一种复合磁性纳米光敏剂的制备方法与流程

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种复合磁性纳米光敏剂的制备方法及应用。

背景技术：

光动力学(photodynamictherapy，pdt)利用一定波长的光源照射光敏剂，被激发的光敏剂与氧分子作用产生以单线态氧(singletoxygen)为主的活性氧簇(reactiveoxygenspecies，ros)，从而对细胞产生毒性作用。光动力学是一种有效的，非侵入性的肿瘤杀伤手段。但是在其进入临床应用的30多年里，光动力学始终不能成为肿瘤杀伤的主要手段(除了浅表皮肤癌之外)，仅仅作为姑息杀伤或者其它杀伤方法的辅助，主要原因在于其杀伤肿瘤组织的局限性和逐渐显露的不良反应。无论激光直接照射还是使用光导纤维，激发光在肿瘤组织中都存在分布不均，多数光敏剂也缺乏肿瘤特异性，因此pdt最常见的并发症是中空脏器的穿孔和萎缩。由于受到体内穿透深度限制，外源照射光线很难到达人体的深部组织，所以pdt很难用于深部肿瘤的治疗。

为了解决激发光线在组织中穿透深度有限和分布不均的问题，目前很多基础研究者在尝试通过荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer,fret)的方式使光敏剂间接被激发。荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近(小于10nm)且光谱重合时,供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移(即发生能量共振转移)。已有很多文献报道，将光敏剂与另一种荧光材料连接，光敏剂作为能量的受体，与之结合的荧光物质作为能量的供体，通过激发作为供体的荧光物质间接激活作为受体的光敏剂，从而产生光动力学效应，以fret的方式杀伤深部肿瘤。在这些研究中的供体荧光物质有碳纳米点、上转换发光材料、酯溶性菁染料和量子点等，它们都可以被波长较长的激发光所激发，所以可以极大地提高激发光线的组织穿透深度。此外，光敏剂通过与纳米粒子的结合，可以提高其在肿瘤组织中的分布浓度，从而提高肿瘤细胞杀伤的靶向性。

但是这些光动力学方法依然需要外源光线的激发，如果可以使用细胞内产生的内源性光线激发光敏剂，则可以实现任何深度、任何部位肿瘤的光动力学杀伤。早在上个世纪90年代，研究者就开始尝试使用生物发光的能量，或者化学发光的能量作为内照射的光源，来激发光敏剂产生光动力学效应。1994年,carpenter等人报道了他们使用生物发光的能量直接激活光敏剂金丝桃素(hypericin)用于抗病毒治疗的研究成果。在2003年，theodossiou等报道，用细胞内源产生的虫荧光素酶发出的生物发光可以直接激活光敏剂二碘曙红(rosebenga)，对细胞产生光动力学效应。但是他们的研究却遭到了美国学者schipper博士的质疑，他在2006年的报道中用大量的试验结果证明，细胞内生物发光的能量并不足以通过辐射的方式直接激活光敏剂二碘曙红或者金丝桃素，不能对细胞产生光动力学效应。此后的多年时间内，很少有研究者涉足使用生物发光能量激活光敏剂的研究领域，这使不依赖外源激发光的光动力学杀伤肿瘤的设想无法落实。

