动态静电沉积复配天然材料仿生多孔微载体及制备方法与流程

本发明涉及生物医用材料或生物复合材料技术领域，特别涉及一种天然材料仿生多孔微载体及其制备方法。

背景技术

组织和器官的丧失或功能障碍是人类健康所面临的主要危害之一，也是人类疾病和死亡的最主要原因。随着组织工程技术的兴起，利用组织工程修复组织或器官成为一种有效可行的手段。对于形状不规则的组织缺损，传统块状组织工程支架存在着难以与其融合的缺陷。针对这一问题，组织工程微载体应运而生，即将种子细胞接种于微载体中，置于生物反应器中培养，以获得细胞在微载体中大量粘附和增殖的微组织，将该微组织通过注射与损伤部位精准贴合，使组织形状具有可控性，同时可减少病人的痛苦。理想的微载体应具有良好的生物相容性、多孔性、可降解性、良好的力学性能等。学者们一直致力于研发与改性各种组织工程微载体材料，以更好地帮助修复组织或器官。

壳聚糖由于其具有良好的生物相容性和可降解性，被人体内的酶降解后产物无毒，且冷冻干燥其酸溶液易形成球形多孔结构等优点，被广泛用于组织工程微载体研究中。然而，单一的使用壳聚糖作为组织工程微载体材料时存在力学强度不足、难以模拟细胞生长所需微环境，缺少细胞识别位点，促进细胞活性能力低（如成骨细胞、神经细胞等）等缺点。采用其他天然材料对壳聚糖进行复合改性受到学者们的广泛关注，现有研究中，采用壳聚糖或壳聚糖复合其他材料制备组织工程微载体时无法很好地模拟细胞生长所需微环境，且力学性能较差，无法促进部分细胞活性。另外，现有研究中常使用交联剂，残留的交联剂会产生细胞毒性，无法用于组织工程。理想的组织工程微载体应具有良好的生物相容性、优异力学性能、可以模拟细胞生长所需微环境、促进细胞活性等。如何赋予微载体优异力学性能的同时，又能保证其能很好地模拟细胞生长所需微环境，这是国内外均没有解决的难题。

针对这一现状，本发明根据细胞外基质的成分及结构，设计、制备了一种既具有良好生物相容性、优异力学性能、又能很好地模拟细胞生长所需微环境的天然材料仿生组织工程多孔微载体。

技术实现要素：

本发明的目的就是克服现有技术的不足，提供天然材料仿生组织工程多孔微载体及制备方法。

纳米纤维素（bs）在微观结构上具有与细胞外基质相类似的纳米纤维网络结构，并且纤维直径与细胞外基质中胶原纤维的直径接近，具有较好的力学强度，其在结构仿生设计上具有独特优势；动物蛋白（如胶原、明胶等）、植物蛋白（如大豆蛋白、玉米蛋白等）、聚氨基酸及多肽可用于模拟细胞外基质中蛋白组分，提供细胞活性位点、促进细胞活性，经物理分离和离子化处理的蛋白、聚氨基酸及多肽（hs-p），可在维持活性官能团种类和数量的基础上，提高溶解度，有利于与其他材料通过静电吸附形成聚电解质；壳聚糖（cs）与细胞外基质中的糖胺聚糖化学结构类似。三者复合制备微载体，从而达到结构和成分上双重仿生，很好地模拟细胞生长所需微环境，具有一定力学强度，并促进细胞活性。

本发明一种动态静电沉积复配天然材料仿生多孔微载体，所述仿生多孔微载体包括多孔微载体和包覆在所述孔微载体表面的蛋白组分；

其中，所述仿生多孔微载体为纳米纤维素和壳聚糖复合制备得到，所述蛋白组分通过原位动态静电沉积。

进一步，所述多孔微载体中壳聚糖和纳米纤维素质量比为1:1~5:1。

进一步，所述蛋白组分包括动物蛋白、植物蛋白、聚氨基酸或多肽中的一种或几种。

进一步，所述仿生多孔微载体通过纳米纤维素、壳聚糖及蛋白组分模拟仿生细胞外基质结构及成分。

进一步，所述仿生多孔微载体的粒径范围为50μm~1000μm；孔径范围为10μm~100μm；孔隙率为80%以上；力学强度为50kpa~300kpa。

本发明的另一目的是提供上述仿生多孔微载体的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、纳米纤维素去絮凝化：

