optineurin蛋白在制备诊断和治疗急性肝损伤产品中的应用的制作方法

本发明属生物制药领域，涉及一种optineurin(optn)蛋白在制备诊断和治疗急性肝损伤产品中的应用。

背景技术：

急性肝损伤是指患者在无慢性肝病基础上，由各种病因引起肝脏细胞的损伤。引起肝急性损伤的原因很多，主要有病毒感染、用药不当、乙醇摄入过多等。大多数患者肝脏能保持主要功能得到正常运行，临床上轻者表现为血清转氨酶、胆红素升高；严重者可发生肝衰竭、凝血功能障碍和肝性脑病等。急性肝功能衰竭是具有挑战性的医学急症，需积极治疗。

optineurin(optn)蛋白是由optn基因编码，目前临床上主要用于治疗原发性开角型青光眼(poag)、肌萎缩性侧索硬化症(als)等。研究报道指出，optineurin与腺病毒e3-14.7k蛋白相互作用，可以利用tnfα或fas配体途径介导凋亡，炎症或血管收缩。通过其与rab8，亨廷顿蛋白和转录因子iiia蛋白的相互作用，optineurin也可能在细胞形态发生和膜运输，囊泡运输和转录激活中起作用，但至今尚没有其对急性肝损伤作用的报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种optn蛋白在制备诊断和治疗急性肝损伤产品中的应用，所述optn蛋白的核苷酸序列如seqno.7所示。所述诊断类急性肝损伤的产品包括：rt-pcr产品、免疫检测试剂等产品。所述治疗急性肝损伤的产品包括：用于激活optn的双链核糖核酸药物、改构病毒类药物、多肽类药物、用于激活optn蛋白功能的小分子化合物。

在本发明中，所述用免疫检测诊断急性肝损伤的产品包括：与optn蛋白特异性结合的抗体。

所述rt-pcr诊断急性肝损伤的产品至少包括一对特异性扩增optn基因的引物：

正向引物1：5’-gaaagagcagcgagagagaaa-3’(seqno.1)，

反向引物1：5’-ctccgtcttcgaaagcatca-3’(seqno.2)；

或正向引物2：5’-gggagcacagagaaagagaatg-3’(seqno.3)，

反向引物2：5’-agcctcttgaagctccttaaac-3’(seqno.4)；

或正向引物3：5’-cctaagggaagggaatcagaag-3’(seqno.5)，

反向引物3：5’-cctctgtctgggtttcaatct-3’(seqno.6)。

所述治疗急性肝损伤的药物包括：通过rna激活optn基因表达的双链核糖核酸药物；optn病毒(过表达)或者其改构病毒，或含有该optn氨基酸序列(seqno.8)的多肽类药物或其磷酸化、核糖基化、乙酰化、酰胺化等修饰的多肽类药物。在本发明中，可以使用一系列本领域已知的方法来制备针对optn蛋白的激动剂。筛选天然化合物库得到用于激活optn蛋白功能的的小分子化合物——如补骨脂二氢黄酮甲醚或其结构改造所得化合物。

本发明的另一个目的是提供一种optn蛋白在通过自噬调节巨噬细胞极化缓解急性肝损伤的机制研究中的应用。

optn蛋白是由optn基因(genebankno.nm_001008211.1)编码而来，optn基因的序列如seqno.7所示，该optn基因编码含有丝氨酸蛋白的神经丝蛋白，目前被报道与原发性开角型青光眼(poag)、肌萎缩性侧索硬化症(als)等疾病相关。也有研究报道optn参与肝癌的发生发展，但optn蛋白能否作为急性肝损伤的标记分子和治疗靶点尚无研究报道。本发明实验证明小鼠中敲除(过表达)optn蛋白可显著增加(降低)急性肝损伤的严重程度；同时，optn蛋白是通过自噬调节巨噬细胞极化来缓解急性肝损伤的发生发展；同时，天然化合物补骨脂二氢黄酮甲醚可以在体外激动optn，并减少对乙酰氨基酚引起的急性肝损伤。因此，optn蛋白可作为急性肝损伤诊断和治疗的特异性标志蛋白，提高急性肝损伤诊断的准确性和治疗的有效性。本发明optn蛋白为防治急性肝损伤提供了新的治疗靶标和有效新药。

附图说明

图1为westernblot、rt-pcr检测optn在小鼠急性肝损伤中的表达水平。

图2为检测optn^-/-小鼠对急性肝损伤的严重程度的影响。

图3为westernblot检测急性肝损伤小鼠中自噬水平的变化。

图4为流式细胞术检测optn对小鼠骨髓来源性巨噬细胞(bmdm)极化的影响。

图5为realtimepcr检测lps刺激下，optn对小鼠kupffercell极化的影响。

图6为注射optn病毒(过表达)小鼠对急性肝损伤的严重程度的影响。

图7检测补骨脂二氢黄酮甲醚对急性肝损伤的严重程度的影响。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：

取wt小鼠，腹腔注射500mg/kg对乙酰氨基酚或者200mg/kg的den后，在0、6、12、24、48小时取血清，血液生化学检测alt、ast，并westernblot及rt-pcr法检测optn的表达情况。图1结果显示，随着进行肝损伤的发生，optn表达有所上升，在肝损伤恢复后，optn表达回到正常水平。

实施例2：

取wt和optn^-/-小鼠，腹腔注射500mg/kg对乙酰氨基酚后，在0、6、12、24、48小时取血清，血液生化学检测alt、ast，并用10％甲醛溶液固定肝脏组织7天，随后制备石蜡包埋的组织块。将样本制备厚度为8微米的石蜡切片，进行h&e染色。图2结果显示，optn缺失明显加重急性肝损伤的严重程度。

实施例3：

取实施例1中的样本，westernblot法检测自噬相关蛋白lc3和p62的表达情况。图3结果显示，随着肝损伤的发生，自噬被激活。

实施例4：

提取wt和optn^-/-小鼠的骨髓来源性巨噬细胞(bmdm)后，分别给或不给lps/il4刺激，24小时后收取细胞，流式细胞术染f4/80和cd86或cd206，检测巨噬细胞极化情况。图4结果显示，optn缺失可以促进巨噬细胞的m1型极化。

实施例5：

提取wt和optn^-/-小鼠的肝脏巨噬细胞——kupffercell(kc)后，给予lps刺激，24小时后收取细胞，realtimepcr检测细胞极化情况。图5结果显示，optn缺失可以促进kc向m1极化。

实施例6：

wt小鼠尾静脉注射1.2*10⁷optn过表达慢病毒，并设置空白对照组(注射pcdh空载慢病毒)，5天后，腹腔注射500mg/kg对乙酰氨基酚，在0、6、12小时取血清，血液生化学检测alt、ast。图6结果显示，给予optn过表达病毒后，可以减弱apap造成的急性肝损伤。

实施例7：

l02细胞给予400、80、16μm补骨脂二氢黄酮甲醚后，westernblot法检测optn表达情况。l02细胞给予apap、apap和补骨脂二氢黄酮甲醚(400、80、16μm)后，srb法检测细胞存活率。图7结果显示，补骨脂二氢黄酮甲醚可以激活optn，同时增加细胞存活率。

序列表

<110>浙江大学

<120>optineurin蛋白在制备诊断和治疗急性肝损伤产品中的应用

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