魔芋葡甘露聚糖用于治疗和改善肥胖症的应用的制作方法

本发明涉及健康领域，具体涉及魔芋葡甘露聚糖用于治疗和改善肥胖症的应用。

背景技术

肥胖是一种在全球范围内流行的重大慢性疾病，严重威胁人类健康。近年来的研究表明肥胖与肠道微生物密切相关。肠道微生物的紊乱可能引起全身慢性炎症而触发肥胖等代谢疾病。低聚糖作为膳食中含量丰富、结构复杂的成分之一，不能被人体直接消化吸收，而是被肠道共生菌所分解利用并为其提供能量。因此，低聚糖对于维持肠道微生物稳态、保护肠道屏障具有重要意义，常被称作“益生元”。目前有研究表明某些特定的低聚糖可通过菌群相关机制调控肥胖的发生和发展。虽然魔芋葡甘露聚糖(konjacflour，kf)作为益生元对肥胖的作用已被广泛研究，但是不同研究中魔芋葡甘露聚糖减肥的临床结果常常表现出比较大的不一致性，因此对使用魔芋葡甘露聚糖控制体重产生了一定的限制，造成这一情况的原因之一是魔芋葡甘露聚糖减肥作用的机理尚不明确。目前魔芋葡甘露聚糖对肠道微生物群落的影响尚未系统报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供魔芋葡甘露聚糖用于治疗和改善肥胖症的应用，魔芋葡甘露聚糖不仅可以改善肥胖相关指标，而且可以增加肠道微生物的多样性并改善菌群结构，促进有益菌的生成而抑制促肥胖菌的生长。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案是：它由以下方面组成：魔芋葡甘露聚糖干预的抗肥作用效果；魔芋葡甘露聚糖干预对炎症的影响；魔芋葡甘露聚糖干预对肠道微生物的调节作用；魔芋葡甘露聚糖干预对结肠肠道屏障功能的影响；魔芋葡甘露聚糖干预对能量代谢的影响；魔芋葡甘露聚糖对肠道微生物与肥胖发生的相关性。

魔芋葡甘露聚糖用于治疗和改善肥胖症的应用的应用的方法，具体步骤如下：

a)将魔芋葡甘露聚糖溶于水，按魔芋葡甘露聚糖使用量为5-10g/人/天给药；

b)连续给药。

所述溶于水魔芋葡甘露聚糖每日可以可分2次食用。

所述魔芋葡甘露聚糖使用量为5g/人/天。

所述魔芋葡甘露聚糖干预的抗肥作用效果；魔芋葡甘露聚糖干预对炎症的影响；魔芋葡甘露聚糖干预对肠道微生物的调节作用；魔芋葡甘露聚糖干预对结肠肠道屏障功能的影响；魔芋葡甘露聚糖干预对能量代谢的影响；魔芋葡甘露聚糖对肠道微生物与肥胖发生的相关性；通过魔芋葡甘露聚糖对肥胖患者的临床研究和对于肥胖小鼠模型实验得到。

采用上述技术方案后，本发明有益效果为：魔芋葡甘露聚糖可以改善肥胖相关指标(如：bmi、脂肪量、血糖、血脂和肝功能)。

魔芋葡甘露聚糖干预改善了肥胖患者的肠道微生物多样性(包括丰富度和均匀度)。

魔芋葡甘露聚糖对肠道微生物物种组成的影响：①促进益生菌毛螺菌科(lachnospiraceae)、罗斯氏菌属(roseburia)、solobacterium、r.inulinivorans、产气荚膜梭菌(c.perfringens)和i.butyriciproducens的生长；②抑制有害菌乳球菌属(lactococcus)、脆弱拟杆菌(b.fragilis)、乳酸球菌(l.garvieae)、b.coprophilus、卵形拟杆菌(b.ovatus)和多形拟杆菌(b.thetaiotaomicron)的大量滋生。

erysipelotrichaceaeucg.003、lachnospiraceaenk4a136group、卵形拟杆菌(b.ovatus)和产气荚膜梭菌(c.perfringens)在肥胖的发展中起到重要作用。

通过对肥胖患者的临床研究和对于肥胖小鼠模型实验两方面的结果均表明魔芋葡甘露聚糖对治疗肥胖有良好的效果，表现在减少体重、脂肪量和血脂、改善炎症反应、代谢和肠道屏障功能以及调节肠道微生物结构；因而，魔芋葡甘露聚糖治疗肥胖的作用机制之一是通过改善肠道菌群结构进而调节代谢和炎症来实现的。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是魔芋葡甘露聚糖对于肥胖患者的临床研究流程图；