将纳米纤维素膜用去离子水冲洗；再将所述纳米纤维素膜浸泡于naoh溶液中，高温水浴下煮1~10h，；用去离子水多次冲洗至中性，得到纯净纳米纤维素膜；将得到纯净纳米纤维素膜在高速剪切作用下去絮凝化，高速离心取下层沉淀物备用。

步骤二、制备bc/cs多孔微载体：

将bc浆液和cs溶液按溶质质量比为1:1~5:1充分混合，采用小于150r/min的转速进行搅拌，将混合液搅拌均匀；向混合液中加入2%~10%体积分数乳化剂，提高转速搅拌转速为300r/min~1000r/min，在搅拌过程中，具有纳米纤维结构的纳米纤维素能够稳定微载体粒径和孔径；将搅拌后的形成的液体置于-70℃~-150℃低温环境，迅速固化相分离；用低温有机溶剂清洗后得到固体微球；将微球置于低于-20℃，低于100pa低温负压环境中干燥，获得bc/cs多孔微载体。

步骤三、高溶解度蛋白组分的获取：

将蛋白组分分散于溶液中溶解，获得高溶解度蛋白，备用；

步骤四、动态静电沉积法制备hs-p/bc/cs仿生多孔微载体：

将步骤三中获得的高溶解度蛋白配成浓度为0.5%-5%溶液，调整ph为6-10，将步骤二中获得的bc/cs微载体加入其中，控制搅拌速度为20r/min~200r/min，搅拌时间1h~24h，使溶液中的hs-p与壳聚糖之间产生可控的动态静电吸附，从而自组装形成壳芯纤维结构多孔微球，将固液分离后的微球置于低于-20℃，低于100pa低温负压环境中进行溶剂分离，最终获得hs-p/bc/cs多孔微载体。

进一步，所述蛋白组分分为溶解度较高蛋白组分和溶解度较低的蛋白组分；

所述溶解度较高蛋白组分直接分散于溶液中溶解备用；

所述溶解度较低的蛋白组分经物理分离提取，物理分离包括高速离心，低温析出，冷冻干燥，最终获得高溶解度蛋白。

一种上述方法制备得到仿生多孔微载体的应用用于人体软、硬组织培养，组织工程微组织构建，人体组织修复，细胞扩增或药物释放。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、通过纳米纤维素与壳聚糖复合形成聚电解质微球，具备纳米纤维结构的纳米纤维素起到稳定多孔微载体粒径和孔径的作用；

2、通过动态静电沉积合成多孔微载体的过程中没有引入交联剂，简化了合成步骤，排除了引入交联剂带来的毒性；

3、通过模拟细胞外基质成分及结构，选取天然可降解材料，制备出仿生多孔微载体，使其既具有良好生物相容性，良好的力学性能，又能为细胞的体外增殖与分化提供类似于细胞外基质的微环境。

附图说明

图1所示为本发明实施例多孔微载体宏观图。

图2、图3所示为本发明实施例多孔微载体扫描电镜图。

具体实施方式

以下结合具体附图进一步阐述本发明。应理解为，实施例仅仅用于说明本发明而不是用于限制本发明的范围。此外应理解，本领域的技术人员在阅读了本发明讲授的内容之后，对本发明所做各种等价形式之改动，同样落入本申请权利要求书所要求的范围之内。

如图所示，本发明一种动态静电沉积复配天然材料仿生多孔微载体，所述仿生多孔微载体包括多孔微载体和包覆在所述孔微载体表面的蛋白组分；

其中，所述仿生多孔微载体为纳米纤维素和壳聚糖复合制备得到，所述蛋白组分通过原位动态静电沉积。

进一步，所述多孔微载体中壳聚糖和纳米纤维素质量比为1:1~5:1。

进一步，所述蛋白组分包括动物蛋白、植物蛋白、聚氨基酸或多肽中的一种或几种。

进一步，所述仿生多孔微载体通过纳米纤维素、壳聚糖及蛋白组分模拟仿生细胞外基质结构及成分。

进一步，所述仿生多孔微载体的粒径范围为50μm~1000μm；孔径范围为10μm~100μm；孔隙率为80%以上；力学强度为50kpa~300kpa。

本发明的另一目的是提供上述仿生多孔微载体的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、纳米纤维素去絮凝化

