一种多孔生物活性骨水泥及其制备方法与流程

本发明涉及骨损伤修复医用材料技术领域，具体涉及一种多孔生物活性骨水泥及其制备方法。

背景技术

因肿瘤、感染、创伤、骨坏死、老龄化、先天性疾病等各种原因所致的骨缺损、骨不连，均需植骨修复。自体骨移植因兼有骨诱导活性和骨传导作用，被认为是骨移植的“金标准”，但由于自体骨来源有限，不易塑形，取骨处存在较高并发症，使其应用受到限制，而异体或异种骨移植虽然来源方便，但难以避免的异体骨反应也限制了其应用，金属骨移植材料不具有生物活性，多用于骨科临时固定。人工复合骨移植替代材料可以避免上述缺点，但迄今为止，尚无一种材料能达到公认的理想要求。

理想的骨移植替代材料需具备：①良好的生物相容性；②有成骨作用；③一定的力学强度；④能在体内降解吸收；⑤易塑形性；⑥来源广泛，操作简便。目前，大多学者围绕聚甲基丙烯酸骨水泥，硫酸钙骨水泥，磷酸钙骨水泥、羟基磷灰石陶瓷、生物活性玻璃或高分子聚合物与细胞、骨基质、bmp等生物活性物质研制人工骨材料。磷酸钙骨水泥具有优良的生物相容性和骨传导性、可降解性并可以任意塑型，这些特点符合临床上骨修复的要求。但是，单一的磷酸钙骨水泥脆性大，不具有骨诱导活性。骨水泥凝固后的孔隙较小，人体组织难以长入，不具有生物活性。

技术实现要素：

为解决以上技术问题，本发明提供一种多孔生物活性骨水泥及其制备方法。

技术方案如下：一种多孔生物活性骨水泥，其关键在于：由固相和液相按1:0.6-0.9的质量体积比组成，其中按质量比计算，固相由70％-85％的磷酸钙骨水泥、0-15％的聚乳酸-羧基乙酸微球以及余量的骨基质明胶组成，液相为磷酸缓冲液。

上述技术方案，选取具有独特生物降解性的磷酸钙骨水泥作为基体材料，经过与具有强诱导成骨活性的骨基质明胶复合成活性生物骨水泥，进一步加入聚乳酸-羧基乙酸微球制成多孔生物活性骨水泥，构建了兼具骨诱导活性和骨传导作用的可任意塑形的可降解新型复合人工骨移植替代材料。

上述磷酸钙骨水泥由70-90％的β-磷酸三钙、5-10％的无水磷酸氢钙及余量的羟基磷石灰组成。

上述聚乳酸-羧基乙酸微球的含量为5-15％。

上磷酸缓冲液的ph值为6.5-7.5。

上述固相和液相的质量体积比为1:0.7-0.8。

一种多孔生物活性骨水泥的制备方法，其关键在于包括以下步骤：

(1)将可溶性的钙盐和磷酸按1:1.2-1.6的质量比混合后溶解在水中，并调节ph值为7.5-8.6生成絮状磷酸盐沉淀，将其过滤并干燥后在750-850℃下焙烧制得β-磷酸三钙粉末；

(2)将β-磷酸三钙粉末、无水磷酸氢钙和羟基磷石灰按比例混合得到磷酸钙骨水泥；

(3)将所述磷酸钙骨水泥、骨基质明胶和聚乳酸-羧基乙酸微球按比例混合，并振荡均匀得到所述固相；

(4)将磷酸缓冲液加热至37℃，按比例将所述磷酸缓冲液加入所述固相中，搅拌均匀即可。

上述钙盐为氯化钙或磷酸氢钙。

还包括粉碎，将所制得的β-磷酸三钙粉末粉碎成140-180目后再与无水磷酸氢钙和羟基磷石灰混合。

上述粉碎方法具体为将所述β-磷酸三钙粉末在球磨机中以300～350r/min的转速用玛瑙球磨2～4小时。

有益效果：本发明选取具有独特生物降解性的磷酸钙骨水泥作为基体材料，经过与具有强诱导成骨活性的骨基质明胶复合成活性生物骨水泥，进一步加入聚乳酸-羧基乙酸微球制成多孔生物活性骨水泥，构建了兼具骨诱导活性和骨传导作用的可任意塑形的可降解新型复合人工骨移植替代材料。

