一种促进肝脏脂质代谢、抗炎降酶的提取物及其制备方法与流程

本发明属于保健品
技术领域：
，具体涉及一种促进肝脏脂质代谢、抗炎降酶的提取物及其制备方法。
背景技术：
：肝脏作为体内最为活跃的器官，对糖、脂类、蛋白质、激素、药物、毒物等的代谢都起重要作用。由于饮食习惯、生活压力、环境污染导致现在患有脂肪肝的人群越来越多。非酒精性脂肪肝病(non-alcoholicfattyliverdisease，nafld)是以肝实质细胞脂肪变性、脂肪贮积和炎症反应为主要特征，并且无过量饮酒史的慢性肝脏代谢性疾病。nafld从单纯性脂肪肝、可发展成为非酒精性脂肪肝炎、肝纤维化、肝硬化、甚至肝癌。发病率、死亡率已逐年升高。病发年龄也日趋提前，有报道，年龄最小的脂肪肝患者还不到十岁。脂肪肝是指脂肪在肝脏中的过度沉积。多数降脂药能促进血液当中的脂质运输至肝脏进行代谢排泄，而脂肪肝患者常伴有肝脏脂质代谢障碍，不止治疗性降低，也加剧肝脏负担。对nafld有效的产品显得尤其关键。目前迫切需要天然、草本的配方，来调理和治理脂肪肝。技术实现要素：为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种天然的促进肝脏脂质代谢、抗炎降酶的提取物及其制备方法。本发明的技术方案为：一种促进肝脏脂质代谢、抗炎降酶的提取物的制备方法，包括如下步骤：(1)制备松茸酶解液将松茸干燥后进行粉碎，得到松茸粉；将所述松茸粉与蒸馏水混合，静置后搅拌均匀，得到松茸匀浆；将所述松茸匀浆离心，取上清液进行酶解，得到松茸酶解液；(2)制备促进肝脏脂质代谢、抗炎降酶的提取物酵母菌活化后，经培养，得到种子液；向所述种子液中加入步骤(1)所述松茸酶解液，经发酵培养得到发酵液；将所述发酵液进行固液分离，得到上清液和酵母菌体；将所述上清液依次进行喷雾干燥、杀菌，即得所述促进肝脏脂质代谢、抗炎降酶的提取物。进一步地，步骤(1)中，所述干燥的温度为60-90℃，所述干燥的时间为2-4h。进一步地，步骤(1)中，所述松茸粉与所述蒸馏水的质量比为2-4:1-3；所述静置的时间为10-14h，所述静置的温度为4-6℃；所述搅拌的转速为40-60r/min，所述搅拌的时间为1-3h。进一步地，步骤(1)中，所述离心的转速为5000-7000rpm，所述离心的时间为35-55min。进一步地，步骤(1)中，所述进行酶解的酶为木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶的混合物；进行所述酶解的时间为2-3h，进行所述酶解的温度为35-40℃。进一步地，步骤(1)中，所述木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶的质量比为1-2:1-2:1-2。进一步地，步骤(2)中，所述种子液与所述松茸酶解液的体积之比为1-2:1-2。进一步地，步骤(2)中，所述发酵培养的温度为28-32℃，所述发酵培养的搅拌转速为150-250rpm，所述发酵培养的时间为32-40h。进一步地，步骤(2)中，所述喷雾干燥的进风温度为70-80℃，水滴速度为25-35ml/min，热空气流量为30-40m3/h，压缩空气流量为450-530l/h，进料速度为3.0×180-5.0×180ml/h，出水温度为75-80℃。任一项所述方法制备得到的促进肝脏脂质代谢、抗炎降酶的提取物。松茸位列四大名菌(冬虫夏草、灵芝、羊肚菌)之首，含有18种氨基酸、14种人体必需微量元素、49种活性营养物质、5种不饱和脂肪酸、8种维生素、2种糖蛋白、丰富的膳食纤维和多种活性酶，另含有3种珍贵的活性物质，分别是双链松茸多糖、松茸多肽和全世界独一无二的抗癌物质——松茸醇。松茸菌肉白嫩肥厚，质地细密，口感滑润，新鲜松茸每100g含有水分80～90g、粗蛋白4.5～7.5g、糖类4～7.5g、粗纤维0.5～1.2g、粗脂肪0.4～0.sg以及多种维生素、氨基酸和微量元素等，具有独特的浓郁香气。