图2是魔芋葡甘露聚糖对于肥胖小鼠模型实验的流程图；

图3是肥胖患者kf和安慰剂治疗前后的肥胖指数；

图4是肥胖患者kf和安慰剂治疗前后的血液生化指标；

图5是魔芋葡甘露聚糖治疗对肠道微生物丰富性和多样性的影响；

图6是组间肠道微生物门、科和属的显著变化图；

图7是不同组中除了丰度为前35个科和属的其余科和属的丰度；

图8-图9是不同组中种水平的相对丰度；

图10-11是肥胖指数和血清生化指标与肠道微生物门、科、属和种相对丰度的相关性。

附图标记说明：图5中a-d肠道微生物的α多样性：(a)observedspecies，(b)chao指数，(c)simpson指数，(d)shannon指数e：β多样性。§p<0.05versusbp和*p<0.05、**p<0.01versusbkf。bp：beforeplacebo，ap：afterplacebo，bkf：beforekonjakuflour，akf：afterkonjakuflour；

图6中(a)相对丰度为前18的不同门；(b)相对丰度为前35的不同科；(c)相对丰度为前35的不同属；物种相对丰度经过标准化处理后得到z值，即一个样品在某个分类上的z值为样品在该分类上的相对丰度和所有样品在该分类的平均相对丰度的差除以多有样品在该分类上的标准差所得到的值；§p<0.05versusbp和*p<0.05、**p<0.01versusbkf；

图8-图9中(a)roseburiainulinivorans，(b)脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis)，(c)乳酸球菌(lactococcusgarvieae)，(d)bacteroidescoprophilus，(e)卵形拟杆菌(bacteroidesovatus)，f粪拟杆菌(bacteroidescaccae)，(g)产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens)，(h)bacteroidalesbacteriumph8，(i)多形拟杆菌(bacteroidesthetaiotaomicron)，(j)intestinimonasbutyriciproducens，(k)actinomycesgraevenitzii，(l)clostridiumsp.atcc29733，(m)solobacteriummoorei，(n)嗜热脂肪地芽胞杆菌(geobacillusstearothermophilus)，(o)alistipesfinegoldii。§p<0.05apversusbp和*p<0.05akfversusbkf；

图10-11中(a)相对丰度为前18的不同门；(b)相对丰度为前35的不同科；(c)相对丰度为前35的不同属；(d)相对丰度为前35的不同种。*p<0.05和**p<0.01。

具体实施方式

参看图1-图5所示，本具体实施方式采用的技术方案是：它由以下方面组成：魔芋葡甘露聚糖干预的抗肥作用效果；魔芋葡甘露聚糖干预对炎症的影响；魔芋葡甘露聚糖干预对肠道微生物的调节作用；魔芋葡甘露聚糖干预对结肠肠道屏障功能的影响；魔芋葡甘露聚糖干预对能量代谢的影响；魔芋葡甘露聚糖对肠道微生物与肥胖发生的相关性。

魔芋葡甘露聚糖用于治疗和改善肥胖症的应用的应用的方法，具体步骤如下：

a)将魔芋葡甘露聚糖溶于水，按魔芋葡甘露聚糖使用量为5-10g/人/天给药；

b)连续给药。

所述溶于水魔芋葡甘露聚糖每日可以可分2次食用。

所述魔芋葡甘露聚糖使用量为5g/人/天。

魔芋葡甘露聚糖对于肥胖患者的临床研究包含以下步骤：

a1、肥胖患者的选择；入选标准：(1)男女不限；(2)25岁<年龄<35岁；(3)bmi≥28kg/m2；排除标准：(1)怀孕、哺乳或更年期；(2)心力衰竭、心肌梗死、心绞痛等其它心血管疾病；(3)糖尿病等其它内分泌疾病。(4)脑梗塞、脑出血；(5)合并慢性炎症；慢性腹胀、便秘、消化不良等胃肠道疾病；(6)合并某些过敏性疾病如哮喘等；(7)合并感染性疾病(严重感染、肿瘤、传染病)；(8)近1月内服用抗生素、甾体类药物、益生菌、益生元等；(9)其它器官严重损害，严重的肝肾功能损害，风湿、类风湿性疾病；(10)有手术及其它应激情况人群；

a2、肥胖患者的分组；按照随机双盲原则将符合入组标准的69例肥胖患者随机分成两组：(1)安慰剂组(31例)；每天早餐前和晚饭前15min用150ml的温水冲服5g藕粉，共服用5周；(2)实验组(38例)；每天早餐前和晚饭前15min用150ml的温水冲服5g魔芋葡甘露聚糖，共服用5周；

a3、取样；用一次性40ml粪便采集杯收集每个研究对象干预前后的粪便样品各5g，并以180-220mg分装于2ml无菌离心管中，迅速置于-80℃超低温冰箱中保存；

