一种NK细胞预防黑色素瘤发生的实验方法与流程

本发明属于细胞学、免疫学领域，主要应用于动物实验研究nk细胞预防黑色素瘤发生的效果。尤其是一种nk细胞预防黑色素瘤发生的实验方法。

背景技术：

自然杀伤细胞(naturekillercell)，也称nk细胞，是一类cd56⁺、cd3^-的淋巴细胞，既是重要的外向性自然防御细胞，又是体内多种免疫细胞的调节细胞，具有杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的能力，在机体固有免疫及过继免疫治疗中发挥着重要作用。大多数临床研究所采用的是从癌症患者的外周血中分离得到cd56⁺、cd3^-的nk细胞，而后进行体外扩大培养，随后再回输到患者体内，但是由于大部分患者本身的nk细胞就是缺陷的，所以临床免疫治疗效果并不理想。本发明专利转换了思路，利用健康人外周血分离nk细胞并体外扩增培养，并回输到体内，适用亚健康或者有家族癌症遗传史的人群，此方法可以通过回输nk细胞激活机体的体液免疫和细胞免疫功能，使t淋巴细胞的数量活性增多、加强，并使细胞免疫也进入活跃状态，增强对肿瘤细胞的杀伤作用，增强机体抗肿瘤活性，起到改善亚健康、预防癌症的效果。本发明选择黑色素瘤作为恶性肿瘤的代表，黑色素瘤是一种恶性程度较高，容易出现转移不易治愈，而每个人都可能出现黑色素沉淀，都存在癌变的风险，现阶段使用nk细胞预防肿瘤的实验不多，这是技术领域内的一项空白，所以nk细胞预防黑色素瘤是一项有意义的研究。

技术实现要素：

本发明的目的在于探究nk细胞抗肿瘤效果的不足，采用提前回输nk细胞，从而起到预防黑色素瘤发生的方法，最大限度的利用了nk细胞杀伤肿瘤和提高激发自身免疫力的生物特性，从而预防肿瘤的发生，有利于其在后期研究和临床应用中发挥更明显稳定的作用。本发明步骤简单，效果突出，对nk细胞预防癌症临床前研究具有一定意义。

本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：

一种nk细胞预防balb/c裸鼠黑色素瘤发生的实验方法，步骤如下：

⑴选择4周龄，体重在14-16g的balb/c裸鼠16只，并随机将其分成生理盐水组和nk组，每组8只；

⑵从健康人外周血中分离单个核细胞，并使用细胞因子il-1530-60ng/ml、il-21000-3000u/ml、抗cd16单抗30-60ng/ml、抗cd3单抗1-10ng/ml诱导成nk细胞，扩增培养；

⑶根据组别对小鼠尾静脉回输生理盐水和nk细胞，每周连续3天，连续两周，回输体积为每天0.2ml,nk细胞量为每天1-2×10⁶cells；

⑷回输停止后1周，balb/c裸鼠右腋皮下移植稳定表达rfp+luciferse的黑色素瘤细胞，每只1-3×10⁶cells；

⑸每周通过小动物活体成像系统监测balb/c裸鼠肿瘤生长情况，并每周使用游标卡尺测量肿瘤大小计算体积，肿瘤体积＝长径×短径²/2,；

⑹黑色素瘤细胞在balb/c裸鼠体内生长21天后对其进行取材，对瘤体称重比较，对脾脏上清进行elisa检测il-2、il-6、tnf-α炎性因子浓度。

而且，黑色素瘤细胞为a375细胞。

本发明的优点和积极效果是：

1.本发明中nk组balb/c裸鼠免疫力较强，成瘤较慢，与生理盐水组存在显著性差异(p≤0.01)。

2.本发明中nk组balb/c裸鼠成瘤率较低，肿瘤较小，与生理盐水组存在显著性差异(p≤0.01)，

3.本发明中nk组balb/c裸鼠中促进肿瘤生长因子il-6浓度较低，抑制肿瘤生长因子il-2、tnf-α较高，均与生理盐水组存在显著性差异(p≤0.01)。

附图说明

图1为本发明nk细胞回输前表型。

图2为本发明balb/c裸鼠每周活体成像照片。

图3为本发明balb/c裸鼠每周活体成像肿瘤荧光值变化。

图4为本发明balb/c裸鼠每周肿瘤体积变化。

图5为本发明balb/c裸鼠肿瘤重量。

图6为本发明balb/c裸鼠炎性因子浓度。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明在实验方法中做了以下创新：

1.免疫细胞及肿瘤细胞种类的选择；

2.nk细胞用途是预防黑色素瘤；

3.nk细胞给药方式和剂量；

4.为了更好的说明nk细胞能够增强小鼠免疫力、提高小鼠体内免疫细胞活力，本发明选择nk细胞停止后1周皮下植入肿瘤细胞，每只2×10⁶cells左右。

具体过程描述如下：

一种nk细胞预防balb/c裸鼠黑色素瘤发生的实验方法，该方法由下列步骤组成：

⑴选择4周龄，体重在14-16g的balb/c裸鼠16只，并随机将其分成生理盐水组和nk组，每组8只；

⑵从健康人外周血中分离单个核细胞，并使用细胞因子il-1530-60ng/ml、il-21000-3000u/ml、抗cd16单抗30-60ng/ml、抗cd3单抗1-10ng/ml诱导成nk细胞，扩增培养；

⑶根据组别对小鼠尾静脉回输生理盐水和nk细胞，每周连续3天，连续两周，回输体积为每天0.2ml,nk细胞量为每天1-2×10⁶cells；

⑷回输停止后1周，balb/c裸鼠右腋皮下移植稳定表达rfp+luciferse的黑色素瘤细胞(a375细胞)，每只2×10⁶cells左右；

⑸每周通过小动物活体成像系统监测balb/c裸鼠肿瘤生长情况，并每周使用游标卡尺测量肿瘤大小计算体积(肿瘤体积＝长径×短径²/2)；

⑹黑色素瘤细胞在balb/c裸鼠体内生长21天后对其进行取材，对瘤体称重比较，对脾脏上清进行elisa检测il-2、il-6、tnf-α炎性因子浓度。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例和附图，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。

技术特征：

技术总结
本发明涉及一种NK细胞预防黑色素瘤发生的实验方法，涉及免疫细胞及肿瘤细胞种类的选择；NK细胞用途是预防黑色素瘤；NK细胞给药方式和剂量；为了更好的说明NK细胞能够增强小鼠免疫力、提高小鼠体内免疫细胞活力，本发明选择NK细胞停止后1周皮下植入肿瘤细胞，每只2×106cells左右。采用提前回输NK细胞，从而起到预防黑色素瘤发生的方法，最大限度的利用了NK细胞杀伤肿瘤和提高激发自身免疫力的生物特性，从而预防肿瘤的发生，有利于其在后期研究和临床应用中发挥更明显稳定的作用。本发明步骤简单，效果突出，对NK细胞预防癌症临床前研究具有一定意义。

技术研发人员：卢君君;马洁;赵刚;许蕊;詹举明
受保护的技术使用者：天津市康婷生物工程有限公司
技术研发日：2018.09.25
技术公布日：2019.03.01