一种靶向动脉粥样硬化斑块纳米材料的制备方法与流程

本发明涉及一种靶向动脉粥样硬化斑块纳米材料的制备方法。
背景技术：
近些年来，随着经济的飞速发展，整个社会发生了巨大的变化，大家的生活条件日益提高，生活节奏也越来越快，人们吃饭越来越不规律不健康，经常吃一些脂肪高、热量高的食物，饮食不规律，再加上运动量达不到，使得更多年轻人中也开始出现动脉粥样硬化的情况。动脉粥样硬化是导致心肌梗塞、中风和慢性血管紧张素等心血管疾病的主要原因之一，动脉粥样硬化斑块的大小和组成都与其病理生理行为有关。最近几年，动脉粥样硬化靶向定位治疗成了新的研究热点，靶向给药系统亦称为靶向制剂(targetingdeliverysystem，tds)，是指将药物包在载体材料中，由载体将药物通过不同给药方式送到特定的靶向部位，使药物在此处聚集的给药系统。因此，有必要提出有效的靶向动脉粥样硬化斑块制剂，解决上述动脉粥样硬化问题。技术实现要素：本发明针对上述现有技术的不足，提供一种靶向动脉粥样硬化斑块纳米材料的制备方法。该方法制备的纳米材料靶向性明显，效果显著。本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种靶向动脉粥样硬化斑块纳米材料的制备方法，步骤包括：(1)冰浴下，将草酰氯溶液缓慢滴加到二硫代二丙酸溶液中，活化10min，再放入恒温油浴锅中，35℃下反应2-3h；再进行旋蒸后加入无水thf溶解，得到溶液a；草酰氯与二硫代二丙酸的摩尔比为1:1-2:1；溶液a浓度6.34×10-5mol/ml；(2)将溶液a缓慢滴加到含三乙胺的熊果酸溶液中，混匀，35℃油浴锅中反应3-4h，旋蒸，得到熊果酸二硫代二丙酸衍生物；熊果酸与三乙胺的摩尔比为1:1-1:2；溶液a与熊果酸的摩尔比为1:1-2:1；(3)在熊果酸二硫代二丙酸衍生物中依次加入甲酰胺、edc、dmap，置于恒温油浴锅中，0℃-55℃下活化2h，得到溶液b；熊果酸二硫代二丙酸衍生物：edc：dmap的摩尔比为1:1.2:1；1mol熊果酸二硫代二丙酸衍生物对应甲酰胺为3.8×104ml；(4)将透明质酸与甲酰胺混合溶解后，滴加至溶液b中，置于恒温油浴锅中，55℃反应24h，得到溶液c；1mol透明质酸对应20-30ml甲酰胺；熊果酸二硫代二丙酸衍生物：透明质酸的摩尔比为1:1-1:2；(5)将溶液c转移到截留分子量为2000da的透析袋中，进行透析反应，透析完成后，吸出保留液进行离心，取上清液冻干，得到聚合物胶束载体材料；(6)将聚合物胶束载体材料、甲酰胺和dmso混合溶解，得到溶液d；将姜黄素、甲酰胺溶解，得到溶液e；将溶液d和溶液e混合后，转移到截留分子量为3000da的透析袋中，进行透析反应6h-24h，透析完成后，吸出保留液进行离心；取上清液，过0.8μm和0.45μm的微孔滤膜，冻干后得到载药姜黄素胶束；10mg聚合物胶束载体材料溶于3ml甲酰胺和3mldmso的混合溶液；1mg姜黄素对应1ml甲酰胺；溶液d中聚合物胶束材料的质量与溶液e中姜黄素的质量比为10:1.优选的,所述步骤(3)中的恒温油浴锅中，35℃下活化2h。优选的,所述步骤(6)中的取上清液过0.8μm和0.45μm的微孔滤膜之前，先将上清液超声1min后，再过0.8μm和0.45μm的微孔滤膜。优选的,所述步骤(6)中的透析时间为12h。有益效果：本申请二硫代二丙酸有氧化还原敏感，其二硫键在高活性ros条件下可发生断裂，熊果酸有抗动脉粥样硬化的药理作用，有疏水性；透明质酸具有亲水性，对动脉粥样硬化具有靶向性。利用熊果酸与透明质酸通过酯化反应，制备成纳米空白聚合物胶束，采用姜黄素作为模型药物，制成包裹姜黄素的纳米聚合物胶束。所制备的纳米材料具有as靶向性，效果显著。附图说明图1为本发明透明质酸(ha)，熊果酸(ua)和聚合物胶束载体材料的氢谱图；图2为本发明姜黄素标准回归曲线图；图3为本发明试验例中荧光强度图谱。