胞凋亡。试验例二、红葱头提取物对新生鼠hibd的脑保护作用研究1、试验材料：本发明实施例3制备的红葱头提取物。2、试验方法：将新生7天c57bl/6小鼠进行分组：红葱头提取物注射组(实验组)、生理盐水注射组(假手术组)和对照组。采用经典的rice法建立新生鼠hibd损伤动物模型，采用ttc检测脑梗死体积，观察红葱头提取物对新生鼠hibd后脑梗死体积的影响，以探讨红葱头提取物对新生鼠hibd是否具有脑保护作用。具体步骤如下：(1)hibd模型建立：出生7天的c57bl/6小鼠，分组如下：红葱头提取物注射组(实验组)、生理盐水注射组(假手术组)和对照组。实验组术前20min红葱头提取物(1.25mg/ml，100μl)腹腔注射给药，假手术组术前20min腹腔注射生理盐水100μl，对照组不做任何处理。采用异氟醚吸入式麻醉，仰卧四肢固定于小手术板上，酒精颈部皮肤消毒，取颈部正中约1cm切口；钝性分离左侧颈总动脉，用7-0手术线结扎血管近端及远端；缝合皮肤，待苏醒后返回母鼠身旁1h；将新生鼠置入缺氧舱内，通以含8％氧气的氮氧混合气体，37℃水浴恒温，持续4h，流量2l/min；随后返回母鼠身旁喂养。(2)ttc染色：将上述实验组、假手术组和对照组新生鼠麻醉，断头处死，完整取出脑组织并置于鼠脑模具中，于冰上将大脑行冠状切片，每片厚1mm。脑片浸入预先配制好的2％ttc溶液，37℃恒温箱中孵育30min，每隔10min翻片一次。染色后将脑片置于4％多聚甲醛中固定，数码相机拍照，并对图片进行图像处理。黑灰色区域为正常脑组织，苍白色区域为缺血梗死区。3、试验结果：红葱头提取物对新生鼠hibd后脑梗死体积的影响如图2所示。图2的结果显示，红葱头提取物可显著减少新生鼠hibd后脑梗死体积，具有脑保护作用。试验例三、红葱头提取物对新生鼠hibd的保护作用机制研究1、试验材料：本发明实施例3制备的红葱头提取物。2、试验方法：将新生7天c57bl/6小鼠进行分组：红葱头提取物注射组(实验组)、生理盐水注射组(假手术组)和对照组。采用经典的rice法建立新生鼠hibd损伤动物模型，采用westernblot技术检测三组小鼠脑内pgc1-α、sirt1表达的影响，以初步探讨红葱头提取物对新生鼠hibd的保护作用机制。具体步骤如下：(1)hibd模型建立：出生7天的c57bl/6小鼠，分组如下：红葱头提取物注射组(实验组)、生理盐水注射组(假手术组)和对照组。实验组术前20min红葱头提取物(10mg/ml，100μl)腹腔注射给药，假手术组术前20min腹腔注射生理盐水100μl，对照组不做任何处理。采用异氟醚吸入式麻醉，仰卧四肢固定于小手术板上，酒精颈部皮肤消毒，取颈部正中约1cm切口；钝性分离左侧颈总动脉，用7-0手术线结扎血管近端及远端；缝合皮肤，待苏醒后返回母鼠身旁1h；将新生鼠置入缺氧舱内，通以含8％氧气的氮氧混合气体，37℃水浴恒温，持续4h，流量2l/min；随后返回母鼠身旁喂养。(2)westernblot：将上述实验组、假手术组和对照组新生鼠麻醉，断头处死，取脑(取脑及裂解过程全程操作在冰上进行)，加入裂解液及蛋白酶抑制剂，超声破碎仪破碎，15000r/min离心10min，取上清蛋白液。采用bca法测定蛋白浓度定量。取蛋白上清进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后转膜至pvdf膜，采用10％脱脂奶粉封闭1h后，加入pgc1-α、sirt1一抗孵育，4℃过夜，再置于相应的的二抗，37℃下孵育1h，tbst洗涤3次，每次10min。免疫信号采用增强型化学发光法(ecl)曝光到x线胶片。3、试验结果：红葱头提取物对pgc1-α蛋白表达的影响如图3所示，红葱头提取物对sirt1蛋白表达的影响如图4所示。图3、图4的结果显示，红葱头提取物能显著增加pgc1-α、sirt1蛋白表达，我们推测，红葱头提取物可能通过上调pgc1-α、sirt1神经保护轴对新生鼠hibd发挥神经保护作用。当前第1页12