直到2012年，才有yuan等报道荧光材料阳离子齐聚苯乙烯撑(cationicoligophenylenevinylene,opv)可以通过生物发光能量转移的方式(bioluminescenceresonanceenergytransfer，bret)被激活，产生光动力学效应用于抗肿瘤和抗真菌。2013年，hsu等报道了一种自发光引发光动力学效应用于肿瘤治疗的方法，在其研究中，蛋白质海肾荧光素酶与量子点qd655进行共价结合形成纳米颗粒(qd-rlu8)，然后与含有光敏剂替莫泊芬(foscan)的胶体束一同被肿瘤细胞吞噬，加入底物腔肠素以后，检测到细胞内产生活性氧，并通过体内外抑瘤试验证明了光动力学产生的肿瘤治疗效应，研究者指出，由于qd-rlu8和含有光敏剂的胶体束在细胞共同吞噬的过程中有很大的机会并存于同一个吞噬小体内，二者之间距离小于10nm的机会很多，因此，会产生fret效应，加入腔肠素以后，生物发光的能量通过bret传递给量子点，又通过fret传递给光敏剂，因此实现了不依赖外源激发光的光动力学治疗效应。2014年，zhang等又在《analyticalchemistry》上报道了他们使用化学发光激活光敏剂的研究结果，具有重合光谱的光敏剂和半导体荧光材料被疏水基质包裹后形成纳米小体，表面连接辣根过氧化物酶，加入底物鲁米诺以后产生化学发光能量共振转移(chemiluminescencresonanceenergytransfer，cret)激活荧光物质，又通过fret激活光敏剂，两次能量共振转移实现生物发光能量激发的光动力学治疗。以上这些研究的共同特点是通过bret(cret)-fret连续的能量转移方式间接激发光敏剂，从而利用内源性的生物发光(或者化学发光)产生光动力学效应。但是在这些研究中，作为pdt能量来源的生物发光并不具备组织特异性，其主要的制约因素在于，为了满足能量共振转移的条件，产生生物发光的荧光素酶通常需要和能量的受体以共价键的方式结合在一起，而不能在肿瘤细胞内特异性表达。若能通过在基因转录水平的调控，使作为pdt内源照射光的荧光素酶仅在肝癌细胞内表达，则可以实现不需要外源激发光的、没有组织深度限制的，具有高度肝癌靶向性的光动力学治疗得以实现。

技术实现要素：

技术问题：本发明提供一种利用细胞内特异性的生物发光作为内照射光源，在肿瘤细胞内产生光动力学效应同时可进行磁流体加热的复合磁性纳米光敏剂的制备方法。

技术方案：本发明的复合磁性纳米光敏剂的制备方法，包括下述步骤：

步骤1：制备fe304磁性纳米颗粒：将fecl3和fecl2置于纯水反应体系中，45-55℃，ph9.5±0.1，n2保护下反应20-40分钟，得到fe3o4磁性纳米颗粒；

步骤2：正硅酸乙酯改性fe3o4：将fe3o4磁性纳米颗粒和纯水以质量比1：150-1：200混合，超声分散成胶体溶液，加入占反应体系体积1/100的氨水和占反应体系体积1/100的正硅酸乙酯，45-55℃搅拌反应10-12小时，在磁性纳米颗粒表面生成一层二氧化硅，得到fe3o4@sio2；

步骤3：cdte量子点颗粒的制备：在通入n2气的条件下，将硼氢化钠：碲：纯水混合，冰浴反应至黑色te粉完全消失，得到的上层淡紫色透明液体即为碲氢化钠；在ph9.0±0.1的纯水反应体系中，n2保护，以巯基丙酸作为稳定剂，磁力搅拌下，加入cdcl2和碲氢化钠，升温至95-100℃，向反应体系中通入n2气并保持95-100℃，磁力搅拌反应16至18个小时，得到红色的水溶性cdte胶体溶液；

步骤4：fe3o4@sio2@qdots/ps的制备：将二血卟啉醚水溶液和cdte胶体溶液混合，搅拌下逐滴加至浓度为0.1mg/ml的fe3o4@sio2溶液中，其中二血卟啉醚：cdte：fe3o4@sio2质量比为1：0.5：0.5至1：2：2，持续通入n2气，室温下搅拌反应过夜，超速离心沉淀纳米颗粒，纯水重新悬浮后洗涤数次，得到fe3o4@sio2@qdots/ps磁性纳米光敏剂。

其中，所述步骤1中fecl3和fecl2质量比为2：3至6：3。

所述步骤(3)3中硼氢化钠：碲：纯水按照摩尔比2：1：0.5混合。

所述步骤3中升温至100℃后，将反应产生的水蒸气通过冷凝管凝结回流。

所述步骤步骤3)中cdcl2:cd²⁺:巯基丙酸的摩尔比为0.5：0.5：1.2至0.5：2：4.8。

所述步骤4中二血卟啉醚水溶液中二血卟啉醚：纯水质量比为1：8-1：12，所述cdte胶体溶液中cdte：纯水质量比为1：8-1：12，二血卟啉醚和cdte的质量比为1：0.5至1：2。