附图说明

图1为不同产品的降解形貌；

图2不同产品的大鼠骨髓间充质干细胞与骨水泥材料浸提液共培养的第21天茜素红染色所见的矿化状态；

图3不同产品的硬组织切片甲苯胺蓝染色(×200)；

图中a代表产品1，b代表产品2，c代表产品3。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

实施例1，骨基质明胶(bgm)的提取，具体方法如下：

(1)取材：取新鲜长管状骨干，剔除周围软组织、刮除骨膜、去除干骺端，流水清洗后咬成直径2～3mm3的骨颗粒，持续冲洗2h，搅拌，彻底去除骨髓，室温下风干；

(2)液氮冷冻：将骨颗粒盛装后置入液氮中速冻30分钟后取出，4℃的ddh2o(双蒸水)漂洗；

(3)粉碎筛取：迅速将漂洗后的骨颗粒放入摇摆式中药粉碎机中粉碎2分钟(36000转/分钟)，粉碎的骨颗粒经60目标准分样筛初步筛取得到骨粉，粉碎不佳的大颗粒骨颗粒再次粉碎、筛取；初筛的骨粉经冻干机真空干燥后，再用80目标准分样筛筛取，得到直径约200μm的bmg骨粉。

(4)脱脂：室温下(24℃)，将bmg骨粉称重后置于烧杯中，按固液比1:100g/ml加入氯仿甲醇溶液(该溶液中氯仿：甲醇的体积比为1:1)，室温下磁力搅拌，脱脂6h后用大量ddh2o漂洗5遍，再用ddh2o经低速离心清洗3遍；

(5)脱钙：脱脂后的bmg骨粉按固液比1:100g/ml加入0.6mol/lhcl溶液，4℃环境下持续搅拌，每6h更换hcl溶液一次，脱钙24小时，然后用4℃的ddh2o反复洗涤除酸10遍；

(6)再次脱脂：24℃室温下，按固液比1:100g/ml再次加入氯仿甲醇溶液脱脂6h，清洗，最后将bgm骨粉室温下敞开放置2小时，使残存的有机溶剂彻底挥发去除；

(7)低分子蛋白多糖的提取：4℃环境下，按固液比1:100g/ml加入2mol/lcacl2溶液，间断搅拌24h；

(8)磷蛋白与涎蛋白的提取：4℃环境下，按固液比1:100g/ml加入0.5mol/ledta溶液(乙二胺四乙酸)，间断搅拌24h；

(9)胶原蛋白收缩：4℃环境下，按固液比1:100g/ml加入8mol/llicl溶液，间断搅拌24h；

(10)水浴：放入恒温浴槽中，55℃下水浴24小时，4℃的ddh2o漂洗5遍；

(11)冻干：将所得沉淀放入冻干机中真空冷冻干燥24h，分装称重；

(12)灭菌：用环氧已烷灭菌，-20℃冰箱中保存备用。

实施例2，制作聚乳酸-羧基乙酸(plga)微球，具体方法如下：

(1)油相制备：精密称取1.0gplga置于装有4mldcm(二氯甲烷)的ep管中溶解，漩涡震荡约2min，肉眼看不到plga颗粒表示溶解完全，作油相(o)；

(2)内水相制备：微量移液器移取500μl的ddh2o加入上述ep管中，在冰浴条件下以9000rpm高速剪切1min，作内水相(w)；

(3)外水相制备：将以上初乳快速加入到20ml4％pva(聚乙烯醇)中，在冰浴条件下以9000rpm高速剪切2min，作外水相(w)；

(4)溶剂挥发：将以上所得溶液转移至盛装有400ml2％ipa(异丙醇)及400ml0.3％pva的1000ml烧杯中，在室温下(24℃)低速搅拌5h，通过搅拌使微球中的有机溶剂挥发；