具体实施方式本申请首先将二硫代二丙酸与熊果酸酯化反应生成酰氯，再与透明质酸反应制备成纳米空白聚合物胶束，然后通过透析法将姜黄素包裹其中，得到胶束的粒径、包封率和载药量均优良的姜黄素胶束。二硫代二丙酸有氧化还原敏感，其二硫键在高活性ros条件下可发生断裂；熊果酸(ursolicacid，ua)，又被称为乌苏酸，有疏水性可以降低人的血胆固醇和β-脂蛋白的水平，有抗动脉粥样硬化的作用，本申请就利用其通过降血脂治疗动脉粥样硬化的作用，将其接在透明质酸上，形成两亲性的新型载体材料，进而制成合理制剂，用于对动脉硬化的靶向治疗；透明质酸(hyaluronicacid，ha)，具有很强的亲水性，常在其上面接一些疏水性的物质进行修饰做成新型载体材料。ha对动脉粥样硬化斑块有很强的亲和性，所以，常用修饰的透明质酸作为载体材料包裹药物靶向治疗动脉粥样硬化。利用熊果酸与透明质酸通过酯化反应，制备成纳米空白聚合物胶束，采用姜黄素作为模型药物，制成包裹姜黄素的纳米聚合物胶束。本申请由于胶束外壳具有亲水性这一合适的设计，使药物在体内有了长循环的作用，使治疗效果更加显著，也会减少很多副作用。本申请所用实验药品与试剂厂家信息如下：二硫代二丙酸：上海麦克林生化科技有限公司；熊果酸(ua)：xybscience；酶切寡聚透明质酸钠(ha)：华熙福瑞达生物医药有限公司；1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)：aladdinchemistryco.ltd；甲酰胺：天津市永大化学试剂有限公司；纯净水：杭州娃哈哈集团有限公司；姜黄素：天津市登科化学试剂有限公司；三乙胺：天津市永大化学试剂有限公司；n,n-二甲基甲酰胺(dmf)：天津博迪化工股份有限公司；无水四氢呋喃(thf)：国药集团化学试剂有限公司。实验仪器型号及厂家信息如下：恒温磁力搅拌器：90-1型，上海沪西分析仪器厂；集热式恒温加热磁力搅拌器：df-101s型，巩义市予华仪器有限公司；青岛海尔冰箱：bcd-205f型，青岛海尔有限公司；冻干机：drc-1100型，日本科技有限公司；试管干燥器：c型，郑州长城科工贸有限公司；超声波清洗器：sk250型，上海科导超声仪器有限公司；移液枪：龙兴创实验仪器有限公司；微量高速离心机：tg-16s型，四川蜀科仪器有限公司；高效液相色谱仪：gb12c型，岛津企业管理有限公司；塑料离心管：姜堰市康达实验器材；玻璃仪器：天津玻璃仪器厂；分析天平：mp5002型，奥豪斯国际贸易(上海)有限公司。实施例1一种靶向动脉粥样硬化斑块纳米材料的制备方法，步骤包括：(1)冰浴下，将草酰氯溶液缓慢滴加到二硫代二丙酸溶液中，活化10min，再放入恒温油浴锅中，35℃下反应2-3h；再进行旋蒸后加入无水thf溶解，得到溶液a；草酰氯与二硫代二丙酸的摩尔比为1:1-2:1；溶液a浓度6.34×10-5mol/ml；草酰氯溶液为草酰氯溶解于无水thf中，100μl草酰氯溶液对应1ml无水thf；二硫代二丙酸溶液为二硫代二丙酸溶解于无水thf中，1mol二硫代二丙酸对应1.05×104ml无水thf；(2)将溶液a缓慢滴加到含三乙胺的熊果酸溶液中，混匀，35℃油浴锅中反应3-4h，旋蒸，得到产物熊果酸二硫代二丙酸衍生物(具体合成路线如下)；熊果酸溶液为熊果酸溶解于无水thf中；熊果酸与三乙胺的摩尔比为1:1-1:2；溶液a与熊果酸的摩尔比为1:1-2:1；(3)在熊果酸二硫代二丙酸衍生物中依次加入甲酰胺、edc、dmap，置于恒温油浴锅中，55℃下活化2h，得到溶液b；熊果酸二硫代二丙酸衍生物：edc：dmap的摩尔比为1:1.2:1；1mol熊果酸二硫代二丙酸衍生物对应甲酰胺为3.8×104ml；(4)将透明质酸与甲酰胺混合溶解后，滴加至溶液b中，置于恒温油浴锅中，35℃反应24h，得到溶液c；1mol透明质酸对应20-30ml甲酰胺；