松茸营养均衡、充足，具有提高免疫力、抗癌抗肿瘤、治疗糖尿病及心血管疾病、抗衰老养颜、促肠胃保肝脏等多种功效：松茸营养结构配比合理均衡，特别是18种氨基酸的含量在所有食品中最接近于世界卫生组织(who)和联合国粮农组织(fao)提出的标准。营养含量充足，松茸的百克营养含量，在菌类中名列前茅。吸收性好，松茸的主要营养元素为活性营养物质，分子小，极易吸收。安全，松茸生长在没有污染的环境中，是世界公认的安全食品。常规的松茸类食品、保健品只是简单的将各种方法提取的松茸活性成分混合，但是这些活性成分提取出来以后，往往并不能被人体很好的吸收，由于其原始生物活性结构遭到一定程度破坏，其功效也成了未知。本发明的有益效果为：1、本发明所述的促进肝脏脂质代谢、抗炎降酶的提取物的制备方法，先将松茸内的的多种活性物质(松茸多肽、松茸醇、松茸多糖、氨基酸)提取出来，再将其与酵母混合发酵培养，使得活酵母消化、吸收，并将其转化为更接近其原始生物活性和营养的有机形式(葡聚搪-松茸多肽、葡聚糖-松茸醇、葡聚糖松茸多糖、葡聚糖氨基酸螯合物)，从而增强了吸收机制，提高了生物效价。2、本发明制备方法得到的促进肝脏脂质代谢、抗炎降酶的提取物，经动物实验证实，对调节血脂水平有积极作用，通过上调肝脏腺苷酸活化蛋白激酶磷酸化水平以抑制固醇调控元件结合蛋白的转录活性，进而抑制甘油三酯的合成。本发明可有效降低非酒精性脂肪肝小鼠血清甘油三酯、总胆固醇水平，显著改善高密度脂蛋白胆固醇水平，提高肝脏总抗氧化能力，降低nafld小鼠肝脏组织丙二醛，同时显著提高肝细胞中还原型谷胱甘肽的含量。3、本发明制备方法得到的促进肝脏脂质代谢、抗炎降酶的提取物，经动物实验证实，通过阻断nf-κb信号通路，减少tnf-α炎症因子的表达，降低tlr4及myd88的表达量，抑制炎症信号放大，从而改善肝脏脂质堆积及炎症反应，进而发挥其抗炎作用。4、本发明制备方法得到的促进肝脏脂质代谢、抗炎降酶的提取物，经动物实验证实，可有效降低非酒精性脂肪肝小鼠血清谷草转氨酶和谷丙转氨酶的含量，具有减轻肝细胞损伤的作用。5、本发明制备方法未使用化学成分提取松茸活性成分，制备工艺简单，符合大规模生产要求。附图说明图1：各组小鼠血清谷丙转氨酶(gpt)、谷草转氨酶(got)的含量图2：各组小鼠肝组织p-ampkα、srebp-1c、fasn蛋白的表达量；图3：各组小鼠肝组织中p-ampkα蛋白的表达量；图4：各组小鼠肝组织中srebp-1c蛋白的表达量；图5：各组小鼠肝组织中fasn蛋白的表达量；图6：各组小鼠tlr4和myd88的表达量。图中：1-tlr4表达量；2-myd88表达量。具体实施方式下面通过具体实施例，对本发明作进一步说明。实施例1本实施例提供一种促进肝脏脂质代谢、抗炎降酶的提取物，包括如下步骤：(1)制备松茸酶解液将松茸在温度为60℃条件下干燥4h后进行粉碎，得到松茸粉；将所述松茸粉与蒸馏水按2:1的质量比混合，于4℃静置10h后，以40r/min的转速搅拌3h，得到松茸匀浆；将所述松茸匀浆以5000rpm的转速离心55min，向上清液中加入木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶以1:1:1的质量比混合而成的混合物在温度为35℃的条件下酶解3h，得到松茸酶解液；(2)制备促进肝脏脂质代谢、抗炎降酶的提取物酵母菌活化后，经培养，得到种子液；向1000ml所述种子液中加入2000ml步骤(1)所述松茸酶解液，在温度为28℃，转速为150rpm的搅拌条件下发酵培养32h得到发酵液；将所述发酵液进行固液分离，得到上清液和酵母菌体；将所述上清液在进风温度为70℃，水滴速度为25ml/min，热空气流量为30m3/h，压缩空气流量为450l/h，进料速度为3.0×180ml/h，出水温度为75℃的条件下进行喷雾干燥，杀菌后，即得所述促进肝脏脂质代谢、抗炎降酶的提取物。