(5)微球漂洗：静置20min，弃上清液，以2000rpm离心5min；加5mlddh2o漂洗，弃上清液，离心，反复漂洗3次；

(6)微球收集：收集plga微球，冷冻干燥24h，保存于-20℃备用。

实施例3，一种多孔生物活性骨水泥的制备方法，按以下步骤进行：

(1)采用沉淀反应法制作磷酸钙粉末：将可溶性的钙盐(氯化钙或磷酸氢钙)、磷酸按1:1.4的质量比在水溶液中反应，酸碱调节至ph值7.5～8.6，生成絮状磷酸盐沉淀，用去离子水洗涤2～3次后过滤，经超声震荡仪分离后干燥，800℃反应釜中焙烧2小时，而制得β-tcp(β-磷酸三钙)粉末，在球磨机中以300～350r/min的转速，用玛瑙球磨2～4小时，所得粉末用140～180目准分子筛筛取得超细β-tcp粉末备用；

(2)将上述超细β-tcp粉末与羟基磷灰石和无水磷酸氢钙粉末按比例混合得到磷酸钙骨水泥(其中β-tcp粉末占80％，无水磷酸氢钙占8％，余量为羟基磷灰石)；

(3)将(2)所得磷酸钙骨水泥与实施例1制作的bmg按83.38％、16.65％的质量比室温下混合，震荡均匀得固相；

(4)以磷酸钾缓冲液作为液相，将液相水浴加热至37℃，并将液相按固液比为1:0.6g/ml加入至固相中，充分搅拌，即得产品1。

实施例4，一种多孔生物活性骨水泥的制备方法，按以下步骤进行：

(1)采用沉淀反应法制作磷酸钙粉末：将可溶性的钙盐(氯化钙或磷酸氢钙)、磷酸按1:1.2的质量比在水溶液中反应，酸碱调节至ph值7.5～8.6，生成絮状磷酸盐沉淀，用去离子水洗涤2～3次后过滤，经超声震荡仪分离后干燥，750℃反应釜中焙烧2小时，而制得β-tcp(β-磷酸三钙)粉末，在球磨机中以300～350r/min的转速，用玛瑙球磨2～4小时，所得粉末用140～180目准分子筛筛取得超细β-tcp粉末备用；

(2)将上述超细β-tcp粉末与羟基磷灰石和无水磷酸氢钙粉末按比例混合得到磷酸钙骨水泥(其中β-tcp粉末占70％，无水磷酸氢钙占5％，余量为羟基磷灰石)；

(3)将(2)所得磷酸钙骨水泥与实施例2制作的plga微球和实施例1制作的bmg按80％、5％及15％的质量比室温下混合，震荡均匀得固相；

(4)以磷酸钾缓冲液作为液相，将液相水浴加热至37℃，并将液相按固液比为1:0.7g/ml加入至固相中，充分搅拌，即产品2。

实施例5，一种多孔生物活性骨水泥的制备方法，按以下步骤进行：

(1)采用沉淀反应法制作磷酸钙粉末：将可溶性的钙盐(氯化钙或磷酸氢钙)、磷酸按1:1.6的质量比在水溶液中反应，酸碱调节至ph值7.5～8.6，生成絮状磷酸盐沉淀，用去离子水洗涤2～3次后过滤，经超声震荡仪分离后干燥，850℃反应釜中焙烧2小时，而制得β-tcp(β-磷酸三钙)粉末，在球磨机中以300～350r/min的转速，用玛瑙球磨2～4小时，所得粉末用140～180目准分子筛筛取得超细β-tcp粉末备用；

