本发明涉及医用生物敷料领域，具体地说，是一种gelma水凝胶人脱细胞羊膜三维双层辅料的制备方法。
背景技术：
口腔黏膜位置相对特殊，它覆盖口腔表面，前方与唇部皮肤相连，后方与咽喉黏膜相连，通过抵抗机械性刺激、限制毒性物质、微生物入侵及唾液的分泌等发挥口腔保护作用。严重粘膜病变、肿瘤手术等对口腔粘膜创伤严重，常引起较大的口腔粘膜缺损，以往采用打碘仿油纱包覆盖创面，邻近瓣转移修复如颊脂垫瓣、腭瓣、颈阔肌瓣等，不仅增加手术难度及创伤，而且引起供区不同程度的功能障碍及并发症。打碘仿油纱包覆盖创面，导致术后疤痕畸形，引起张口受限、舌活动受限等。
理想的口腔黏膜缺损替代材料应具有以下特点：1）造价低；2）保存期长；3）使用方便，手术操作简单，易于固定；4）无抗原性；5）具有持久性；6）具有柔韧性；7）对细菌具有屏障作用；8）对不规则创面顺应性好；9）不会过度增生。目前尚无满足以上所有条件的理想替代物。
人羊膜位于胎盘的最内层，为厚度20-500um的半透明膜，拥有优越的细胞外基质成分，被公认为具有革命性改进的生物材料。人脱细胞羊膜作为一种特殊的细胞外基质，取材较易，数量较多。人脱细胞羊膜是一种脱细胞材料，主要成分是纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、ⅳ型胶原、硫酸乙酰肝素蛋白多糖及生长因子，已被广泛应用于各部位损伤修复，如角膜移植、皮肤缺损、软骨损伤后的修复及外周神经再生等领域，并获得良好的治疗效果。实践已证明人脱细胞羊膜是一种良好的创面覆盖敷料，其具有良好的生物相容性、稳定性，还具有一定的血管弹性、可塑变形性、抗炎、抗感染、无毒、低免疫原性和抗原性、无致瘤性等。人脱细胞羊膜的制备方法很多，综合比较我们采用了一种低成本的快速有效的羊膜脱细胞方法，与传统的胰酶降解或物理方法相比，既避免了脱细胞羊膜制备过程中过度酶解破坏羊膜基质的蛋白结构及韧性的可能，也避免了器械处理可能对羊膜造成的损伤。然而，脱细胞羊膜是单层羊膜，其存在不足是：组织薄、机械性较差，易撕裂、易卷曲，难以裁剪成形，覆盖创面后易溶解。以往人们为了克服上述不足，采用双侧/多层机械覆盖或与胶原粘合来增加脱细胞羊膜的厚度。此种方法只是单纯的增加了脱细胞羊膜的厚度，并不具备水凝胶的相关优点如吸水性、保水性、透气性、柔韧性及缓释药物的功能，从而限制了其应用。
水凝胶是亲水性聚合物的交联网络可以在水中膨胀，以获得其原始质量的许多倍。水凝胶的物理和生物化学性质主要取决于它们的组成、用于它们聚合的方法及它们的交联程度。在组织工程应用方面，水凝胶能够针对不同的生物医学应用的设计需求，提供一个多功能的平台。目前已经能够通过天然和/或合成聚合物，使用不同的交联方法制备众多的水凝胶作为再生医学，药物递送和组织粘合剂。由于理化性质的不同，普通的水凝胶通常达不到强度和机械可调性的要求，而gelma具有易获取、光可控和可降解、具有良好的生物相容性、低免疫反应性和良好的机械强度，局部贴服性好等特性，可作为仿生修复膜贴附在口腔黏膜损伤表面。但是gelma水凝胶本身缺乏生物活性物质，不能促进口腔黏膜损伤的快速修复，单独使用gelma水凝胶应用于口腔黏膜损伤的修复甚少，更未见gelma通过电纺、光交联脱细胞羊膜制备双侧生物活性敷料的发明报道。
静电纺丝技术是近年来发展起来的一种制备聚合物纳米纤维的纺丝工艺，其最大特点是所得到的支架材料具有孔隙率高、纤维直径小、比表面积大、均一性好等优点，更重要的是所制得的纳米纤维能够从微观尺度上模仿天然细胞外基质。同时通过光交联可以使上述制得的纳米纤维形成三维网络结构更加致密的交联体，更加牢固，提高了材料的稳定性。本发明制备的gelma水凝胶/人脱细胞羊膜三维双层敷料，保留了脱细胞羊膜的生物活性，同时具有gelma水凝胶的机械强度。该敷料具有三维网络状多孔空间，类似于天然的细胞外基质，具有生物活性，能够刺激细胞生长及血管形成，从而能够促进口腔黏膜缺损的快速修复。
技术实现要素：
本发明旨在披露一种既有良好保护效果，具有抗炎、抗感染及促进愈合等优点，又具有良好的透气性、保水性及韧性的生物活性敷料，能够达到刺激缺损区细胞生长及血管形成，促进口腔黏膜缺损的快速修复，缺损区黏膜组织再生后，原敷料可生物降解或被新生组织爬行替代目的的三维双层敷料的制备方法。
为了实现上述目的，本发明请求保护的技术方案如下：