将纳米纤维素膜用去离子水冲洗；再将所述纳米纤维素膜浸泡于naoh溶液中，高温水浴下煮1~10h，；用去离子水多次冲洗至中性，得到纯净纳米纤维素膜；将得到纯净纳米纤维素膜在高速剪切作用下去絮凝化，高速离心取下层沉淀物备用。

步骤二、制备bc/cs多孔微载体

将bc浆液和cs溶液按溶质质量比为1:1~5:1充分混合，采用小于150r/min的转速进行搅拌，将混合液搅拌均匀；向混合液中加入2%~10%体积分数乳化剂，提高转速搅拌转速为300r/min~1000r/min，在搅拌过程中，具有纳米纤维结构的纳米纤维素能够稳定微载体粒径和孔径；将搅拌后的形成的液体置于-70℃~-150℃低温环境，迅速固化相分离；用低温有机溶剂清洗后得到固体微球；将微球置于低于-20℃，低于100pa低温负压环境中干燥，获得bc/cs多孔微载体。

步骤三、高溶解度蛋白组分的获取：

将蛋白组分分散于溶液中溶解，获得高溶解度蛋白，备用；

步骤四、动态静电沉积法制备hs-p/bc/cs仿生多孔微载体

将步骤三中获得的高溶解度蛋白配成浓度为0.5%-5%溶液，调整ph为6-10，将步骤二中获得的bc/cs微载体加入其中，控制搅拌速度为20r/min~200r/min，搅拌时间1h~24h，使溶液中的hs-p与壳聚糖之间产生可控的动态静电吸附，从而自组装形成壳芯纤维结构多孔微球，将固液分离后的微球置于低于-20℃，低于100pa低温负压环境中进行溶剂分离，最终获得hs-p/bc/cs多孔微载体。

进一步，所述蛋白组分分为溶解度较高蛋白组分和溶解度较低的蛋白组分；

所述溶解度较高蛋白组分直接分散于溶液中溶解备用；

所述溶解度较低的蛋白组分经物理分离提取，物理分离包括高速离心，低温析出，冷冻干燥，最终获得高溶解度蛋白。

一种上述方法制备得到仿生多孔微载体的应用用于人体软、硬组织培养，组织工程微组织构建，人体组织修复，细胞扩增或药物释放。

实施例：

步骤一、纳米纤维素去絮凝化

取纳米纤维素（bc）膜用清水多次冲洗，除去膜表面杂质，再将膜浸泡于0.01mol/l的naoh溶液，100℃水浴下煮2h，去除液膜中的菌体；用蒸馏水多次冲洗至中性，得到纯净bc膜；将纯净纳米纤维素膜在高速剪切作用下去絮凝化，高速离心取下层沉淀物备用。

步骤二、制备bc/cs多孔微载体

称取一定质量的bc于2%（v/v）醋酸溶液中制备质量浓度为2%（w/v）的bc悬浮浆料；称取一定质量的cs溶于2%（v/v）醋酸溶液制备质量浓度为2%（w/v）的cs溶液。将cs醋酸溶液和bc醋酸悬浮浆料按体积比1:1充分混合；向100ml混合液中加入2ml乳化剂，提高转速搅拌转速为500r/min，在搅拌过程中，具有纳米纤维结构的纳米纤维素能够稳定微载体粒径和孔径；将搅拌1h后的形成的液体置于-150℃以下低温环境，迅速固化相分离；用低温石油醚清洗后得到固体微球；将微球置于低于-20℃，低于100pa低温负压环境中干燥，获得bc/cs多孔微载体。