(2)将上述超细β-tcp粉末与羟基磷灰石和无水磷酸氢钙粉末按比例混合得到磷酸钙骨水泥(其中β-tcp粉末占90％，无水磷酸氢钙占10％，余量为羟基磷灰石)；

(3)将(2)所得磷酸钙骨水泥与实施例2制作的plga微球和实施例1制作的bmg按75％、10％及15％的质量比室温下混合，震荡均匀得固相；

(4)以磷酸钾缓冲液作为液相，将液相水浴加热至37℃，并将液相按固液比为1:0.8g/ml加入至固相中，充分搅拌，即得产品3。

上述产品1、产品2、产品3的具体组成如表1所示：

表1各产品成分表

将所得产品1、产品2和产品3分别注入聚四氟乙烯塑料管中，室温下干燥10min后，37℃水浴24h，再置于37℃烤箱中干燥至恒重，脱模、取样制备成标本，并进一步进行实验验证如下：

(1)孔隙率

采用阿基米德排水法测量材料的空隙率，即将样本烘干至恒重后称重为干重(w0)，用细丝线固定并放入超纯水中浸泡，加热至水沸腾2小时，使样本中的空气完全排除，冷却后取出样本，悬浮于纯水中，称量记为浮重(w1)，再用滤纸吸干样本表面的水分，称量记为湿重(w2)。记录各样本称量值，计算孔隙率(ρ)，计算公式：ρ＝[(w2－w0)/w1]×100％。

结果如表2显示：随着plga微球的百分比增加，孔隙率增大，其中产品2为55.06％，产品3增加到58.40％，与产品1相比，产品2与产品3孔隙率有明显的增加，差异有统计学意义(p<0.05)，产品3比产品2组孔隙率明显增加(p<0.05)。

表2各组的孔隙率

(2)塑形性和可操作性

为测量可注射性和易塑形性：将所得产品1、产品2和产品3分别转移至5ml一次性注射器中，待到骨水泥抽丝期早期推入聚四氟乙烯塑料管模具中，推注时助手将一次性注射器固定于垂直位，用推力计垂直向下推注，每10s记录样本不同时间点的推力大小，结果显示：各组注射推力随着固液混合后时间的延长逐步增加，在早期缓慢增加，在晚期快速增加，产品1在16min、产品2在14min、产品3在8min时，注射时推力超过60n后迅速上升，逐步丧失可注射性，三组复合骨水泥可注射性好，易塑形。

根据iso9597-2008标准用gillmore双针法测定其凝固时间分别为：复合骨水泥随着plga微球的加入，凝固时间、可操作时间逐步缩短。初凝时间由产品1(5±1)min缩短为产品2(4±1)min，产品3(3±1)min；终凝时间由产品1(17±2)min缩短为产品2(15±1)min，产品3(11±2)min。产品2与产品1相比，p>0.05，差异无统计学意义；产品2与产品1相比，p<0.05，差异有统计学意义，三组骨水泥凝固时间均能满足临床需要，可操作性好。

(3)可降解性

为测量其可降解性能：将产品1、产品2和产品3分别注入聚四氟乙烯塑料管中，室温下干燥10min后，37℃水浴24h，再置于37℃烤箱中干燥，称重(w0)，环氧乙烷灭菌后，放入盛装有10ml灭菌pbs溶液的离心管中，密封后置于37℃恒温箱中，每周更换液体。分别于第0、2、4、6、8、12周取出样本，干燥、称量(wt)，计算失重率(wl)，计算公式：wl＝[(w0-wt)/w0]×100％。结果显示：样本的失重率随着降解时间延长逐步增加，随着plga百分比增加，失重率增加越明显，其中产品1在降解第12周失重率为7.94％，产品2在降解第12周为21.21％，产品3在降解第12周为23.23％，说明加入plga微球能加速材料的降解，不同产品降解图片如图1所示。