实施例2本实施例提供一种促进肝脏脂质代谢、抗炎降酶的提取物，包括如下步骤：(1)制备松茸酶解液将松茸在温度为90℃条件下干燥2h后进行粉碎，得到松茸粉；将所述松茸粉与蒸馏水按4:3的质量比混合，于6℃静置14h后，以60r/min的转速搅拌1h，得到松茸匀浆；将所述松茸匀浆以7000rpm的转速离心35min，向上清液中加入木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶以1:2:2的质量比混合而成的混合物在温度为40℃的条件下酶解2h，得到松茸酶解液；(2)制备促进肝脏脂质代谢、抗炎降酶的提取物酵母菌活化后，经培养，得到种子液；向500ml所述种子液中加入1000ml步骤(1)所述松茸酶解液，在温度为32℃，转速为250rpm的搅拌条件下发酵培养40h得到发酵液；将所述发酵液进行固液分离，得到上清液和酵母菌体；将所述上清液在进风温度为80℃，水滴速度为35ml/min，热空气流量为40m3/h，压缩空气流量为530l/h，进料速度为5.0×180ml/h，出水温度为75℃的条件下进行喷雾干燥，杀菌后，即得所述促进肝脏脂质代谢、抗炎降酶的提取物。实施例3本实施例提供一种促进肝脏脂质代谢、抗炎降酶的提取物，包括如下步骤：(1)制备松茸酶解液将松茸在温度为80℃条件下干燥3h后进行粉碎，得到松茸粉；将所述松茸粉与蒸馏水按3:2的质量比混合，于5℃静置12h后，以50r/min的转速搅拌2h，得到松茸匀浆；将所述松茸匀浆以6000rpm的转速离心45min，向上清液中加入木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶以1:2:1的质量比混合而成的混合物在温度为38℃的条件下酶解2.5h，得到松茸酶解液；(2)制备促进肝脏脂质代谢、抗炎降酶的提取物酵母菌活化后，经培养，得到种子液；向500ml所述种子液中加入1000ml步骤(1)所述松茸酶解液，在温度为30℃，转速为200rpm的搅拌条件下发酵培养36h得到发酵液；将所述发酵液进行固液分离，得到上清液和酵母菌体；将所述上清液在进风温度为80℃，水滴速度为30ml/min，热空气流量为36m3/h，压缩空气流量为490l/h，进料速度为4.0×180ml/h，出水温度为80℃的条件下进行喷雾干燥，杀菌后，即得所述促进肝脏脂质代谢、抗炎降酶的提取物。实验例1、小鼠非酒精性脂肪肝(nafld)的保护作用1.1动物选择昆明种小鼠75只，均为雄性，按体重大小随机分成5组，每组15只，空白组、非酒精肝损伤模型组、本发明实施例3低(0.5g/kg)、中(1.5g/kg)、高剂量(4.5g/kg)组。1.2实验方法空白组喂养普通饲料，给予同体积生理盐水，饲养12周；模型组和剂量组均喂养高脂饲料，给予同体积生理盐水，饲养12周，剂量组每天下午3:00左右灌胃给药一次。以上操作每天一次，12周后处死小鼠。从各组小鼠距肝脏最大叶边缘5mm处取肝组织，立即保存于-80℃低温冰箱中。取各组小鼠肝组织300mg，制成组织匀浆，在3800r/min、5℃条件下离心20min后取上清液。1.3检测方法采用磷酸甘油氧化酶法测定血清中甘油三酯(tg)的含量，见表1；采用cod-pap法测定总胆固醇(t-chol)的含量，见表1；采用分光光度法测定高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)的含量，见表1；采用fe2+菲啉类络合比色法测定肝脏总抗氧化能力活性(t-aoc)，见表2；采用琉代巴比妥酸比色法，根据tep标准曲线计算丙二醛(mda)含量，见表2；采用elisa试剂盒说明书的操作方法进行血浆gsh的测定，见表2。