一种gelma水凝胶人脱细胞羊膜三维双层辅料的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：脱细胞羊膜（d-ham）的制备：选择肝炎病毒抗原、梅毒抗体及人免疫缺陷病毒抗体均为阴性的剖腹产的产妇，无菌操作下取胎膜，钝性分离去除绒毛膜组织，保留羊膜层，将羊膜转移到补充有抗生素及抗菌剂的无菌pbs中反复冲洗去除血凝块，然后用0.2%edta在37℃下处理30分钟，接着于0.5mol/l氢氧化钠溶液中浸泡30秒，此后将其转移到5%氯化铵中剧烈摇晃，通过剧烈晃动和刮擦从羊膜中去除细胞，最后用pbs洗涤三次，冻干后备用；
步骤二：gelma水凝胶电纺液的制备：将20g明胶与200mlpbs混合放入预热的60℃水浴中搅拌溶解至透明黄色液体，用泵将16ml甲基丙烯酸酐以4ml/min的速度在避光条件下滴入上述液体并充分搅拌2小时，加入预热好的800mlpbs搅拌反应15min注入14-16kd透析袋中用去离子水透析一周，一周后将取出透析袋中溶液，选用0.45um滤纸过滤后放入-20℃冰箱预冻12小时，之后冻干备用；
步骤三：三维双层敷料的制备：取100mg-120mg加1ml六氟异丙醇配成电纺液，将步骤二中冻干后的脱细胞羊膜固定于滚筒上进行静电纺丝操作，将纺成的d-ham/e-gelma用70%乙醇处理1小时，之后将该敷料加入光引发剂irgacure2959行光交联，将光交联后的该敷料用pbs清洗除去光引发剂后冻干，于γ辐照灭菌，于无菌条件下封装，4℃保存即得gelma水凝胶人脱细胞羊膜三维双层辅料。
本发明的进一步改进，上述pbs的ph值为7.4。
本发明的进一步改进，上述步骤三中，静电纺丝操作过程中电压保持为18kv/cm，注射器和收集器之间的距离15cm，恒定流速0.3ml/h。
本发明适用于各种原因引起的口腔黏膜缺损创面的修复或者暂时性黏膜替代；由于皮肤缺损与黏膜缺损愈合的机制类似，本发明也适用于皮肤软组织缺损、褥疮或者皮肤慢性溃疡创面。
本发明在临床使用时，可根据创面的需要必要时配置好含抗菌药、止血药或止痛药的药液，将敷料使用前于上述药液浸泡，要其肿胀吸附药物后覆盖于口腔黏膜缺损区，然后予以固定，待其自然吸收或手工取出。
本发明的有益效果：一、gelma水凝胶通过电纺丝技术及光交联与脱细胞羊膜结合，形成纳米纤维级三维网络多孔结构，高度模拟天然细胞外基质结构，利于缺损区组织细胞的生长。
二、该双层敷料既具有良好的机械强度和顺应性，同时具有脱细胞羊膜的生物活性，不仅能够促进缺损区组织的再生愈合，同时能够为细胞生长、血管形成提供稳定的细胞外环境。
三、如果在敷料使用时加入抗菌药、止血药或止痛药，该敷料所具备的空间网络能够将药物缓慢持续的释放到创面起到持续治疗作用。
具体实施方式
为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明做进一步详细描述，该实施例仅用于解释本发明，并不对本发明的保护范围构成限定。
实施例：一种gelma水凝胶人脱细胞羊膜三维双层辅料的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：脱细胞羊膜（d-ham）的制备：选择肝炎病毒抗原、梅毒抗体及人免疫缺陷病毒抗体均为阴性的剖腹产的产妇，无菌操作下取胎膜，钝性分离去除绒毛膜组织，保留羊膜层，将羊膜转移到补充有抗生素及抗菌剂的无菌pbs中反复冲洗去除血凝块，然后用0.2%edta在37℃下处理30分钟，接着于0.5mol/l氢氧化钠溶液中浸泡30秒，此后将其转移到5%氯化铵中剧烈摇晃，通过剧烈晃动和刮擦从羊膜中去除细胞，最后用pbs洗涤三次，冻干后备用；
步骤二：gelma水凝胶电纺液的制备：将20g明胶与200mlpbs混合放入预热的60℃水浴中搅拌溶解至透明黄色液体，用泵将16ml甲基丙烯酸酐以4ml/min的速度在避光条件下滴入上述液体并充分搅拌2小时，加入预热好的800mlpbs搅拌反应15min注入14-16kd透析袋中用去离子水透析一周，一周后将取出透析袋中溶液，选用0.45um滤纸过滤后放入-20℃冰箱预冻12小时，之后冻干备用；
步骤三：三维双层敷料的制备：取100mg-120mg加1ml六氟异丙醇配成电纺液，将步骤二中冻干后的脱细胞羊膜固定于滚筒上进行静电纺丝操作，将纺成的d-ham/e-gelma用70%乙醇处理1小时，之后将该敷料加入光引发剂irgacure2959行光交联，将光交联后的该敷料用pbs清洗除去光引发剂后冻干，于γ辐照灭菌，于无菌条件下封装，4℃保存即得gelma水凝胶人脱细胞羊膜三维双层辅料。
本实施例中，上述pbs的ph值为7.4，步骤三中静电纺丝操作过程中电压保持为18kv/cm，注射器和收集器之间的距离15cm，恒定流速0.3ml/h。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。