(4)力学强度

生物力学测试显示：随着plga微球增加，抗压强度、强性模量逐步降低。人体松质骨的抗压强度为4-12mpa，皮质骨强度为130-180mpa。本材料的抗压强度超过松质骨的强度，可以达到皮质骨1/2～1/4强度，有望用于承重部位的骨缺损修复。

表3各组抗压强度和弹性模量

p，抗压强度(mpa)；e：纵向弹性模量(mpa)。

(5)生物相容性

选用3周龄左右体重在80-100g的sd大鼠，在分离大鼠骨髓间充质干细胞时采用全骨髓贴壁培养法，通过三次传代后得到生长旺盛、形态稳定的p3代细胞。通过观察细胞在材料上的粘附情况及细胞粘附率的测定评估大鼠骨髓间充质干细胞在上述材料上的粘附能力；通过细胞溶血实验、cellcountingkit-8(cck-8)细胞增殖-毒性检测试剂盒测定材料对大鼠骨髓间充质干细胞的毒性作用；通过碱性磷酸酶测试盒测定骨水泥在大鼠骨髓间充质干细胞分化过程的碱性磷酸酶活性的变化情况；使用骨水泥的浸提液与大鼠骨髓间充质干细胞共培养并用基茜素红染色观察新型磷酸钙人工复合骨水泥对大鼠骨髓间充质干细胞诱导成骨作用。

如图2显示：干细胞在材料上均能良好粘附生长，随着plga微球的加入及比例增加，细胞的粘附能力明显增加。cck-8细胞毒性实验表明三组骨水泥基本无细胞毒性。碱性磷酸酶测试盒测定结果显示随着plga微球的加入及比例增加，碱性磷酸酶活力无明显增加，提示多孔材料生物相容性更好。pka活性检测及茜素红染色结果表明材料能够促进bmscs向成骨细胞分化并产生矿化物质，染色呈现不均匀红色。染色后空白组未见明显矿化细胞结节，而产品2、产品3可见较大面积的大小不等、分布不均的矿化结节，经茜素红染色为深红色，浸提液培养的时间越长，染色就越深，矿化越明显。

(6)成骨活性

将复合骨水泥植入新西兰兔腰椎椎体骨缺损模型内，通过micro-ct分析和硬组织切片组织学方法，研究复合材料对兔椎体骨缺损的修复作用。通过在兔腰椎椎体骨缺损模型内植入复合骨水泥材料，分别于第4周、8周、12周取材观察，实验结果显示，不同组骨水泥复合材料均具有良好的生物相容性。micro-ct和组织学观察显示，材料植入区周围无组织变性、坏死出现。在材料植入第4周，材料与周围骨组织之间有缝隙，随着时间的延长，在第8周时缝隙模糊或消失，在第12周时复合材料与周围骨组织之间形成骨性连接、融合或骨组织已长入材料内部。

硬组织切片经甲苯胺蓝染色，兔椎体骨为浅蓝色，新生骨为深蓝色，材料为灰色。显微镜下观察结果显示：产品1植入材料在术后第4周边缘有极少量新骨生长；第8周见新生骨由周围向中部生长，材料中部没有新骨形成；在第12周材料中新生骨逐步长入到材料中部并有少量骨桥形成。产品2在第4周材料周围有新骨形成；在第8周材料周围新生骨向中部生长，材料中部可见散在的新生骨生长；在第12周材料部分降解，新生骨形成并连成小片。产品3在第4周开始降解吸收，逐步有新生骨长入；在第8周裂解成颗粒状或散在骨岛，材料吸收部位骨细胞增生活跃；在第12周，新生骨增多，部分相互连接，由编织骨重塑为板层骨，材料周围新生骨与宿主骨形成骨性连接。多孔材料组无论是材料与宿主接触周围还是材料中部均有大量新生骨生长(图3)。

最后需要说明的是，上述描述仅仅为本发明的优选实施例，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不违背本发明宗旨及权利要求的前提下，可以做出多种类似的表示，这样的变换均落入本发明的保护范围之内。