a4、粪便样品细菌dna提取；粪便dna提取使用qiaampdnastoolminikit试剂盒；

a5、粪便样品细菌dna检测；(1)琼脂糖凝胶电泳检测dna完整性；(2)nanodroptmone/onec超微量紫外-可见光分光光度计检测dna浓度和纯度；

a6、粪便样品细菌16srdna测序；16srdnav3-4区的文库构建；16srdnav3-4区的文库测序；

a7、生物信息学分析；miseq测序得到的pereads首先使用flash进行拼接，同时可对序列质量进行质控，在去除低质量碱基及接头污染序列等操作过程后完成数据过滤，后续分析使用qiime软件包完成，统计和作图主要使用r完成；

a8、统计学分析；采用spss18.0软件进行数据的统计学分析，所有数值都以平均值±标准差表示(χ±s)，干预前后的数据运用配对样本t检验(pairedstudent’st-test)进行比较，组间干预前后的数据变化运用独立样本t检验(unpairedstudent’st-test)进行比较，认为当p<0.05时具有显著性差异。

魔芋葡甘露聚糖对于肥胖小鼠模型实验包含以下步骤：

s1、实验动物选择；无特定病原体(specifiedpathogensfree，spf)级健康雄性c57bl/6j小鼠30只(3周齡)，购买于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号scxk(湘)2016-0002；

s2、实验分组和动物饲养；30只c57bl/6j小鼠饲养在温度为20-25℃的spf环境中，12h昼夜明暗交替日光灯照明；自由饮水和自由进食spf维持饲料适应喂养1周后，称重后随机分成3组，每组10只：(1)对照组(controlgroup)。自由饮水和自由进食低脂低糖对照饲料喂养12周；(2)高脂肪饮食组(hfdgroup)；自由饮水和自由进食60％高脂肪模型饲料喂养12周；(3)魔芋葡甘露聚糖组(kfgroup)；自由饮用kf配制的水溶液(保证小鼠每天摄入0.3gkf)和自由进食60％高脂肪模型饲料喂养12周；(由于测得每只小鼠每天的平均饮水量约为4.5ml，因此配制67mg/ml的kf水溶液供小鼠饮用)；喂养期间每周测定一次小鼠体重，每隔一天称量并记录饲料消耗量(注意：每隔一天换新饲料)，计算食物功效比(foodefficiencyratio，fer)，即在小鼠喂养期间，小鼠增加的总体重除以小鼠消耗的总饲料量；

s3、样品的采集和储存；分为小鼠粪便样品采集、小鼠血液样品采集、肝脏和脂肪组织分离与保存；

s4、脂肪组织和肝脏细胞形态学观察

s5、血清生化分析；分为血清tc浓度测定、血清tg浓度测定、血清lep浓度测定、血清adp浓度测定、血清tbars浓度测定、血清tnf-α浓度测定、血清il-6浓度测定、血清lps浓度测定；

s6、real-timepcr基因表达分析；分为rna提取、逆转录pcr、引物合成、real-timepcr

s7、粪便样品细菌dna提取；同a4；

s8、粪便样品细菌dna检测；同a5；

s9、粪便样品细菌16srdna测序；同a6；

s10、生物信息学分析；同a7；

s11、统计学分析；同a8。

参看图3所示，本具体实施方式实验结果魔芋葡甘露聚糖对肥胖指数的影响：治疗前安慰剂组和魔芋葡甘露聚糖(konjacflour，kf)组的肥胖指数没有显著性差异。安慰剂治疗没有引起任何肥胖指数的显著变化。kf治疗显著减少了患者的身体质量指数(bodymassindex，bmi)、脂肪量(fatmass)和体脂百分比(percentagebodyfat，pbf)(p<0.05或p<0.001)。这些结果表明kf治疗可以减少肥胖患者的体重和脂肪量。

参看图4所示，本具体实施方式实验结果魔芋葡甘露聚糖对血液生化指标的影响：治疗前安慰剂组和kf组的血液生化指标没有显著性差异。安慰剂治疗没有引起任何血液生化指标的显著变化。kf治疗显著减少了患者的甘油三酯(triglyceride，tg)、糖化血红蛋白(glycatedhaemoglobina1c，hba1c)、谷草转氨酶(aspartateaminotransferase，ast)和谷丙转氨酶(alanineaminotransferase，alt)含量(p<0.05)。这些结果表明kf治疗可以改善肥胖患者的血糖和肝功能。

参看图5所示，本具体实施方式实验结果魔芋葡甘露聚糖对肠道微生物多样性和丰富性的影响：安慰剂引起肠道微生物observedspecies、chao指数、simpson指数和shannon指数显著减少(p＝0.0104、p＝0.0102、p＝0.0317和p＝0.0274)。kf治疗引起肠道微生物的observedspecies和chao指数的显著增加(p＝0.0235和p＝0.0044)，而对simpson指数和shannon指数没有显著影响。这些结果表明安慰剂治疗引起肠道微生物的α多样性减少，而kf治疗引起肠道微生物的α多样性增加。为了进一步研究肠道微生物的整体结构是否发生改变，我们通过主坐标分析(principalcoordinatesanalysis，pcoa)进一步分析发现安慰剂治疗前后肠道微生物的结构没有发生显著变化(p＝0.151)，而kf干预前后肠道微生物的结构发生显著改变(p<0.001)。这些结果表明kf治疗引起肠道微生物的β多样性发生改变。