步骤三、高溶解度大豆蛋白的获取

将低温脱脂豆粉溶于去离子水，用naoh(2mol/l)调节ph至弱碱性，在5000r/min离心30min后取上清液，加少量亚硫酸盐至溶液浑浊，用hcl(2mol/l)调节ph至溶液澄清，低温保存24h，有大量蛋白析出，高速离心后取下层沉淀物置于低温环境中冷冻保存，在低于-20℃，低于100pa低温负压环境下干燥获得高溶解度大豆蛋白（highsolution-soyprotein,hs-sp）。

步骤四、动态静电沉积法制备hs-sp/bc/cs复合仿生多孔微载体

将步骤三中获得的高溶解度的大豆蛋白配成浓度为2%的溶液，调整ph=7，将步骤二中获得的bc/cs微载体加入其中，采用60r/min转速搅拌4h，在搅拌过程中，溶液中的hs-p会与壳聚糖之间产生静电吸引，实现动态静电吸附，从而沉积到壳聚糖表面，形成壳芯纤维结构，将固液分离后的微球置于低于-20℃，低于100pa低温负压环境中干燥，最终获得hs-p/bc/cs多孔微载体。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、通过纳米纤维素与壳聚糖复合形成聚电解质微球，具备纳米纤维结构的纳米纤维素起到稳定多孔微载体粒径和孔径的作用；

2、通过动态静电沉积合成多孔微载体的过程中没有引入交联剂，简化了合成步骤，排除了引入交联剂带来的毒性；

3、通过模拟细胞外基质成分及结构，选取天然可降解材料，制备出仿生多孔微载体，使其既具有良好生物相容性，良好的力学性能，又能为细胞的体外增殖与分化提供类似于细胞外基质的微环境。

4、材料均为非动物源天然材料，避免携带动物病毒的风险，使用安全。这为该实施例中增加的有益效果。

实施例

步骤一、纳米纤维素去絮凝化：

取纳米纤维素（bc）膜用清水多次冲洗，除去膜表面杂质，再将膜浸泡于0.02mol/l的naoh溶液，100℃水浴下煮3h，去除液膜中的菌体；用蒸馏水多次冲洗至中性，得到纯净bc膜；将纯净纳米纤维素膜在高速剪切作用下去絮凝化，高速离心取下层沉淀物备用。

步骤二、制备bc/cs多孔微载体：

称取一定质量的bc于2%（v/v）醋酸溶液中制备质量浓度为2%（w/v）的bc悬浮浆料；称取一定质量的cs溶于2%（v/v）醋酸溶液制备质量浓度为2%（w/v）的cs溶液。将cs醋酸溶液和bc醋酸悬浮浆料按体积比2:1充分混合；向100ml混合液中加入2ml乳化剂，提高转速搅拌转速为600r/min，在搅拌过程中，具有纳米纤维结构的纳米纤维素能够稳定微载体粒径和孔径；将搅拌1h后的形成的液体置于-100℃以下低温环境，迅速固化相分离；用低温石油醚清洗后得到固体微球；将微球置于低于-20℃，低于100pa低温负压环境中干燥，获得bc/cs多孔微载体。

步骤三、动态静电沉积法制备col/bc/cs仿生多孔微载体：

配置2%（w/v）胶原（col）溶液，调整ph=8，将步骤二中获得的bc/cs微载体加入其中，采用100r/min转速搅拌4h，在搅拌过程中，溶液中的col会与壳聚糖之间产生静电吸引，实现动态静电吸附，从而沉积到壳聚糖表面，形成壳芯纤维结构，将固液分离后的微球置于低于-20℃，低于100pa低温负压环境中干燥，最终获得col/bc/cs多孔微载体。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、通过纳米纤维素与壳聚糖复合形成聚电解质微球，具备纳米纤维结构的纳米纤维素起到稳定多孔微载体粒径和孔径的作用；

2、通过动态静电沉积合成多孔微载体的过程中没有引入交联剂，简化了合成步骤，排除了引入交联剂带来的毒性；

3、通过模拟细胞外基质成分及结构，选取天然可降解材料，制备出仿生多孔微载体，使其既具有良好生物相容性，良好的力学性能，又能为细胞的体外增殖与分化提供类似于细胞外基质的微环境。