采用westernblot法检测各组小鼠肝组织cyp4502e1(细胞色素p4502e1)，见表3；采用westernblot法检测各组小鼠肝组织ppar-γ、nf-κb、iκb-α蛋白表达量，见表4；采用elisa试剂盒说明书操作方法测定肝组织匀浆中肿瘤坏死因子tnf-α的表达量，见表5；采用2，4二硝基苯肼法测定血清谷丙转氨酶(gpt)、谷草转氨酶(got)的含量，见图1；采用rt-pcr法测定肝脏腺苷酸活化蛋白激酶(ampk)磷酸化水平、固醇调控元件结合蛋白(srebp-1c)、脂肪合成酶(fasn)、toll受体4(tlr4)和myd88的表达量，见图2-图6。1.4实验结果实验数据以表示，结果用单因素方差分析，p<0.05表示有显著性差异，p<0.01表示有非常显著性差异，p>0.05表示无统计学意义，应用spss19.0统计软件分析数据。表1各组小鼠tg、t-cho、hdl-c的含量表2各组小鼠t-aoc、mda、gsh的含量与空白组相比，#p<0.05，##p<0.01；与模型组相比，*p<0.05，**p<0.01结果表明，本发明实施例3剂量组可有效降低nafld小鼠血清甘油三酯(tg)、总胆固醇(t-chol)水平，显著改善高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)水平，提高肝脏总抗氧化能力(t-aoc)，降低nafld小鼠肝脏组织丙二醛(mda)，显著提高肝细胞中还原型谷胱甘肽(gsh)。其中，mda作为脂质过氧化降解的产物之一，可以反映体内脂质过氧化的程度及细胞受自由基攻击的程度；gsh是体内重要保护因子，在保护生物膜及生物大分子免受自由基损伤方面起着重要作用。综上，说明本发明对调节血脂水平有积极作用。表3各组小鼠肝组织cyp4502e1蛋白表达的光密度积分值比较*p<0.05、**p<0.01结果表明，与空白组相比，模型组肝组织cyp4502e1水平显著升高；与模型组相比，服用了本发明实施例3的小鼠肝组织cyp4502e1水平显著降低。表4ppar-γ、nf-κb、iκb-α蛋白在各组小鼠肝组织中的表达量*p<0.05、**p<0.01结果表明，模型组小鼠肝组织ppar-γ值显著低于空白组，而nf-κb、iκb-α值显著高于空白组。服用本发明实施例3的小鼠肝组织ppar-γ值显著高于模型组，而nf-κb、iκb-α值低于模型组。说明本发明实施例3可以增加ppar-γ表达，抑制nf-κb、iκb-α蛋白表达。ppar-γ在肝脏脂肪酸代谢及脂质氧化过程中扮演重要的角色。nf-κb在细胞凋亡中起关键作用。脂肪肝发病时，nf-κb过度活化，从而启动细胞机制，产生炎症、免疫等反应。表5各组小鼠肝组织tnf-α的表达量(n＝15，)*p<0.05、**p<0.01结果表明，模型组肝组织与空白组比较，tnf-α表达量明显增加。服用本发明实施例3的各剂量组与模型组比较，有非常显著性差异。tnf-α是主要炎症介质之一。该实验说明本发明实施例3能有效减轻本实验小鼠肝组织病理损伤程度，具有抗炎的作用。图1结果表明，本发明实施例3剂量组可有效降低nafld小鼠血清谷草转氨酶(got)和谷丙转氨酶(gpt)的含量。got和gpt是肝细胞损伤的敏感指标，均能反映肝细胞的损伤程度，血清中的got和gpt水平的升高是肝损伤和正常肝功能被扰乱的指标。图2-图5结果表明，与空白组相比，模型组中p-ampkα的蛋白表达水平显著降低，与模型组相比，服用本发明实施例3的剂量组p-ampkα的蛋白表达水平显著升高；与空白组相比，模型组中srebp-1c、fasn蛋白表达水平显著升高；与模型组相比，服用本发明实施例3的剂量组中srebp-1c、fasn的蛋白表达水平显著降低。ampk在肝脏脂质稳态调节中发挥重要作用，可通过调节脂肪代谢相关靶蛋白活性从而影响肝脏脂质代谢，由于ampk的活性与其α亚基thr-172点位的磷酸化(p-ampkα)密切相关，所以通过检测p-ampkα的蛋白表达量即可评估ampk的活性。