熊果酸二硫代二丙酸衍生物：透明质酸的摩尔比为1:1-1:2；(5)将溶液c转移到截留分子量为2000da的透析袋中，进行透析反应不小于24h，期间，每两到三个小时换一次水，透析完成后，吸出保留液进行离心，取上清液冻干，得到聚合物胶束载体材料(具体合成路线如下)；如图1所示，通过透明质酸(ha)，熊果酸(ua)和聚合物胶束载体材料的氢谱比较，可以看出聚合物胶束载体材料的氢谱中，1.91，3.11，3.89，3.91来自于ha，0.67，0.94来自于ua，再有就是在2.55和2.95有峰，是来自于二硫代二丙酸，ha的羟基在4.75有羟基峰，但产物中无此峰，说明ha的羟基发生了反应，产物为聚合物胶束载体材料。(6)将聚合物胶束载体材料10mg、甲酰胺1ml和dmso1ml混合溶解，得到溶液d；将姜黄素1mg、甲酰胺1ml溶解，得到溶液e；将溶液d和溶液e混合后，转移到截留分子量为3000da的透析袋中，进行透析反应12h，透析完成后，吸出保留液进行离心；取上清液超声1min后，过0.8μm和0.45μm的微孔滤膜，冻干后得到载药姜黄素胶束；10mg聚合物胶束载体材料溶于3ml甲酰胺和3mldmso的混合溶液；1mg姜黄素对应1ml甲酰胺；溶液d中聚合物胶束材料的质量与溶液e中姜黄素的质量比为10:1。粒径的测定：将胶束上清液依次过0.8μm和0.45μm的微孔滤膜，加到比色皿中，占比色皿的1/2到2/3为宜，然后用粒径仪分别进行粒径的测定。本申请聚合物胶束的粒径分布情况：将胶束上清液过0.8μm的微孔滤膜后测得平均粒径为465.3nm，过0.45μm的微孔滤膜后测得平均粒径为210.5nm，粒径分布均匀。包封率的测定：包封率(entrapmentefficiency，ee％)是指包裹在胶束中的药物与投料时加入的药物总量的比例。本申请采用hplc进行测定。用移液枪精确量取2ml的胶束溶液于10ml的容量瓶中，加九倍体积的无水乙醇，稀释并且破坏胶束，定容后，取出适量的溶液，过0.45μm的微孔滤膜，进样量为20μl，测其吸光度，然后利用姜黄素标准溶液的标准曲线来进行计算包封率的大小。姜黄素标准溶液的配制：用移液枪将10μg/ml的姜黄素溶液分别准确吸取0.1ml，0.5ml，1ml，5ml，10ml于5个10ml容量瓶中，标号；再都用相同的甲醇溶液定容，混匀，即可得到0.1μg/ml，0.5μg/ml，1μg/ml，5μg/ml，10μg/ml的标准溶液，留着备用。标准曲线测定的方法用的是高效液相色谱法来进行测定，在检测波长为425nm的检测条件下进行，分别测定制得的5个标准溶液的吸光度，将5个标准溶液分别取出2ml过0.22μm的微孔滤膜，然后往高效液相色谱仪中进样进行测定其吸光度，并逐个记录下来，然后按照浓度(c)与吸光度(a)的关系做出回归曲线(如图2所示)。高效液相色谱条件：色谱柱：ods-sp(4.6×250mm，5μm)；流动相：乙腈：5％冰醋酸水溶液＝60：40(v/v)；流速：1ml/min；柱温：35℃；进样量：20μl；检测波长：425nm。分别测定5个标准溶液的吸光度(见表1)，做出标准曲线，求得回归方程为a＝138.2c+16.31。本申请实施例1中载姜黄素胶束的包封率为19.7％。本申请中聚合物胶束载体材料和姜黄素的重量比为10：1，对本申请来说是重要的。表1姜黄素标准溶液的浓度和吸光度胶束的稳定性：将过完0.45μm的微孔滤膜的胶束溶液避光在冰箱4℃环境下放置一周，观察颜色变化，并且再进行粒径测定，看其是否稳定。本申请放置一周后的胶束溶液，颜色没有发生显著变化，没有明显颗粒物，并将放置一周的胶束溶液进行粒径测定。通过对放置一周后胶束溶液进行粒径测定，其平均粒径大小为217.7nm，一周前的平均粒径大小为210.5nm，比较可以知道，制备的胶束溶液稳定性良好。实施例2实施例2的制备方法同实施例1。不同之处仅在于，步骤(3)中的恒温油浴锅中，0℃下活化2h。