参看图6-图9所示，本具体实施方式实验结果魔芋葡甘露聚糖对肠道微生物门、科、属和种丰度的影响：在门水平上，安慰剂治疗没有引起显著变化，而kf治疗后引起放线菌门(actinobacteria)和酸杆菌门(acidobacteria)的丰度显著增加(p<0.05)。在科水平上，安慰剂治疗引起了双歧杆菌科(bifidobacteriaceae)和明串珠菌科(leuconostocaceae)的丰度显著减少(p<0.05)。kf治疗引起毛螺菌科(lachnospiraceae)、芽胞杆菌科(bacillaceae)、气球菌科(aerococcaceae)、(solirubrobacteraceae)、288-2、和rb41的丰度显著增加(p<0.05或p<0.01)，而引起芽孢乳杆菌科(sporolactobacillaceae)的丰度显著减少(p<0.05)。在属水平上，安慰剂治疗引起dorea的丰度显著减少(p<0.05)。kf治疗引起罗斯氏菌属(roseburia)、lachnoclostridium、erysipelotrichaceaeucg-003、(毛螺菌科)lachnospiraceaenk4a136group、(毛螺菌科)lachnospiraceaeucg-004、fusicatenibacter、(毛螺菌科)lachnospiraceaeucg-003、clostridiumsensustricto13、howardella、intestinimonas、芽孢杆菌属(bacillus)、holdemania、epulopiscium、candidatus、soleaferrea、solobacterium、solirubrobacter和abiotrophia的丰度显著增加(p<0.05、p<0.01或p<0.001)，而引起乳球菌属(lactococcus)、eubacteriumbrachygroup、芽孢乳杆菌属(sporolactobacillus)、地芽孢杆菌属(geobacillus)、silanimonas的丰度显著减少(p<0.05)。在种水平上，安慰剂治疗引起脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis)和粪拟杆菌(bacteroidescaccae)的丰度显著增加(p<0.05)。kf治疗引起roseburiainulinivorans、产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens)、intestinimonasbutyriciproducens、actinomycesgraevenitzii、clostridiumsp.atcc29733、solobacteriummoorei的丰度显著增加(p<0.05)，而引起脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis)、乳酸球菌(lactococcusgarvieae)、bacteroidescoprophilus、卵形拟杆菌(bacteroidesovatus)、粪拟杆菌(bacteroidescaccae)、bacteroidalesbacteriumph8、多形拟杆菌(bacteroidesthetaiotaomicron)、嗜热脂肪地芽胞杆菌(geobacillusstearothermophilus)和alistipesfinegoldii的丰度显著减少(p<0.05)。

参看图10-图11所示，本具体实施方式实验结果肠道微生物与肥胖指数和血液生化指标的相关性：在门水平上，有5个门与肥胖相关指标存在显著的相关性(p<0.05或p<0.01)。其中变形菌门(proteobacteria)与肥胖有关。变形菌门(proteobacteria)的丰度与血清ast和alt含量显著正相关(p<0.01)。在科水平上，有13个科与肥胖相关指标存在显著的相关性(p<0.05或p<0.01或p<0.01)。其中普雷沃氏菌科(prevotellaceae)与肥胖有关。普雷沃氏菌科(prevotellaceae)的丰度与血清fbg含量显著正相关(p<0.01)。在属水平上，有16个属与肥胖相关指标存在显著的相关性(p<0.05或p<0.01)。其中erysipelotrichaceaeucg.003和lachnospiraceaenk4a136group与kf治疗有关。erysipelotrichaceaeucg.003的丰度与pbf显著负相关(p<0.01)，lachnospiraceaenk4a136group的丰度血清alt含量显著负相关(p<0.01)。在种水平上，有15个种与肥胖相关指标存在显著的相关性(p<0.05或p<0.01)。其中卵形拟杆菌(bacteroidesovatus)和产气荚膜梭菌梭菌(clostridiumperfringens)与kf治疗有关。卵形拟杆菌(bacteroidesovatus)的丰度与bmi和whr显著负相关(p<0.01)，产气荚膜梭菌梭菌(clostridiumperfringens)的丰度与血清tc和ldl的含量显著负相关(p<0.01)。

综上所述，魔芋葡甘露聚糖不仅可以改善肥胖相关指标，而且可以增加肠道微生物的多样性并改善菌群结构，促进有益菌的生成而抑制促肥胖菌的生长。

以上所述，仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其它修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。