固醇调节元件结合蛋白(srebp-1c)在肝脏表达高，能通过脂肪酸上调cyp4502e1的表达而促进肝内氧化应激和脂质过氧化，诱导nafld发生。综上，说明本发明通过上调p-ampkα，提高ampk的活性而显著抑制固醇调节因子结合蛋白(srebp-1c)的转录活性，进而抑制甘油三酯的合成。图6结果表明，模型组中的tlr4、myd88表达量升高，tlr4是诱发天然免疫的重要因子，广泛分布于免疫和非免疫细胞。主要作用是识别g-细菌细胞壁脂多糖，启动机体的固有免疫系统，通过一系列集联反应激活nf-κb，促进肿瘤坏死因子tnf-α和其他各类炎症因子释放，引起炎症反应。myd88是依赖性的tlr4信号通路，主要通过tik向胞内传递信号，激活c-jun氨基端蛋白激酶和核因子，引起多种炎性细胞因子和化学因子的释放，如白介素和肿瘤坏死因子-α。服用本发明实验例3的小鼠tlr4、myd88表达量降低，说明本发明起到确切的抗炎效果。2、对过氧化氢诱导人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用体外培养人脐静脉内皮细胞，将细胞分为6组，即空白对照组、h2o2损伤组、h2o2+vit组、h2o2+本发明实施例3剂量(1、5、10μmol/l)组。将750μmol/lh2o2作用于加入vitc及不同浓度本发明实施例3预培养24h的内皮细胞，继续培养18h，采用四甲基偶氮唑盐比色法(mtt法)检测od值和增值率；定量检测各实验组超氧化物歧化酶(sod)、谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)的活力。实验结果见表6、表7。统计学处理实验数据以表示，结果用单因素方差分析，p<0.05为有显著性差异，p<0.01为有非常显著性差异；p>0.05为无统计学意义。应用spss19.0统计软件分析数据。表6各组od和增值率组别od值增值率(％)空白组对照组1.125±0.0610h2o2损伤组0.527±0.232-53.2h2o2+vitc组0.628±0.163-44.2低剂量组0.689±0.642*-38.8中剂量组0.761±0.076**-32.4高剂量组0.821±0.052**-27.1表7各组sod和gsh-px组别sod(nmol/mg)gsh-px含量(g/l)空白组对照组16.28±2.1914.28±2.19h2o2损伤组11.72±1.56##2.18±0.60h2o2+vitc组13.82±1.296.39±2.18低剂量组12.93±1.283.37±0.86中剂量组14.27±1.52*5.29±0.56高剂量组15.27±1.02**12.48±2.15与h2o2损伤组比较，*p<0.05结果表明，内皮细胞h2o2损伤后吸光度(od)低于空白对照组，本发明预处理后od值增加且呈剂量依赖性；h2o2损伤可引起细胞sod及gsh-px活性明显降低，本发明能维持和促进sod、gsh-px的活性，且呈剂量依赖性，各指标差异有极显著性(p﹤0.01)，并且呈剂量依赖性抑制h2o2诱导的内皮细胞的凋亡。用vitc和不同浓度的本发明实施例3干预后，各组细胞内sod和gsh-px活性逐渐升高，与h2o2损伤组相比有显著差异。h2o2使内皮细胞的mtt减少，细胞活性下降，而加入不同浓度的本发明实施例3可促进mtt形成，增加细胞活性，抑制h2o2诱导的内皮细胞损伤作用。结论：本发明能抑制h2o2诱导的血管内皮细胞的损伤及凋亡，其作用与维持sod、gsh-px活性有关。胞内sod和gsh-px活性的升高表明本发明提高了机体抗氧化保护机制，使得h2o2与氧自由基能被及时清除，而非蓄积于细胞内，引发细胞脂质过氧化，导致细胞受损。提示本发明能保护血管，减少自由基对血管的伤害，延缓血管硬化和软化血管。以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。当前第1页12