实施例3实施例3的制备方法同实施例1。不同之处仅在于，步骤(3)中的恒温油浴锅中，55℃下活化2h。实施例1、2和3中不同温度对胶束粒径和包封率的影响检测如表2所示。表2不同温度对胶束粒径和包封率的影响由表2可看出，活化温度对本申请粒径和包封率的影响是重大的。活化温度为35℃时，为最优活化温度。实施例4实施例4的制备方法同实施例1。不同之处仅在于，步骤(6)中的将上清液不经过超声，直接过0.8μm和0.45μm的微孔滤膜。实施例5实施例5的制备方法同实施例1。不同之处仅在于，步骤(6)中的将上清液超声0.5min后，过0.8μm和0.45μm的微孔滤膜。分别测其粒径大小及包封率。实施例1、4和5中不同超声时间对胶束粒径和包封率的影响如表3所示。表3不同超声时间对胶束粒径和包封率的影响由表3可看出，超声时间对本申请粒径和包封率的影响是重大的。超声时间为1min，为最优超声时间。实施例6实施例6的制备方法同实施例1。不同之处仅在于，步骤(6)中的透析反应6h。实施例7实施例7的制备方法同实施例1。不同之处仅在于，步骤(6)中的透析反应18h。实施例8实施例8的制备方法同实施例1。不同之处仅在于，步骤(6)中的透析反应24h。实施例1、6、7和8中不同透析时间对胶束粒径和包封率的影响结果如表4所示。表4不同透析时间对胶束粒径和包封率的影响由表4可看出，透析时间对本申请粒径和包封率的影响是重要的。透析时间为12h时，为最优透析时间。实施例9实施例9的制备方法同实施例1。不同之处仅在于，步骤(6)中的聚合物胶束载体材料5mg。实施例10实施例10的制备方法同实施例1。不同之处仅在于，步骤(6)中的聚合物胶束载体材料15mg。实施例1、9和10中不同用量比对胶束粒径和包封率的影响结果如表5所示。表5不同用量比对胶束粒径和包封率的影响由表5可看出，不同高分子材料的用量对本申请粒径和包封率的影响是重要的。高分子材料与姜黄素的比例为10:1时，为最优的材料用量。药效学评价及结果：1.体外细胞摄取试验将上述制备的纳米材料进行初步药效学试验，将包载姜黄素的纳米制剂，与人脐静脉内皮细胞(huvec)共同孵化，进一步验证其对以lps诱导人脐静脉内皮细胞损伤作为动脉粥样硬化血管损伤模型,以其对递药系统的摄取情况初步评价载体的体外靶向性。结果表示，制剂组摄取明显，具有明显的靶向性，而姜黄素溶液组基本无摄取。2.体内靶向性初步评价载脂蛋白e(apolipoproteine,apoe)是一种多态性蛋白,参与脂蛋白的转化与代谢过程,其基因可以调节许多生物学功能,与动脉粥样硬化发生发展密切相关。apoe-/-小鼠可在高脂饲料喂养下产生严重的高胆固醇血症,并自发形成动脉粥样硬化斑块,其斑块分布及病理特征与人类as斑块极为相似,是研究as理想的动物模型。本试验以apoe-/-小鼠通过高脂饲料喂养建立动脉粥样硬化模型,对其进行病理评价及制剂靶向性研究。结果显示:与正常组相比，本申请模型组血清tc(总胆固醇)、tg(甘油三酯)含量(mmol/l)显著升高(p<0.01)(如表6所示)，进一步表明，所制备的纳米制剂具有一定的as靶向性，效果显著。表6试验例中tc、tg检测结果组别tctgldl-chdl-c正常组3.21±0.110.36±0.050.93±0.121.42±0.32模型组20.22±1.24**1.07±0.21**1.29±0.15**0.89±0.27**在此基础上进行体内活体成像研究，通过对荧光强度进行定量分析靶向制剂组的荧光强度为的1.8倍。本申请以熊果酸与透明质酸为主体，反应成载体材料，然后包载药物，进而制成制剂，测其粒径、电位、载药量以制剂的粒径和包封率，设计出靶向治疗动脉粥硬化的新剂型。本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在本发明的权利要求书的范围内。当前第1页12