有益效果：本发明与现有技术相比，具有以下优点：

有更好的组织特异性：光动力杀伤的基础是光动力学效应，是一种氧分子参与的伴随生物效应的光敏化反应，光敏剂、光照射和氧分子构成光动力效应的三要素。使肿瘤组织内的三态氧变为大量有毒的单态氧、羟基团和过氧化基团等，造成细胞中线粒体、溶酶体等细胞器的肿胀，及核膜、细胞膜的破坏，导致肿瘤细胞死亡，从而达到杀伤和控制肿瘤进展的目的。但是光动力学杀伤也有很大的局限性，主要表现表现在第一：目前常用的光敏剂主要是卟啉衍生物，这些分子对肿瘤组织缺乏靶向性，在病灶难以富集达到有效浓度，影响效果；第二：光敏剂分子多为疏水性分子，易团聚，在体内不易传输到病灶；第三：理论上光动力疗法适用于所有肿瘤的治疗，但目前主要用于体表恶性肿瘤、食管癌、胃肠道肿瘤、口腔肿瘤、膀胱癌等的治疗。这主要因为是光敏剂在吸收可见光的条件下才能产生光动力学效应，而可见光在人体组织的穿透能力较差，不能深入到组织内部，多局限于表皮或浅组织区域的肿瘤部位；第四：光动力学的光线在组织和细胞中存在分布不均匀，即使使用光导纤维也不能非常精确的控制光动力学杀伤的范围，容易造成中空脏器的穿孔和萎缩。以上这些缺点极大地限制了光动力学在肿瘤治疗中的应用。而本发明通过将量子点和光敏剂制备在纳米微粒中，利用量子点作为中间介质，将肿瘤细胞内自发光能量通过fuel-fret的方式进行传递，激发光敏剂。对于没有生物发光的细胞不产生杀伤作用，避免了很多传统pdt的副作用，并且不受组织深度的限制，可以实现任何深度、任何部位肿瘤的光动力学治疗。

光动力治疗联合磁流体热疗，具有协同杀伤作用，提高了肿瘤治疗的有效性。光动力学治疗的效果在很大程度上还取决于组织中的氧分子浓度，而由于肿瘤细胞增殖过快，肿瘤新生血管结构紊乱，瘤体内血供不能满足需要，多数实体肿瘤直径超过2mm(包括肝癌内)就会处于缺氧状态，引起pdt疗效下降。过热疗法(hyperthermia)可以提高局部血供、提高血管通透性、促进组织对氧分子的吸收，从而改善肿瘤的乏氧状态，增加pdt的疗效，热疗联合光动力学治疗将对肿瘤的抑制产生协同作用。磁性纳米颗粒(magneticnanoparticles,mnps)在外加交变磁场(alternatingmagneticfield，amf)中能进行可控升温，使局部温度达到41℃～46℃，使肿瘤细胞受热凋亡，即磁流体热疗(magneticfluidhyperthermia，mfh)技术。mfh在肿瘤治疗中的应用价值已经受到广泛的重视，mfh能通过磁场定位有效的将mnps聚集在肿瘤部位实现靶向热疗，减少对正常组织的损伤；肿瘤细胞对纳米颗粒的摄取能力是正常细胞的8-400倍，被细胞内吞的mnps在交变磁场中可以对肿瘤细胞进行“细胞内热疗”，提高热疗的有效性并避免加热不均。本发明将pdt和磁流体热疗结合起来，协同作用于肿瘤细胞，可以提高治疗的有效性。

附图说明

图1是fe3o4@sio2@qdots/ps复合磁性纳米光敏剂的制备示意图。

图2是fe3o4@sio2@cdte/ps磁性纳米颗粒复合体透射电镜图量子点透射电镜图。

图3是fe3o4@sio2@cdte/ps纳米粒子介导发光细胞内产生ros。

图4是内照射光动力学杀伤组细胞光显微镜成像，用于下检测dcf荧光。

图5是各组细胞内caspase3的活性，*与第一组阴性对照相比，差值没有统计学意义，p>0.05，n＝10；

**与第一组阴性对照组相比，差异有统计学意义p<0.05，n＝10。

图6是各组细胞mtt试验的吸光度值。*与第一组阴性对照相比，差值没有统计学意义，p>0.05，n＝10；**与第一组阴性对照组相比，差异有统计学意义p<0.05，n＝10。

图7是光动力杀伤组透射电镜下细胞结构，电镜下细胞显示典型凋亡形态。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步具体说明。

本发明的主要步骤包括：

(1)fe3o4@sio2@qdots/ps复合纳米颗粒的制备：共沉淀法制备四氧化三铁磁性纳米颗粒fe3o4，在其表面包覆一薄层二氧化硅形成fe3o4@sio2；选择发射波长为630nm的量子点(qdots)和吸收波长为630nm的光敏剂二血卟啉醚(ps)，通过吸附作用装配于fe3o4@sio2表面，将光敏剂二血卟啉醚用理盐水溶解，配置成0.1mg/ml，与cdte胶体溶液(0.1mg/ml)混合，缓慢滴入fe3o4@sio2(0.1mg/ml)溶液中，通入n2气室温下搅拌反应过夜，1×10⁶rpm超速离心沉淀fe3o4@sio2@qdots/ps纳米颗粒，纯水重新悬浮后洗涤数次。

(2)利用肿瘤细胞特异性生物发光对其进行内照射光动力学杀伤：随着分子生物学的发展，大量肿瘤特异性启动子被发现，以肝癌为例，使用甲胎蛋白启动子引导下游虫荧光素酶基因的表达，构建重组基因pafp-luc，转染肿瘤细胞后，复合纳米颗粒以1mg/ml浓度和转染细胞共孵育过夜，加入底物荧光素，细胞产生特异性生物发光，以fuel方式激发量子点，继而通过fret激发纳米颗粒中的光敏剂，产生ros，对细胞进行光动力学杀伤。

(3)联合磁流体热疗：将细胞(动物)置于交变磁场中，纳米颗粒的磁性核心在磁场中升温至41℃以上，对肿瘤进行磁流体热疗，与光动力学疗法协同杀伤肿瘤细胞。

本发明方法将光敏剂和磁性颗粒构建在同一纳米体系中，利用细胞内自发光能量激发光敏剂产生活性氧簇，并能在交变磁场中可控升温。在本发明中，实现了特异性内照射两个关键问题的解决，第一，荧光素酶基因在肝癌细胞的特异性表达，运用甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，afp)启动子引导下游虫荧光素酶基因(luciferase)靶向性在肝癌细胞内表达；第二，细胞内表达的荧光素酶能激发光敏剂。量子点被荧光激发不需要受限于其与光供体之间的距离，可以被宏观的能量辐射方式激发，也就是“非结合的生物发光激发荧光”(fluorescencebyunboundexcitationfromluminescence，fuel)。选择发射波长与激发波长重叠的量子点和光敏剂构建纳米颗粒，在粒径为50nm左右的颗粒中，二者间有足够的机会满足小于10nm的距离的条件，从而满足fret的条件激发光敏剂，从而实现利用细胞内特异性生物发光作为内照射能量对肿瘤进行光动力学杀伤。本发明利用磁性纳米颗粒作为核心，可以在光动力学杀伤的同时进行肿瘤细胞磁流体热疗，二者起到协同作用加强对肿瘤细胞的杀伤作用。

本发明的实施例中，选择afp阳性的肝癌细胞株hepg2，验证肝癌细胞中介导特异性内照射pdt联合磁流体加热。

1、制备afp启动子介导的虫荧光素酶基因重组载体并转染肝癌细胞hepg2：

afp启动子序列参考自invivogen公司，合成序列如下：

acgcgtcctgcagtttgaggagaatatttgttatatttgcaaaataaaataagtttgcaagttttttttttctgccccaaagagctctgtgtccttgaacataaaatacaaataaccgctatgctgttaattattggcaaatgtcccattttcaacctaaggaaataccataaagtaacagatataccaacaaaaggttactagttaacaggcattgcctgaaaagagtataaaagaatttcagcatgattttccatattgtgcttccaccactgccaataacaccaagctt

将质粒含有afp启动子序列下游连接虫荧光素酶基因luciferase(luc)，构建重组表达载体pafp-luc。重组载体酶切鉴定见图1。以商品化试剂将pafp-luc转染至hepg2细胞，转染后48h加入底物d-luciferin，在活体成像仪中观察细胞中报告基因的表达。

2.fe3o4@sio2@cdte/ps纳米粒子介导的生物发光细胞hepg2的光动力杀伤。将转染后生物发光细胞分为以下三组：

(1)未处理阴性对照组细胞。

(2)底物d-luciferin对照组：细胞培养物加入d-荧光素工作液(150μg/ml)，一天后换为细胞培养液。

(3)光动力学杀伤组：fe3o4@sio2@cdte/ps纳米粒子以1mg/ml浓度与细胞共孵育过夜后去除上清液，细胞用缓冲液清洗三次后加入d-荧光素工作液(150μg/ml)，一天后换为细胞培养液。

每组细胞操作均设有10个平行操作孔，所有分组细胞的全部操作过程均在避光的条件下操作，孵育时细胞用铝箔纸完全包裹后置于培养箱内，72小时以后用活性氧(reactiveoxygenspecies，ros)检测探针检测所有分组细胞内产生的活性氧簇，活性氧探针是一种荧光探针前体dcfh-da，dcfh-da本身没有荧光，可自由穿过细胞膜，进入细胞内后，被细胞内的酯酶水解生成dcfh。dcfh不能通透细胞膜，而在细胞内聚集。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的dcfh生成有荧光的dcf。荧光显微镜下检测dcf的荧光可以代表细胞内活性氧的水平(图3，4)，光动力杀伤组利用细胞内自发荧光激发光敏剂，产生大量的活性氧簇(ros)。为反映细胞的凋亡情况，用caspase3测定试剂盒检测各组细胞内半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinylaspartatespecificproteinase)caspase3的活性(图5)，可见光动力杀伤组细胞中caspase3表达上升；同时用mtt试验分别检测各个分组细胞的增殖情况(图6)，光动力杀伤组细胞增值率下降。透射电镜下观察pdt组亚细胞结构的改变(图7)，表现为典型的凋亡形态：细胞膜形态尚完整，而正常的线粒体结构消失，细胞核内染色质浓集边聚。以上结果证实本发明可利用细胞内生物发光作为内照射光源，激发光敏剂，从而对细胞进行光动力学杀伤效应。

3.fe3o4@sio2@cdte/ps纳米粒子介导的生物发光细胞hepg2的光动力杀伤和磁流体热疗的联合杀伤。将转染后生物发光细胞分为以下三组：

(1)光动力学杀伤组：fe3o4@sio2@cdte/ps纳米粒子以1mg/ml浓度与细胞共孵育过夜后去除上清液，细胞用缓冲液清洗三次后加入d-荧光素工作液(150μg/ml)，一天后换为细胞培养液。

(2)磁流体热疗组：fe3o4@sio2@cdte/ps纳米粒子以1mg/ml浓度与细胞共孵育过夜后去除上清液，将细胞置于交变磁场(频率f＝230khz,电流i＝30a)内热疗60分钟。

(3)内照射光动力杀伤于磁流体热疗联合杀伤组：fe3o4@sio2@cdte/ps纳米粒子以1mg/ml浓度与细胞共孵育过夜后去除上清液，细胞用缓冲液清洗三次后加入d-荧光素工作液(150μg/ml)，一天后换为细胞培养液，然后将细胞置于交变磁场(频率f＝230khz,电流i＝30a)内热疗60分钟。

以上三组细胞全部操作过程在避光条件下进行，每组细胞操作均设有10个平行操作孔。细胞避光培养。5天后，所有细胞用mtt试验检测细胞增殖率(表1)。可见pdt和磁流体热疗联合杀伤组对细胞有最大的增殖抑制率。

表1杀伤分组mtt试验细胞吸光度及增值抑制率